ИСТИНА

Проект посвящен выявлению, идентификации и структурно-функциональной характеристике высокоактивных пептидаз насекомых, расщепляющих биологически значимые трудногидролизуемые белки и пептиды. Будут выявлены и охарактеризованы новые высокоспецифичные пептидазы жуков-вредителей запасов зерновых Tenebrio molitor и Tribolium castaneum, способные гидролизовать проламины, их трудногидролизуемые пептиды и/или коллагены. Проламины – это главные запасные белки семян злаковых растений, богатые пролином и глутамином, способные вызывать аллергические реакции у чувствительных людей. Образующиеся из проламинов в ЖКТ человека пептиды, состоящие преимущественно из остатков пролина и глутамина вызывают наследственное аутоиммунное заболевание Celiac Sprue. Поэтому наши усилия будут сосредоточены на изучении пролин-специфичных (ПСП) и постглутамин-расщепляющих (ПГРП) пептидаз. В силу сложности пространственной организации и особенностей первичной структуры, изучение протеолиза проламинов, пептидов проламиновзатруднено. Известен весьма ограниченный набор пептидаз, гидролизующих эти субстраты. Для достижения целей проекта будет использован комплекс подходов, включающий методы биоинформатики, препаративной и аналитической биохимии, энзимологии и молекулярной биологии. Вначале впервые будут охарактеризованы комплексы ПСП тенебрионид биоинформатическими методами с использованием баз транскриптомов, полученных из разных стадий развития этих насекомых. Далее будет проведено биохимическое и энзимологическое исследование очищенных препаратов наиболее активных ПСП. Первым этапом исследования ПГРП будет биохимическое тестирование соответствующих активностей. Найденные ферменты будут выделены и идентифицированы масс-спектрометрическими методами, и полученные данные об их первичной структуре будут использованы для биоинформатического поиска их возможных гомологов, обладающих более высокой активностью. Аналогичным способом будут проанализированы и секретируемые пептидазы грибов. ПСП и ПГРП, способные наиболее активно гидролизовать проламины, их трудногидролизуемые пептиды и коллагены, будут экспрессированы в дрожжевой системе и подробно охарактеризованы. С использованием комплекса ПСП и ПГРП будут изучены механизмы ступенчатого гидролиза вышеперечисленных белковых и пептидных субстратов. Оригинальным явится подробное исследование комплекса пищеварительных ПСП, а также ПГРП насекомых. Впервые будет проведен поиск ПСП и ПГРП среди секретируемых пептидаз грибов. Результаты исследования будут иметь важное фундаментальное значение в области биохимии и эволюции пептидаз, прояснении механизмов и путей протеолиза сложных в структурном отношении белковых и пептидных субстратов, в энтомологии и микологии, а также могут представлять практический интерес для медицины, сельского хозяйства, пищевой, косметической и кожевенной промышленности.

В ходе выполнения проекта главное внимание было уделено всестороннему изучению постглутамин-расщепляющих (ПГРП) и пролин-специфичных пептидаз (ПСП) из модельных жуков-вредителей запасов зерновых Tenebrio molitor и Tribolium castaneum, у которого полностью секвенирован геном. Пищеварительный комплекс этих жуков эволюционно приспособлен к гидролизу трудно гидролизуемых проламинов семян злаковых растений (у пшеницы это глиадины), причем иными, чем у человека, путями с участием богатого набора пептидаз, и, предположительно, такие пептидазы могут быть использованы для энзимотерапии целиакии путем эффективного гидролиза глутамин- и пролин-богатых пептидов проламинов, не гидролизуемых в ЖКТ человека и токсичных для больных целиакией. Поиск и характеристику полных наборов ПГРП, которые представлены цистеиновыми эндопептидазами, проводили в транскриптомах кишечников личинок T. molitor и T. castaneum и в геноме T. castaneum. В кишечнике личинок Т. molitor были идентифицированы 29 транскриптов цистеиновых пептидаз семейства С1 (папаина), кодирующих катепсины L, B, F и O. Максимальный уровень экспрессии был определен для мРНК двух ПГРП, катепсинов L и В. У Т. castaneum было выявлено 24 транскрипта тех же видов, и максимальным уровнем экспрессии обладали два гена катепсинов L. Анализ экспрессии катепсинов Т. castaneum на разных стадиях развития позволил очертить круг генов пищеварительных пептидаз, обладающих высоким уровнем экспрессии только на питающихся стадиях развития и включающий 12 генов. Проведен поиск генов цистеиновых пептидаз семейства С1 в секвенированных геномах 33 видов грибов, однако такие гены в проанализированных геномах отсутствовали. Для дальнейших биохимических исследований пептидаз была предложена и синтезирована серия специфических и селективных хромогенных и флуорогенных пептидных субстратов. С использованием предложенных флуорогенных субстратов был разработан высокочувствительный метод постэлектрофоретического тестирования активности пептидаз непосредственно в ПААГ. С использованием разработанного метода наиболее активные цистеиновые пищеварительные ПГРП личинок тенебрионид были выделены и идентифицированы как продукты наиболее высокоэкспрессируемых в кишечниках генов цистеиновых пептидаз у обоих насекомых. Методом РНК интерференции было изучено влияние нокдауна наиболее высоко экспрессируемого гена ПГРП (катепсина L NP_001164001, выделенного биохимически) на личинок Т. castaneum. Смертности личинок в этих опытах не наблюдали, хотя уровень экспрессии целевого гена снижался от 60 до 114 раз. Незначительное повышение уровня экспрессии наблюдали у двух генов цистеиновых пептидаз из других кластеров и у 6 генов сериновых пептидаз, что указывает на устойчивость пищеварительной системы тенебрионид к внешним воздействиям, обусловленную, по-видимому, множественностью и взаимозаменяемостью их пищеварительных ферментов. Мы также сравнили профили экспрессии транскриптов из кишечника личинок T. molitor и T. castaneum. Хотя оба этих насекомых относятся к семейству тенебрионид, они имеют разные жизненные циклы, различающиеся по продолжительности и количеству личиночных стадий. Около половины всех выявленных генов представлены ортологами, что указывает на сходство принципов строения и функционирования пищеварительных аппаратов двух тенебрионид и является первым шагом к всестороннему пониманию пищеварения у этих насекомых. В экспрессионной системе Pichia pastoris был получен рекомбинантный препарат катепсина L NP_001164001 T. castaneum, проведена его подробная характеристика и показано, что в сравнении с катепсинами L человека и В быка пептидаза T. castaneum обладает самой высокой постглутамин-расщепляющей активностью. Последующие исследования посвящены пролин-специфичным пептидазам (ПСП). Биоинформатический поиск ПСП в геномах тенебрионид показал, что у Т. castaneum имеется 14 генов ПСП, также, как и в геноме человека, а в транскриптоме кишечника личинок T. molitor найдено лишь 11 ПСП, что, по-видимому, связано с «молчанием» ряда генов ПСП этого насекомого в кишечнике. Все предсказанные ПСП относятся к двум подподклассам пептидаз – к сериновым и металлопептидазам. Наборы ПСП насекомых проявляют значительное сходство, но отличаются от набора человека. Большинство выявленных последовательностей принадлежит к экзопептидазам. Высокой экспрессией мРНК у обоих насекомых характеризуются 2 дипептидилпептидазы 4 (ДПП 4), пролидаза (ПРД), пролилкарбоксипептидаза (ПКП), аминопептидаза Р (APP1). К секретируемым пептидазам относятся высокоэкспрессируемые ДПП 4_1, ПКП. Ранее мы показали, что ПКП является пищеварительным ферментом (Goptar et al., 2013. Insect Biochem. Mol. Biol. 43(6): 501-509). Такая же функция предполагается и для ДПП 4_1. Мы провели выделение, идентификацию и характеристику высокоактивных в кишечнике личинок T. molitor ПСП – ДПП 4 и ПРД. ДПП 4 отщепляет дипептиды вида Хаа-Pro c N-конца полипептидной цепи, что позволяет предположить её широкое использование в гидролизе токсических пептидов глиадинов вида LPYPQPQLPQ. ПРД расщепляет имидодипептиды с C-концевым остатком Pro, которые образуются из глиадинов под действием ДПП 4. Она является цитоплазматическим ферментом, но может участвовать в заключительных этапах пищеварения, локализуясь в задней части средней кишки, так как имидодипептиды предположительно абсорбируются в клетки эпителия кишечника из содержимого просвета кишки мембранными пептидными транспортерами, которые мы аннотировали в транскриптоме кишечника личинок T. molitor. Впервые проведен системный анализ спектра ПСП в 33 секвенированных геномах грибов из различных систематических групп и экологических ниш. Выявлены гомологи для 10 из 15 ПСП человека, и 1 специфичная для грибов кислая пролилэндопептидаза (ПЭП). Присутствие или отсутствие ПСП у видов грибов в основном определяется таксономическим положением этих видов. У большинства изученных видов грибов ДПП 4, представляющие для нас максимальный интерес в связи с их субстратной специфичностью, являются трансмембранными пептидазами, в отличие от растворимых секретируемых ДПП 4 насекомых, что делает последние более привлекательными для дальнейшего использования в лечении целиакии. Поэтому рекомбинантный препарат ДПП 4 (rTmDPP4) был получен с использованием мРНК личинок T. molitor. Проведена его подробная характеристика. Показана большая эффективность гидролиза токсических пептидов глиадинов rTmDPP4, чем рекомбинантной ДПП 4 человека. Препараты ПГРП и ПСП T. molitor были использованы для изучения механизмов гидролиза пищевых белков тенебрионид – глиадинов. Были использованы очищенные препараты ПГРП – главного катепсина L, и ПСП – ДПП 4 и ПКП, охарактеризованной нами ранее (Goptar et al., 2013. Insect Biochem. Mol. Biol. 43(6): 501-509). Наибольшей эффективностью гидролиза глиадинов обладала ПГРП катепсин L. Далее следовали ДПП 4 и ПКП. Гидролиз глиадинов смесями из двух и трех ферментов показал, что каждая из найденных ПСП вносит значительный вклад в общий гидролиз глиадинов, что выражается в синергетическом эффекте по сравнению с действием отдельных пептидаз, и комплекс пищеварительных пептидаз T. molitor, включающий ПГРП и ПСП, подходит для эффективного гидролиза глиадинов.