Развитие стратегий создания гетерологичных энзиматических систем: экспрессия белков стероидогенной системы цитохрома Р450scc быка в клетках дрожжей и бактерий в форме самопроцессирующегося полипротеинаНИР

Development of strategies in the design of heterologous enzymatic systems: expression of bovine P450scc steroidogenic system in yeast and bacteria cells as a self-processing polyprotein

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 2 февраля 2015 г.-31 декабря 2015 г. Развитие стратегий создания гетерологичных энзиматических систем: экспрессия белков стероидогенной системы цитохрома Р450scc быка в клетках дрожжей и бактерий в форме самопроцессирующегося полипротеина
Результаты этапа: Проведена работа по конструированию кДНК, включающей гены белков холестерингидроксилазной/лиазной (ХГ/Л) системы быка - цитохрома P450scc (CYP11A1), адренодоксина (Ad) и адренодоксинредуктазы (AdR), слитые в одну открытую рамку считывания при помощи линкерных последовательностей белка 2А вируса ящура (FMDV). Созданы репликативные векторы, способные направлять экспрессию данной кДНК, кодирующей полипротеин P450scc–2A1–Ad–2A2-AdR, в клетках бактерии E. coli и дрожжей S. cerevisiae. В полученных рекомбинантных штаммах проведен анализ экспрессии белков и эффективности расщепления линкерной последовательности 2А с использованием электрофореза (SDS-PAGE) и Вестерн-блоттинга. В клетках бактерий индукция приводит к высокому уровню экспрессии белков ХГ/Л системы в основном в виде полипротеина. В клетках дрожжей S. cerevisiae каждый компонент гетерологичного полипротеина экспрессируется как индивидуальный белок. Однако, некоторая доля AdR и Ad представлена в клетках в форме двойного гибрида Ad-2A-AdR. Таким образом, 2А1-линкер обеспечивает эффективное расщепление полипротеина, в то время как 2А2-линкер демонстрирует меньшую эффективность. С использованием метода ИФА обнаружено, что бесклеточный гомогенат рекомбинантных клеток дрожжей проявляет ХГ/Л активность в отношении 22(R)-гидроксихолестерина. Проведена работа по оптимизации метода определения активности цитохрома P450scc, в результате получены данные о возможности использования флуоресцентного (NBD-производного) аналога холестерина в качестве субстрата для определения активности P450scc в трансгенных клетках E. coli. Таким образом, впервые успешно осуществлена реконструкция Р450-системы млекопитающих в клетках дрожжей посредством экспрессии полипротеина, саморасщепляющегося в процессе трансляции. Результаты являются основой для последующей работы по оптимизации последовательности линкерного белка 2А с целью более эффективного расщепления полипротеина и поиска перспективных рекомбинантных штаммов для биотехнологического синтеза фармацевтических стероидов.
2 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Развитие стратегий создания гетерологичных энзиматических систем: экспрессия белков стероидогенной системы цитохрома Р450scc быка в клетках дрожжей и бактерий в форме самопроцессирующегося полипротеина
Результаты этапа: Показано, что в клетках бактерии E. coli механизм саморасщепления белка 2А вируса ящура (2А FMDV) в процессе трансляции не реализуется. Продолжена работа, направленная на оптимизацию системы экспрессии полипротеина P450scc–2A–Adx-2А-AdR (HGL-2A), расщепляющегося с образованием белков холестерингидроксилазной/лиазной (ХГ/Л) системы быка, в клетках дрожжей S. cerevisiae. С целью повышения эффективности расщепления проведена замена второго линкера 2А в составе HGL-2A на 1) модифицированную последовательность 2А FMDV и 2) на 2А-подобную последовательность белка вируса Thosea asigna (Т2А). Обнаружено, что использование Т2А повышает эффективность расщепления HGL-2A. Проведена первая стадия генно-инженерной работы, направленной на получение плазмидной конструкции для экспрессии HGL-2A с оптимизированным линкером 2А в клетках липофильных дрожжей Y. lipolytica. Проведено сравнение эффективности расщепления 2А FMDV в клетках дрожжей и млекопитающих; показано, что низкая эффективность расщепления второго линкера 2А в составе HGL-2A не связана с особенностями дрожжевой системы трансляции. Для экспрессии HGL-2A в клеточной линии НЕК293Т сконструирована плазмида pcDNA3.1_СoxIVCH/L-2A-GFP, проведен анализ полученной плазмиды и трансфекция клеток. Флуоресцентная микроскопия и Вестерн-иммуноблоттинг подтвердили наличие всех белков ХГ/Л системы в трансфицированных клетках. Обнаружено, что экспрессируемые белки образуют в данных клетках функционально активную энзиматическую систему – активность P450scc в отношении 20?-гидроксихолестерина in vitro составила 32,7 нг/мг белка митохондрий?час (данные ELISA). Таким образом, впервые c использованием 2A-пептидной технологии проведена реконструкция активной стероидогенной Р450scc-системы в нестероидогенных клетках человека. Данная система экспрессии может быть использована в дальнейшем для фундаментальных и прикладных исследований.
3 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Развитие стратегий создания гетерологичных энзиматических систем: экспрессия белков стероидогенной системы цитохрома Р450scc быка в клетках дрожжей и бактерий в форме самопроцессирующегося полипротеина
Результаты этапа: Продолжена работа, направленная на поиск оптимальной последовательности линкера 2А2 в составе саморасщепляющегося полипротеина P450scc–2A–Ad-2А2-AdR (HGL-2А), которая обеспечит экспрессию трех индивидуальных белков холестерингидроксилазной/лиазной (ХГЛ) системы быка. В базовой плазмиде pYeDP/mHGL-2A осуществлена замена данного линкера на 2А-подобную последовательность из генома вируса Porcine techovirus-1 (Р2А). С целью выбора оптимальной конструкции для дальнейшей работы проведен анализ эффективности расщепления 4-х вариантов линкера 2А2 в составе полипротеинов HGL-2А: вирусных последовательностей 2А FMDV, mod-2А FMDV, Р2А и последовательности вируса T. asigna GSG-T2А. Показано, что при синтезе HGL-2А в клетках S. сerevisia эффективность расщепления полипротеина с GSG-T2А и P2A существенно возрастает (до ~90%) в сравнении с 2А-FMDV и mod-2А FMDV. Для выяснения возможности влияния концевой последовательности Ad на структуру 2А2 и эффективность расщепления HGL-2А получена плазмидная конструкция pYeDP/HGL-2А2 с измененным порядком генов в составе слитой кДНК (P450scc–2A– AdR-2A–Adx) и трансформированные штаммы S. cerevisiae/pYeDP/mHGL-2А2. Проводится анализ продуктов экспрессии гетерологичных белков. Сконструирован вектор p67PТ, включающий последовательность кДНК HGL-2А для экспрессии белков ХГЛ системы в клетках липофильных дрожжей Y. lipolytica, способных поглощать стероидные соединения, использование которых, возможно, позволит создать эффективную клеточную систему, способную обеспечить in vivo биотрансформацию холестерина в прегненолон. В процессе конструирования проведено 1) изменение 5’-нетранслируемой области и введение последовательности Козак для повышения уровня трансляции гетерологичных генов и 2) встраивание в модифицированный вектор p67PT слитой кДНК, кодирующей P450scc–2A1–Ad-2А2-AdR с оптимизированным 2А2-линкером P2A. С использованием плазмид р67/Adx, р67/CYP17α и р67/P450scc–2A–Adx-2А-AdR получены трансгенные штаммы Y. lipolytica, осуществляющие совместную экспрессию генов белков ХГЛ системы и цитохрома Р45017α. Наличие гетерологичных генов в клетках подтверждено методом Нозерн-гибридизации. По результатам экспрессии саморасщепляющегося полипротеина HGL-2А в дрожжах опубликована статья : Efimova Vera S., Isaeva Ludmila V., Makeeva Desislava S., Rubtsov Mikhail A., Novikova Ludmila A. Expression of Cholesterol Hydroxylase/Lyase System Proteins in Yeast S. cerevisiae Cells as a Self-Processing Polyprotein. Molecular Biotechnology, 2017 oct; 59(9-10); 394-406. Издательство Springer International Publishing AG (Нью-Йорк) DOI

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".