ИСТИНА

Эндотелий сосудов контролирует один из ключевых этапов развития воспалительной реакции в организме – проникновение лейкоцитов и растворимых медиаторов иммунитета в очаг воспаления. Активные формы кислорода (АФК) участвуют в регуляции барьерной функции эндотелия: они передают сигналы экспрессии и секреции хемокинов (IL-8, IL-6), молекул адгезии (ICAM1, ICAM2, VCAM1, E-селектин), перестройки цитоскелета, разборки межклеточных контактов и апоптоза. Мы предполагаем, что воспалительные сигналы в клетках сосудистого эндотелия активируются через митохондрии и митохондриальные АФК. Для проверки нашего предположения, мы планируем провести исследования на линиях эндотелиальных клеток ECV 304 и Eahy 926. В этих клетках будет исследовано действие фактора некроза опухолей (TNFa) на генерацию суммарных и митохондриальных АФК, морфологию митохондрий, их биоэнергетические функции. Для выяснения роли митохондрий в развитии воспалительных реакций будут использованы специфические ингибиторы митохондриальных функций, а также специфически адресованные в митохондрии антиоксиданты на основе пластохинона и проникающих катионов. Необходимо исследовать активацию МАРК-зависимых сигнальных путей, активацию факторов транскрипции NFkB и AP-1, экспрессию цитокинов и молекул адгезии, а также изменения адгезии лимфоцитов и проницаемости эндотелия для макромолекул и лимфоцитов. Чрезмерная или продолжительная активация эндотелия приводит к развитию таких серьезных сосудистых заболеваний как атеросклероз и атеротромбоз. Эти заболевания значительно учащаются с возрастом, а также при сахарном диабете. Мы планируем оценить предполагаемое ангиопротекторное действие антиоксидантов, в том числе митохондриально-направленных, у старых (от 22мес. гибриды CBAxC57bl/6) и диабетических (линия db/db) мышей. У этих животных будет оцениваться экспрессия молекул адгезии и воспалительных цитокинов в тканях аорты и сердца.

Используя митохондриально-направленное соединение SkQ1, обладающее свойствами антиоксиданта и «мягкого» разобщителя, мы исследовали роль митохондрий в развитии сосудистых дисфункций в двух in vivo моделях: модели старения (24 месячные мыши гибриды F1 (CBAxC57Bl/6) и модели диабета (мыши гомозиготы C57BL/KsJ-db-/db-(db/db). SkQ1 никак не влиял на развитие диабета у db/db мышей (увеличение массы тела, уровня глюкозы и глюкозилированного гемоглобина в крови), но снижал уровень перекисного окисления липидов в их печени. У старых мышей нам не удалось детектировать влияния старения или SkQ1 на уровень перекисного окисления липидов в печени, возможно из-за недостаточной чувствительности выбранного нами метода измерения (МДА). SkQ1 не предотвращал вызванные старением и диабетом возрастание уровня основных воспалительных цитокинов TNF и IL-6 в сыворотке крови, но полностью предотвращал возрастание молекул адгезии ICAM1 в аортах старых мышей [1]. Наблюдалась также тенденция к понижению экспрессии некоторых других маркеров воспаления (VCAM, MCP-1, TNF) в аортах старых животных под действием SkQ1. Это указывало на то, что SkQ1 не влияет на общую генерацию воспалительных цитокинов, но влияет на ответ клеток-мишеней на них. В системах in vitro мы оценили влияние SkQ1 на стимулированную TNF активацию эндотелиальных клеток [1]. В эндотелиальных клетках линии EAhy926 SkQ1 подавлял индуцированное TNF повышение экспрессии ICAM1, секрецию IL-6 и IL-8, а также адгезию нейтрофилов к монослою эндотелия. На первичной культуре эндотелия пупочной вены человека (HUVEC) мы также показали, что SkQ1 подавляет индуцированное TNF повышение экспрессии молекул адгезии ICAM1, VCAM и Е-селектина. Таким образом, мы подтвердили, что эндотелиальные клетки могут быть прямой мишенью противовоспалительного действия SkQ1. В обеих используемых нами in vivo моделях наблюдались нарушения процесса заживления кожных ран. В частности, в ранах на поздних стадиях заживления обнаруживалось большое количество нейтрофилов, то есть существенно затягивалась воспалительная фаза заживления. SkQ1 восстанавливал процесс заживления кожных ран, при этом на поздних стадиях заживления наблюдалось исчезновение нейтрофилов из ран (подавлялось хроническое воспаление) и восстанавливались процессы формирования грануляционной ткани [2, 3]. Следует отметить, что подавление под действием SkQ1 способности эндотелиальных клеток связывать нейтрофилы может быть одной из причин снижения их количества в ранах старых и диабетических мышей и восстановления процесса ранозаживления в целом. Основной фактор транскрипции, который регулирует экспрессию ICAM1, а также IL-6 и IL-8 – NFkB [4-6]. Кроме NFkB в регуляции экспрессии ICAM1, IL-6 и IL-8 участвуют другие сигнальные элементы, в том числе стресс-киназы p-38 и JNK, которые вызывают активацию транскрипционного фактора AP-1. Используя специфические ингибиторы транскрипционного фактора NFkB и стресс-киназ р38 и JNK мы показали, что экспрессия ICAM1 индуцированная TNF зависит главным образом от NFkB и в меньшей степени от р38. SkQ1 не влиял на фосфорилирование (активацию) р38 и JNK, но существенно подавлял фосфорилирование и протеолитическое расщепление IkBa и переселение транскрипционной субъединицы NFkB, p65, в ядро. На переселение р65 в ядро и его транскрипционную активность может влиять фосфорилирование этого фактора [7]. SkQ1 не влиял на фосфорилирование p65. Активация NFkB играет значительную роль в воспалительном и про-атерогенном изменении фенотипа эндотелиальных клеток при старении [8, 9]. Мы предполагаем, что в системе in vivo противовоспалительное действие SkQ1 также связано с подавлением активации NFkB. В ходе работы на клетках мы обнаружили, что не только SkQ1, но и С12ТРР, его фрагмент, не обладающий прямым антиоксидантным действием, подавляет активацию эндотелиальных клеток EAhy926. Ранее было показано, что SkQ1 и C12TPP обладают свойствами «мягких» разобщителей окислительного фосфорилирования и дыхания [10, 11]. Мы использовали классические разобщители ДНФ и ТТФБ в низких концентрациях (5мкМ и 0,1 мкМ соответственно) и на клетках EAhy926 показали, что «мягкое» разобщение подавляет вызванную TNF активацию NFkB (фосфорилирование и расщепление IkBa), экспрессию ICAM1, секрецию IL-6 и IL-8, а также адгезию нейтрофилов к монослою эндотелия. На первичной культуре HUVEC C12TPP и DNP подавляли стимулированную TNF экспрессию ICAM1, VCAM и Е-селектина также как SkQ1. Разобщение окислительного фосфорилирования и дыхания может приводить: (1) как к стимуляции, так и к подавлению генерации АФК митохондриями; (2) подавлению синтеза АТФ; (3) увеличению концентрации Ca2+ в цитоплазме; (4) стимуляции защитных систем клетки (в том числе атиоксидантных); (5) биогенеза митохондрий и митофагии [12-15]. Мы начали проверку того, какие из этих возможных последствий «мягкого» разобщения влияют на экспрессию ICAM1 в нашей модели. (1) Два классических антиоксиданта, NAC (1-5мМ) и Trolox (100-200мкМ), заметно подавляли вызванную TNF активацию NFkB, экспрессию ICAM1 и адгезию нейтрофилов на монослое клеток EAhy926. С другой строны, SkQ1, в отличие от NAC, практически не снижал общий уровень АФК, образующихся через 6-8 часов после обработки клеток TNF. Это указывает на то, что механизм подавления экспрессии ICAM1 NAC и SkQ1 могут различаться. (2) Для проверки предположения о том, что в основе противовоспалительного действия разобщителей лежит подавление генерации АТФ мы использовали ингибитор АТФ-синтетазы митохондрий – олигомицин. Длительная инкубация (4 дня) клеток EAhy926 c олигомицином (5мкг/мл) приводила к гибели клеток. Однако, в концентрации 0,06мкМ олигомицин подавлял базовую и стимулированную TNF экспрессию ICAM1 (предварительные результаты). (3) Для оценки возможного участия Ca2+ -зависимых механизмов в противовоспалительном действии разобщителей мы использовали хелатор Ca2+, BAPTA. BAPTA (10мкМ) также подавлял стимулированную TNF экспрессию ICAM1 (предварительные результаты). (4) SkQ1 не влиял на экспрессию основного антиоксидантного фермента митохондрий MnSOD в аортах старых мышей. Однако, мы не можем исключать влияния SkQ1 и разобщителей на другие защитные и антиоксидантные системы клетки. (5) Мы показали, что длительная обработка клеток EAhy926 ДНФ и С12ТРР не оказывает заметного влияния на количество митохондриальной ДНК. Мы также не обнаружили заметного влияния SkQ1 на экспрессию одного из основных регуляторов биогенеза митохондрий, PGC1a, в аортах старых мышей, но мы обнаружили, что SkQ1, С12ТРР и ДНФ заметно влияют на структуру митохондриального ретикулума. Мы обнаружили, что в клетках EAhy926 (в условиях конфлюентного монослоя) митохондрии чрезвычайно гетерогенны. Среди них наблюдалась ярко выраженная популяция раздробленных митохондрий с низким потенциалом. Длительная обработка (4 дня) клеток с SkQ1, C12TPP и ДНФ (в низкой концентрации, 5мкМ) приводила к заметному увеличению элонгации митохондрий, одновременно с этим наблюдалось снижение количества аутофагосом (предварительные результаты, количественные данные получены только для ДНФ). В целом, наши данные указывают на то, что и снижение количества АФК в клетке и небольшое подавление синтеза АТФ митохондриями и снижение уровня Ca2+ (в среде и, как следствие, в цитоплазме клеток) приводят к подавлению стимулированной TNF экспрессии ICAM1 в нашей системе. Однако, вопрос о том какой из этих механизмов активируют разобщители пока остается открытым. Мы не подтвердили, но и не опровергли предположения о том, что разобщители стимулируют защитные системы клетки или биогенез митохондрий. Мы получили предварительные данные указывающие на то, что длительное «мягкое» разобщение приводит к изменению процесса митодинамики и подавляет аутофагию. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения механизмов противовоспалительного действия разобщителей. Мы показали, что SkQ1, C12TPP и ДНФ предотвращают вызванные TNF снижение общего уровня белка межклеточных адгезионных контактов VE-кадгерина, разборку межклеточных адгезионныдх контактов и возрастание проницаемости монослоя эндотелия для макромолекул (65-85 кДа декстран-ТРИТЦ). В условиях, когда клетки дорастали до полностью конфлюэнтного монослоя TNF не влиял на экспрессию мРНК VE-кадгерина. Используя общий для всех металлопротеаз внеклеточного матрикса (ММР) ингибитор (GM6001) мы показали, что падение уровня VE-кадгерина и проницаемость монослоя эндотелия под действием TNF зависит от ММР. Мы предполагаем, что «мягкое» разобщение ведет к подавлению экспрессии, секреции или активации ММР. Мы надеемся продолжить эти исследования и проверить данное предположение в дальнейшем. SkQR1 и SkQ1 предотвращали апоптоз эндотелиальных клеток, вызванный высокими концнтрациями TNF [16]. SkQR1 не влиял на вызванную TNF протеолитическую активацию каспазы 8 и Bid, но ингибировал выход цитохрома с из митохондрий, расщепление каспазы 3 и ее субстрата PARP. Анти-апоптотическое действие SkQR1 может быть связано с наблюдаемым нами повышением базового уровня анти-апоптотического белка BCL-2 и снижением базового уровня про-апоптотических белков Bax и p53. Мы также показали, что SkQ1 предотвращал вызванное TNF снижение уровня BCL-2. SkQ1 не влиял на базовую экспрессию мРНК BCL-2, но подавлял его убиквитинилирование, а также усиливал убиквитинилирование белка Bax, следовательно, механизм регуляции уровня BCL-2 SkQ1 был связан с предотвращением его протеосомной деградации. Аналоги SkQ без антиоксидантного фрагмента не предотвращали индуцировнный TNF апоптоз. Эти результаты указывают на то, что продукция митохондриями активных форм кислорода (АФК) вовлечена в индуцированную TNF смерть эндотелиальных клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что митохондрии эндотелиальных клеток контролируют как активацию эндотелия за счет повышения поляризации своей внутренней мембраны, так и клеточную смерть за счет генерации АФК. Таким образом, митохондриально-направленные соединения, совмещающие в себе свойства разобщителей и антиоксидантов, могут рассматриваться как потенциальные вазопротекторы. 1. Zinovkin RA, Romaschenko VP, Galkin II, Zakharova VV, Pletjushkina OY, Chernyak BV, Popova EN: Role of mitochondrial reactive oxygen species in age-related inflammatory activation of endothelium. Aging (Albany NY) 2014, 6(8):671-674. 2. Демьяненко ИА, Васильева ТВ, Галкин ИИ, Егоров МВ, Ильинская ОП, Манских ВН, Федоров АВ, О.В. М: Исследование репаративных процессов при заживлении полнослойных кожных ран у старых мышей на фоне длительного приема 10-(6'-пластохинонил) децилтрифенилфосфония. Морфологические ведомости 2012, 2:24-33. 3. Демьяненко И.А., Васильева Т.В.; Галкин И.И.; Егоров М.В; Ильинская О.П.; Манских В.Н.; Попова Е.Н.; Федоров А.В.: Новый митохондриально-направленный антиоксидант ускоряет репаративные процессы в полнослойной кожной ране у мышей C57BLKS-Leprdb/J с генетически обусловленными нарушениями углеводного и липидного обмена Морфологические ведомости 2011, 4:23-30. 4. Rahman A, Fazal F: Hug tightly and say goodbye: role of endothelial ICAM-1 in leukocyte transmigration. Antioxid Redox Signal 2009, 11(4):823-839. 5. Roebuck KA, Carpenter LR, Lakshminarayanan V, Page SM, Moy JN, Thomas LL: Stimulus-specific regulation of chemokine expression involves differential activation of the redox-responsive transcription factors AP-1 and NF-kappaB. J Leukoc Biol 1999, 65(3):291-298. 6. Roebuck KA, Finnegan A: Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J Leukoc Biol 1999, 66(6):876-888. 7. Vermeulen L, De Wilde G, Notebaert S, Vanden Berghe W, Haegeman G: Regulation of the transcriptional activity of the nuclear factor-kappaB p65 subunit. Biochem Pharmacol 2002, 64(5-6):963-970. 8. Csiszar A, Ungvari Z, Koller A, Edwards JG, Kaley G: Aging-induced proinflammatory shift in cytokine expression profile in coronary arteries. Faseb J 2003, 17(9):1183-1185. 9. Csiszar A, Wang M, Lakatta EG, Ungvari Z: Inflammation and endothelial dysfunction during aging: role of NF-kappaB. J Appl Physiol (1985) 2008, 105(4):1333-1341. 10. Antonenko YN, Khailova LS, Knorre DA, Markova OV, Rokitskaya TI, Ilyasova TM, Severina, II, Kotova EA, Karavaeva YE, Prikhodko AS et al: Penetrating cations enhance uncoupling activity of anionic protonophores in mitochondria. PLoS One 2013, 8(4):e61902. 11. Trendeleva TA, Sukhanova EI, Rogov AG, Zvyagilskaya RA, Seveina, II, Ilyasova TM, Cherepanov DA, Skulachev VP: Role of charge screening and delocalization for lipophilic cation permeability of model and mitochondrial membranes. Mitochondrion 2013, 13(5):500-506. 12. Brookes PS, Yoon Y, Robotham JL, Anders MW, Sheu SS: Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am J Physiol Cell Physiol 2004, 287(4):C817-833. 13. Davidson SM, Duchen MR: Endothelial mitochondria: contributing to vascular function and disease. Circ Res 2007, 100(8):1128-1141. 14. Figueira TR, Barros MH, Camargo AA, Castilho RF, Ferreira JC, Kowaltowski AJ, Sluse FE, Souza-Pinto NC, Vercesi AE: Mitochondria as a source of reactive oxygen and nitrogen species: from molecular mechanisms to human health. Antioxid Redox Signal 2013, 18(16):2029-2074. 15. Tilstra JS, Clauson CL, Niedernhofer LJ, Robbins PD: NF-kappaB in Aging and Disease. Aging Dis 2011, 2(6):449-465. 16. Galkin II, Pletjushkina OY, Zinovkin RA, Zakharova VV, Birjukov IS, Chernyak BV, Popova EN: Mitochondria-targeted antioxidants prevent TNFalpha-induced endothelial cell damage. Biochemistry (Mosc) 2014, 79(2):124-130.