ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
До недавнего времени, исследования кальциевой активности астроцитов были сфокусированы на измерениях в соме и основных отростках клетки, что было продиктовано ограничениями доступных флуоресцентных красителей. В последнее время, благодаря совершенствованию генетически кодируемых кальциевых репортеров, основное внимание сместилось в сторону исследования субклеточных паттернов кальциевой сигнализации, в первую очередь, в тонких отростках астроцитов. Это оправдано тем, что именно в тонких отростках наблюдается наиболее разнообразная и сложная кальциевая активность, а также тем, что именно тонкие отростки астроцитов входят в тесный контакт с синаптическими контактами между нейронами, при этом есть данные о том, что астроциты принимают важнейшее участие в механизмах синаптической пластичности. Вместе с тем, коллективная активность астроцитов с субклеточным разрешением, и возможность наличия закономерностей и устойчивых паттернов такой активности на разных пространственных и временных масштабах исследованы пока недостаточно, хотя известно, что астроциты участвуют в синхронизации локальной нейрональной активности и задействованы в механизмах формирования памяти. В данном проекте мы стремимся создать теоретическую основу и практические методы для изучения и понимания роли сетевых взаимодействий в кальциевой сигнализации астроцитов и ее взаимосвязи с локальной нейрональной активностью и функционированием синапсов.
Until recently, the studies of astrocytic calcium activity have been focused on measuring in the soma and primary branches of the cell, which was due to the constraints of available fluorescent indicators. Now, however, thanks to advances in genetically encoded calcium indicators, the main focus has shifted to investigation of subcellular patterns of calcium signaling, primarily in the fine astrocytic processes. This is justified by the observation that calcium activity is the richest and most diverse in the fine processes, and that the fine processes intimately contact synapses between neurons where, as evidence suggests, they play an important role in synaptic plasticity At the same time, the collective activity of astrocytes at subcellular resolution as well as a possibility for consistent recurring patterns of activity at different spatial and temporal scales are not studied well enough. However, it is known that astrocytes are at least in part responsible for synchronization of neuronal activity and are involved in memory consolidation. In this project, we aim to build a theoretical platform and develop practical methods for studying and understanding of the role of network interactions in the astrocytic calcium signalling and its involvement in neuronal and synaptic activity
В ходе реализации Научного проекта мы планируем получить следующие результаты: (1) Будет разработан набор алгоритмов и их имплементаций, предназначенных для предобработки данных динамической флуоресцентной микроскопии и анализа кальциевой активности в сетях астроцитов. Набор методов будет представлен в виде программных модулей с открытым исходным кодом, которые смогут быть свободно использованы и другими научными коллективами. (I этап) (2) Будут разработаны морфологические метрики для оценки пространственной сложности строения астроцитов и эффективный алгоритм для их вычисления. На основании предложенных метрик будет охарактеризована морфология астроцитов в норме, в ходе онтогенеза и на фоне развития патологии. (I этап) (3) Мы ожидаем, что сможем сделать существенный вклад в развитие метода разложения на динамические моды, обобщив его на события с распространяющимися волнами и спайковым характером активности. (I-II этапы) (4) Будут получены основные характеристики как локальных, так и сетевых мод кальциевой динамики в ансамблях астроцитов: будут даны оценки распределений для размеров и длительностей отдельных кальциевых событий, параметры временных корреляций локальной динамики, исследованы повторяющиеся паттерны и последовательности активации субклеточных пространственных доменов и целых клеток. (I-II этапы) (5) Будут получены и охарактеризованы основные сценарии перехода от разрозненной локальной кальциевой сигнализации в астроцитах на уровне субклеточных структур к коллективной, сетевой активности. Будет выявлена роль морфологии астроцитов в возникновении устойчивых паттернов коллективной активности. (II этап) (6) Будут разработаны статистические и механизменные пространственно детализированные математические модели кальциевой динамики в астроцитах и ее взаимосвязи с локальной синаптической активности в нейрональной подсети. (II-III этапы) (7) В эксперименте и на основе моделей будет исследовано влияние нейрональной активности, в том числе, синаптической, на пространственно-временные паттерны активности астроцитов. Будет произведено сравнение коллективной активности астроцитов на фоне спонтанной и вызванной нейрональной активности, а также эпилептической активности нейрональной сети. (III этап). Разработанные модели и алгоритмы будут доступны в виде программ с открытым исходным кодом, что послужит платформой для последующей стандартизации подходов к анализу и интерпретации морфологии астроцитов и их кальциевой активности и в других лабораториях и научных коллективах.
Коллектив обладает опытом использования основных предлагаемых методов и подходов, в частности, применения многомасштабных преобразований для детекции и реконструкции кальциевых волн в астроцитах мозжечка и коры in vivo, характеризации разветвленных пространственных структур (на примере сосудистой сети глазного дна), моделирования кальциевой активности в астроцитах. Руководитель проекта имеет опыт анализа данных флуоресцентной микроскопии мозжечка и коры in vivo в сотрудничестве с экспериментальной лабораторией M. Lauritzen (Копенгагенский университет, Дания) и исследования синхронизации локальных колебаний кровотока в поверхностных нейронах почки в лаборатории N.-H. von Holstein-Rathlou (Копенгагенский университет, Дания). На настоящий момент налажен обмен экспериментальными данными с лабораторией А.В. Семьянова, являющегося руководителем Комплексного проекта. Проведены предварительные эксперименты и проделана предварительная обработка данных, показывающая возможность выделения и дальнейшего анализа событий кальциевой сигнализации астроцитов на этих данных. Руководитель и основные участники проекта имеют опыт самостоятельной имплементации вычислительных алгоритмов обработки сигналов и изображений, использования параллельных вычислений. Предварительные результаты по конструированию пространственных паттернов сетей астроцитов на основе экспериментальных изображений и моделированию кальциевой активности на таких паттернах представлялись на конференциях Neuroinformatics 2016 (Москва) и FENS 2016 (Копенгаген).
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 26 октября 2017 г.-26 октября 2018 г. | Пространственно-временные паттерны коллективной кальциевой динамики в сети астроцитов в норме и при патологии |
Результаты этапа: = Предобработка видеоизображений: компенсация артефактов движения = В ходе выполнения проекта был разработан новый алгоритм совмещения изображений для коррекции артефактов движения в данных кальциевого имаджинга. Алгоритм основан на уравнении оптического потока, u*dI/dx + v*dI/dy = − dI/dt (здесь * означает поэлементное умножение), и разреженном представлении компонентов векторного поля смещения изображения u и v в некотором базисе D: u = Dα, v = Dβ, где α и β — вектора коэффициентов разложения, содержащие небольшое количество ненулевых элементов. Таким образом, решается следующая оптимизационная задача: argmin [∥Dα*(dI/dx) + Dβ*(dI/dy) + dI/dt∥2 + ε(∥α∥1 + ∥β∥1)] (1). Добавление стабилизатора в виде суммы L1-норм для α и β пенализирует количество ненулевых элементов в них. В качестве тестового использовался базис дискретного косинусного преобразования (DCT), который можно считать приближением оптимального. Оптимальный базис можно было бы получить на основании анализа векторных полей получаемых другими методами, на тренировочных наборах данных. Базис дискретного косинусного преобразования был сгруппирован по пространственным частотам, и поиск коэффициентов α и β производился в “жадной” манере, когда сначала подбирались коэффициенты при более низких частотах, начиная с простых трансляций изображения, а коэффициенты при более высоких пространственных частотах подбирались для оптимизации остаточных невязок. Ограничение количества ненулевых коэффициентов в α и β производилось путем итеративного перевзвешивания элементов в D(dI/dx) и D(dI/dy). Разработанный метод был протестирован на экспериментальных данных кальциевого имаджинга in vivo и in situ, где показал визуально качественную компенсацию артефактов движения, а также на тестовых данных, где изображения из реальных данных подвергались трансформациям при помощи известных полей сдвигов и оценивалась ошибка определения (u,v) как EPE (end point error, погрешность в концевой точке). На тестовых данных результаты применения существенно превосходили таковые для метода combined local-global optical flow [Bruhn et al 2005] (рис. 1 дополнительных материалов). В 75% случаев ошибка определения смещений изображения была менее 1 пикселя, а в 95% случаев ошибка определения смещений изображения была менее 2 пикселей. Кроме того, мы пришли к выводу, что использование полных изображений для решения такой задачи, во многих случаях достаточно гладкого поля смещений является избыточным. Это позволило нам прибегнуть к подходам compressed sensing (опознание со сжатием), в котором перед решением задачи оптимизации изображения dI/dx, dI/dy, dI/dt проецируются в более низкоразмерное представление при помощи сжимающей матрицы C: Ic = CI. Здесь I — изображение, развернутое в вектор-столбец (соответственно, это может быть dI/dx, dI/dy и dI/dt), а матрица C имеет размерность (n x Npx), где Npx — число пикселей в изображении, а n — размерность нового представления, n << Npx. Таким образом, задача оптимизации может решаться в значительно меньшей размерности. В качестве матрицы C может быть использована, например, матрица со случайными значениями, взятыми из Гауссовского распределения, но в более простом случае это могут быть значения {–1,0,1}, с определенной небольшой вероятностью ненулевых значений. В самом простом варианте матрица C может обеспечивать выбор случайных элементов из I и тогда нет необходимости в задавании ее в явном виде. Применение такого подхода позволило ускорить поиск оптимальных полей сдвига (u,v), однако требуется дальнейшая работа по оптимизации используемой сжимающей матрицы C. = Предобработка конфокальных изображений астроцитов при помощи нелинейной фильтрации и сегментация изображений для анализа по Шоллю = Для исследования пространственной структуры астроцитов было необходимо получать их детализированные изображения, содержащие информацию об особенностях морфологии данных клеток. Поскольку дальнейшие методы морфологического анализа рассчитаны на работу с двумерными (2D) изображениями, то получаемые в эксперименте 3D конфокальные стеки окрашенных астроцитов проецировались на плоскость (X,Y) с использованием проекции максимальных значений. Однако, при использовании необработанных изображений терялась часть деталей строения отростков астроцитов. Для преодоления этой проблемы мы использовали относительно новый метод нелинейной фильтрации, основанной на анизотропной диффузии (coherence-enhancing diffusion filtering, CEDF) [Weickert, Scharr 2002]. Данный метод применяется для подавления шума в микротомографических и конфокальных изображениях, но к изображениям астроцитов ранее не применялся. CEDF применяли для каждой Z-плоскости по-отдельности, а затем проводили максимальную проекцию на плоскость (X,Y). Сравнение проекций необработанного и обработанного Z-стека показано на рис. 2.A дополнительных материалов. Видно, что фильтрация позволяет более четко увидеть детализацию отростков клетки. Для анализа по Шоллю было необходимо произвести сегментацию изображения астроцитов, выделив отдельные отростки как объект, а все остальное как фон. Для сегментации был разработан следующий итеративный стохастический алгоритм: на каждой итерации анализируемое изображение смешивали с пространственно-некоррелированным гауссовским шумом со стандартным отклонением, несколько превышающим оценочное стандартное отклонение шума в исходном изображении; затем производили фильтрацию полученного изображения набором анизотропных фильтров с различной ориентацией, а также изотропным детализирующим фильтром (рис. 2B). Далее в каждой точке выбирали максимальный отклик из библиотеки анизотропных фильтров и производили автоматическую бинаризацию изображения, сохраняя координаты точек, которые превысили шум. То же делали и для изотропного фильтра. На выходе алгоритма получали карты вероятностей, что данный пиксель превышает шум при отклике на набор анизотропных фильтров или на изотропный фильтр. Произведение двух вероятностей давало финальное изображение, которое подвергалось бинаризации и дальнейшему анализу (рис. 3). Использование двух типов фильтров было необходимо, чтобы исключить попадание в финальную сегментацию ореолов вокруг точечных структур. Многократные итерации с использованием искусственно зашумленных изображений с последующим введением порога позволяли существенно увеличить соотношение сигнал-шум. Разработанный алгоритм уже начал использоваться в Комплексном проекте для анализа патологических изменений в морфологии астроцитов. = Оценка сложности и энтропии пространственных паттернов = Описанный выше анализ учитывает только хорошо различимые крупные отростки астроцитов. Для описания всего изображения астроцита целиком, включая и мелкие отростки, как текстуры, был специально разработан новый метод оценки сложности и энтропии для пространственных паттернов с использованием шеарлет-разложения (shearlexity). Опубликована методическая статья, описывающая этот метод, в журнале Physical Review E. Метод основан на представлении о том, что для пространственных структур можно ввести понятие энтропия, которое должно характеризовать отсутствие выделенных направлений или характерных масштабов в данном изображении, а также понятия “неравновесность” изображения, которое описывает, насколько сильно данное изображение отличается от максимально “энтропийного”, т.е. содержащего лишь пространственно нескоррелированный шум. При этом статистическая “нетривиальность” или “сложность” изображения оценивается как произведение относительной энтропии и “неравновесности” изображения. Таким образом, полностью упорядоченный пространственный паттерн, такой, как, например, решетка светлых и темных полос, будет обладать нулевой энтропией, высокой неравновесностью, но нулевой сложностью. Напротив, случай изображения без каких-либо пространственных корреляций будет обладать максимальной энтропией и нулевой сложностью. В разработанном нами методе локальная статистика мощности коэффициентов шеарлет-преобразования выступает в роли функции плотности распределения, для которой рассчитывается энтропия Шеннона и расхождение Йенсена–Шеннона между анализируемым и равновероятным распределением в качестве меры неравновесности (рис. 4 A-B). Выбор шеарлетов в качестве анализирующего преобразования обусловлен их ориентационной специфичностью, оптимальностью представления пространственных паттернов в этом базисе и наличием эффективной имплементации. Предложенный метод был протестирован на ряде модельных систем. Так, при постепенном зашумлении упорядоченного пространственного паттерна энтропия монотонно возрастает. При этом статистическая сложность паттерна близка к нулю вначале, проходит через максимум и возвращается к околонулевому значению по мере разрушения упорядоченной структуры. Необходимо отметить, что каждому значению пространственной энтропии может соответствовать определенный диапазон значений сложности. Хотя разрушение упорядоченной структуры и сопровождается временным повышением статистической сложности С, все значения С лежат около нижней границы допустимого диапазона и проходят через максимум при относительном значении энтропии H=0.5. В качестве второй тестовой системы выступала поверхность, генерируемая решеточной моделью Изинга при различных значениях температуры (рис. 5). В этой модели можно ожидать, что точка фазового перехода будет сопровождаться возникновением дальних корреляций в пространственной структуре. Действительно, при значении параметра температуры около фазового перехода наблюдалось резкое падение пространственной энтропии и увеличение пространственной сложности анализируемого изображения (рис. 5B). При этом дальнейший рост температуры сопровождался более плавным падением сложности и возрастанием энтропии, что объясняется существованием локальных “островков” с более упорядоченной структурой, общая площадь которых уменьшается с ростом температуры (рис. 5C). В данной модельной системе значения пространственной сложности уже близки к верхней допустимой границе значений сложности, особенно около точки фазового перехода в модели Изинга (рис. 5 D). Убедившись в работоспособности метода расчета пространственной энтропии и сложности на модельных изображениях, мы перешли к анализу реальных изображений астроцитов. На рис. 6 дополнительных материалов показан результат картирования пространственной энтропии и сложности для проекции максимальных значений обработанного при помощи нелинейной фильтрации конфокального изображения астроцита. Видно, что сам астроцит ассоциируется с пониженным значением энтропии и повышенным значением сложности, которое определяется как отдельными отростками, так и совокупностью всей структуры астроцита. Отложив на плоскости энтропия-сложность результаты для всех точек изображения, можно получить спектр энтропии-сложности для данного изображения. Видно, что точки, принадлежащие астроциту обладают меньшей энтропией и большей сложностью, чем точки, принадлежащие фону (рис. 6 B). Известно, что пространственная структура астроцитов, характерная для взрослых животных, устанавливается в течение первых нескольких недель. Используя конфокальные изображения астроцитов крыс возраста 1, 3 и 4 недели из открытых источников (http://www.cellimagelibrary.org/home), мы проанализировали изменение параметров энтропии и сложности пространственных доменов астроцитов по мере их развития. В целом, пространственные паттерны, образуемые клетками для всех трех возрастных групп характеризовались высоким значением энтропии и сложности. При этом клетки из возрастной группы 1 неделя характеризовались минимальной энтропией и максимальной сложностью, что связано с обилием одиночных длинных отростков. Для 3-х недельного возраста наблюдалось повышение энтропии и понижение сложности морфологии астроцитов, что можно связать с появлением обилия мелких отростков, заполняющих будущий пространственный домен астроцита. Дальнейшее же созревание клеток сопровождалось снижением энтропии и повышением статистической сложности что, по-видимому, связано с установлением более сложной иерархической структуры в размерах отдельных отростков и появлением довольно длинных отростков относительно небольшого диаметра. Таким образом, установление пространственных доменов и зрелой морфологии нормальных астроцитов сопровождается немонотонным изменением их энтропии и сложности. Анализ данных, полученных в ходе выполнения сестринского проекта КОМФИ под руководством А. В. Семьянова показал и наличие изменений в пространствненой структуре астроцитов при развитии эпилепсии. По сравнению с контролем, астроциты эпилептических животных обладали большей энтропией и несколько большей сложностью, что отражает патологию в морфологии астроцитов при эпилепсии, характеризующуюся нарушением нормальных масштабных соотношений отростков разного порядка, разупорядочиванием их взаимного расположения. = Использование метода DMD для анализа кальциевой динамики = В рамках проекта исследовалась возможность применения метода разложения на динамические моды для анализа кальциевой динамики в астроцитах. В частности, занимались решением проблемы описания нелинейных осцилляторов со спайковым характером активности. В результате были сделаны следующие выводы: - Для адекватного приближения динамики осцилляторов с сильно нелинейной формой необходимо использование координат с задержкой, охватывающих как минимум несколько периодов, т.е. весьма высокоразмерное представление. Отчасти, это связано с тем, что такие колебания неоптимально приближаются сингулярным разложением, которое лежит в основе метода DMD. - Использование нелинейных “измеряющих функций состояния”, например логарифмирование данных, позволяет улучшить работоспособность метода. - Тем не менее, метод DMD, хотя и с трудом позволяет описать саму форму отдельных спайков, корректно передает информацию о частоте и фазовой задержке наблюдаемых колебаний. Это дает возможность автоматической классификации и кластеризации осцилляторов с одновременно регистрируемой динамикой на синхронизованные группы и позволяет установить взаимные фазовые задержки между осцилляторами в пределах группы. = Статистическая модель кальциевой динамики в астроцитах = В ходе выполнения первого этапа проекта разработана упрощенная статистическая модель кальциевой динамики в астроцитах (рис. 8 дополнительных материалов). В этой распределенной модели динамика концентрации кальция в каждой точке описывается как авторегрессионный процесс первого порядка с переменным коэффициентом α с добавлением диффузионного обмена между соседними точками. В точках, соответствующих соме и крупным отросткам астроцита, коэффициент авторегрессионного процесса определяется марковской переменной, которая совершает переходы между неактивным, активным и инактивированным состояниями. Если переменная находится в активном состоянии, локальный коэффициент авторегрессионного процесса больше 1, что соответствует положительной обратной связи и неустойчивой динамике, в то время как при неактивном и инактивированном состояниях коэффициент авторегрессионного процесса меньше единицы, что соответствует затухающей динамике. Вероятность перехода между неактивным и активным состояниями зависит от локальной концентрации Ca. Такой локальный марковский процесс в каждой точке приближенно описывает стохастические открывания–закрывания кластеров рецепторов к IP3. В точках, соответствующих тонким отросткам (“листочкам” астроцита, leaflets), коэффициент авторегрессионного процесса всегда остается меньше 1, отражая отсутствие активных процессов выброса ионов Ca в цитоплазму, однако здесь сама концентрация в каждой точке подвержена воздействию случайного пуассоновского процесса, моделирующего кальциевые транзиенты в астроците, сопряженные с локальной синаптической активностью в нервной ткани. Численные эксперименты с такой моделью показали наличие вспышек повышенной концентрации кальция, которые охватывали от небольших локализованных областей до практически целого пространственного домена астроцита. Анализ длительностей и площади, охватываемой отдельными вспышками показал наличие степенного распределения (показатель степени γ=2.0 в случае длительностей и γ=2.86 в случае площадей), что согласуется с экспериментальными данными, полученными сестринском проекте А. В. Семьянова. Таким образом, степенная статистика кальциевых событий может быть описана как результат авторегрессионного процесса с переменным коэффициентом. На следующем этапе будет проведен анализ влияния морфологии астроцитов на динамику кальциевых событий в данной модели. | ||
2 | 7 декабря 2018 г.-3 декабря 2019 г. | Пространственно-временные паттерны коллективной кальциевой динамики в сети астроцитов в норме и при патологии |
Результаты этапа: = Анализ морфологии астроцитов пространственного распределения белков по данным иммуногистохимического окрашивания = Астроциты отвечают на изменение функционального состояния нервной ткани изменениями морфологии. Метод описания и численной оценки таких изменений — насущная задача для многих экспериментальных групп. Мы адаптировали для анализа изображений астроцитов многомасштабный метод контрастирования протяженных филаментоподобных структур, ранее применявшийся для повышения контраста сосудов на ангиограммах. Данный метод (multiscale vesselness) основан на расчете матриц Гесса для яркостей анализируемого изображения в каждой точке и анализе собственных значений этих матриц, при этом анализируемое изображение последовательно фильтруется все более низкочастотным фильтром Гаусса, давая, таким образом, информацию о протяженных структурах различных масштабов. L2-норма результирующих коэффициентов на разных уровнях позволяет оценить “спектр” пространственных масштабов, представленных в анализируемом изображении астроцита. Данный спектр может быть также параметризован по расстоянию до тела клетки, давая таким образом морфологический профиль астроцита. В рамках совместного проекта требовалась проверка гипотезы об изменении экспрессии и субклеточной организации критически важных для функционирования астроцита белков — глутаматного транспортера и глутаминсинтетазы. Для анализа данных иммуногистохимического окрашивания на эти белки был разработан метод обработки изображений. В каждой плоскости Z-стека микроскопических изображений производилось вычисление так называемого морфологического показателя (shape index), также основанного на собственных значениях матриц Гесса для яркости изображений. Данный показатель классифицирует локальные участки изображения по нахождению в них светлых точек, пятен, протяженных структур (“риджей”) и их темных эквивалентов, а также переходные структуры, в которых вторая производная по яркости в различных направлениях имеет различный знак. Показано, что в пилокарпиновой модели эпилепсии антитела к глутаминсинтетазе группируются в тяжи, что выражается в относительном увеличении вклада соответствующего морфологического показателя в этой группе животных. Проведен анализ распределения астроцитов коннексинов Cx30 и Cx40 по данным иммуногистохимического окрашивания. Разработана методика сегментации изображений в каждой Z-плоскости для выделения гранул с белком. Разработаны методики характеризации размеров и пространственного распределения таких гранул. = Совершенствование предварительной обработки данных: коррекция артефактов движения = Проведена работа по совершенствованию методов коррекции артефактов движения в данных флуоресцентного имиджинга. В частности, предложен метод выбора набора кадров-темплейтов для выравнивания на основе кластеризации похожих кадров видео, после чего каждый кадр регистрируется к своему темплейту, после чего проводится совмещение темплейтов между собой. Последовательность, совмещения между темплейтами выбирается исходя из частоты переходов принадлежности кадров в видео тому или иному классу. В качестве примера можно привести случай, когда в видео присутствуют регулярные смещения, что приведет к чередованию принадлежностей кадров между двумя классами. В реализованном нами подходе, исходя из частоты переходов, строится дерево темплейтов, где прежде всего совмещаются те пары темплейтов, между которыми чаще всего происходят переходы. При расчете оптического потока и смещений координат пикселей для компенсации сдвигов тканей необходима регуляризация локальных оценок. Предложен новый метод такой регуляризации, основанный на применении адаптивных DCT-сглаживающих сплайнов. При обычном сглаживании сначала производится DCT-разложение, после чего высокочастотные пространственные коэффициенты домножаются на понижающий коэффициент, затем производится обратное преобразование. В предлагаемом подходе допускается возможность сохранения высокочастотных коэффициентов DCT-разложения при условии того, что магнитуда этих коэффициентов достаточно велика. Например, из-за особенностей сканирующей микроскопии часто возникают артефакты в виде сдвигов с чередующимися (горизонтально) направлениями. Обычное сглаживание не позволит точно скомпенсировать такие сдвиги, тогда как адаптивная фильтрация в DCT-пространстве позволяет сохранить полезную информацию о смещениях. Предложена методика предварительной обработки данных и коррекции артефактов движения для данных имиджинга без морфологического канала. В частности, производится нормализация яркости и коррекции неоднородности окрашивания каждого кадра, убирается статический шум CCD-матрицы. Алгоритм для совмещения изображений использует сочетание аффинного преобразования и B-сплайнов на регулярной сетке. В качестве меры совмещенности изображений — для решения задачи оптимизации — использовалась взаимная информация между двумя изображениями. Для регуляризации использовалась энергия деформаций поля смещений. = Анализ данных кальциевого имиджинга на переживающих срезах гиппокампа = Проведен анализ экспериментальных данных астроцитарной кальциевой активности на срезах гиппокампа. Исследовалась спонтанная активность и активность на фоне электрической стимуляции коллатералей Шаффера. Перед анализом использовалась предварительная обработка данных, разработанная в ходе работы над данным проектом. А именно, исходя из статистики локальных флуктуаций яркости в регистрируемых данных оцениваются параметры усиления и константной добавки, а также темновой шум установки. Это позволяет преобразовать данные в стандартный вид, в котором яркость в каждом пикселе можно интерпретировать как количество зарегистрированных фотонов. Далее производится преобразование данных, стабилизирующее дисперсию, после чего становится возможным применять методы подавления шума, разработанные для аддитивного белого Гауссовского шума. После подавления шума и обратного преобразования, значения яркости в каждой точке кадра можно интерпретировать как интенсивность Пуассоновского процесса, описывающего статистику фотонов, т.е. как математическое ожидание от количества регистрируемых фотонов в заданной точке. После подавления шума вводился порог, по которому отсекались изменения флуоресценции, ниже определенного уровня, которые считались шумом. Связные области с надпороговыми увеличениями флуоресценции считались отдельными событиями кальциевой сигнализации. Далее для найденных событий рассчитывались распределения по длительностям, охватываемым областям, амплитудам изменений флуоресценции. В качестве дополнительных дескрипторов кальциевой активности разрабатывались следующие подходы: Символьное представление данных (кластеризация) и анализ последовательностей символов как данных (поторяющиеся последовательности, карты переходов) Анализ свойств временных корреляций в каждой точке видимой области: интерпретация как авторегрессионного процесса, расчет показателей информационной энтропии и сложности. Показано, что данные параметры коррелируют с морфологией астроцитов и с наличием активных событий в данной области Исследовались карты точек инициации событий, карты распространения индивидуальных событий (последовательности захвата новых территорий распространяющимся кальциевым событием), а также группы одновременно активных и одновременно неактивных пикселей Исследовались кинетики нарастания и спада сигнала флуоресценции в каждой точке регистрируемых изображений, выявлена связь максимальных скоростей нарастания и спада флуоресценции с морфологией. Показано, что глобальные изменения сигнала флуоресценции на уровне астроцитарного синцития больше всего коррелируют с появлением от одного до нескольких крупных кальциевых событий, в то время как количество одновременно наблюдаемых кальциевых событий слабо коррелировало с общей долей активных пикселей. = Статистическая модель кальциевой динамики в астроцитах = Продолжена работа по анализу статистической модели кальциевой сигнализации в астроцитах: код модели портирован для вычислений на видеокарте с использованием библиотек CUDA и numba. Реализованы возможности учета относительного объема астроцита (astrocyte volume fraction, AVF) в модели, а также анизотропной диффузии, с бОльшим коэффициентом диффузии вдоль отростков используемого шаблона, чем поперек них. Реализована возможность использования пространственных шаблонов и статистических параметров флуктуаций флуоресценции в качестве входных параметров для модели. | ||
3 | 5 марта 2020 г.-28 февраля 2021 г. | Пространственно-временные паттерны коллективной кальциевой динамики в сети астроцитов в норме и при патологии |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".