Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментовНИР

Structure, mechanism, role and bioengineering of hydrolytic enzymes

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
2 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Было продолжено исследование бинарных комплексов в системе неорганическая пирофосфатаза (РРаза), фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза (FbaB), глутаматдегидрогеназа (GadA) и 5-кето-4-дезоксиуронатизомераза (KduI) из бактерии Escherichia coli. Было измерено влияние белков-партнеров на каталитические параметры FbaB и KduI и было обнаружено, что РРаза значительно активирует FbaB (на порядок); степень активации зависит от концентрации РРазы, в соответствии с этой зависимостью константа диссоциации комплекса составила 2,1 мкМ. Показано, что активирующее влияние РРазы на FbaB определяется снижением константы Михаэлиса от 18 до 2 мМ, в то время как каталитическая константа практически не изменяется. GadA также существенно активирует FbaB, однако, в отличие от РРазы, данный эффект определяется увеличением каталитической константы. Показано, что все белки-партнеры активируют KduI, увеличивая каталитическую константу на порядок без заметного изменения константы Михаэлиса. Константы диссоциации бинарных комплексов KduI составили 3,2 мкМ (РРаза), 4,2 мкМ (GadA), 14 мкМ (FbaB). Обнаружено, что ферментативную активность проявляет димерная форма KduI, в то время как превалирующий в физиологических условиях гексамер неактивен. Изучено влияние комплексообразования на олигомерное состояние белков-партнеров. Показано, что в системе GadA:РРаза происходит диссоциация обоих гексамерных партнеров: РРазы - до тримера, GadA - до димера. Для характеристики комплексов был использован метод малоуглового рентгеновского рассеяния. В настоящее время обработаны наборы, снятые для индивидуальных белков. Показано, что кривые рассеяния РРазы, GadA и KduI соответствуют кристаллическим структурам, а FbaB - теоретической модели, предложенной нами ранее. Продолжено сравнительное изучение инсерционных мутантов табака, содержащих синтетический ген ингибитора сериновых протеиназ гречихи в составе векторных конструкций разного дизайна. Полученные факты свидетельствуют о повышении устойчивости трансгенных растений с ингибитором протеиназ к фитопатогенам в опытах in vitro и обнаруженных противоречиях в опытах in vivo. Возможно, это связано с наличием целевого белка в экстрактах тканей и недостаточности его количнества для защиты от фитопатогенов в опытах in vivo, а также возможном явлении замолкания чужеродных генов или изменении сигнальных путей защитных реакций растения при введении трансгена любой природы, что требует дальнейшего изучения и полного скрининга полученных коллекций инсерционных мутантов табака и арабидопсиса в наших коллекциях. Изучение мутуалистической системы «грибной сад», образованной муравьями, принадлежащими к разным родам и видам трибы Attini, и грибом L. gongylophorus, выявило интересную закономерность: величина активности пептидаз коррелировала со степенью эволюционной «прогрессивности» видов муравьев. В водных смывах мицелия из колоний низших муравьев регистрировалась сравнительно низкая активность как сериновых, так и металлопротеиназ, в то время как грибные симбионты высших муравьев и муравьев-листорезов преимущественно секретировали пептидазы, принадлежащие к одному из классов. Грибные симбионты муравьев-листорезов секретировали, в основном, металлопротеиназы, в то время как в колониях высших муравьев регистрировалась преимущественно активность сериновых пептидаз. Выявленное распределение активности может указывать на связь между филогенетическим положением штаммов гриба и спектром секретируемых ими ферментов. Проведен подробный биоинформатический анализ наборов пролин-специфичных пептидаз в транскриптомах кишечников личинок T. molitor и T. castaneum с использованием баз данных, полученных на платформе Illumina. Исследованы физико-химические и энзиматические свойства идентифицированной дипептидил-пептидазы IV из T. molitor. Исследованы изменения уровней экспрессии сериновых и цистеиновых пептидаз в транскриптоме кишечника личинок T. molitor под действием энтомоцидного токсина Cry3Aa из Bacillus thuringiensis.
3 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Описана группа из 46 бактериальных и одного архейного белков, которые лишь отдаленно напоминают известные мембранные пирофосфатазы, но имеют полный набор из 12 полярных остатков, контактирующих с субстратом, нуклеофильной молекулой воды и 5 ионами магния в канонических мембранных пирофосфатазах. Они также содержат остаток лизина, определяющий зависимость фермента от ионов К+. Два новых белка (из Chlorobium limicola и Cellulomonas fimi) были экспрессированы в E. coli и показали электрогенный транспорт Н+, но не Na+ в обращенных мембранных везикулах. Уникальные особенности новых пирофосфатаз включают ингибирование ионами Na+ и ингибирование или активацию ионами К+. Кинетический анализ гидролиза пирофосфата в широких диапазонах концентраций кофактора (Mg2+) и субстрата (Mg2PPi) показал, что ионы щелочных металлов вытесняют Mg2+ из комплекса с ферментом, делая невозможным гидролиз субстрата. Таким образом, новые белки представляют собой новое семейство Н+-транспортирующих пирофосфатаз, которые частично унаследовали механизм регуляции ионами Na+ и K+ от предшественника - Na+-транспортирующей РРазы. В плане исследования бинарных комплексов в системе неорганическая пирофосфатаза (РРаза), фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза (FbaB), глутаматдегидрогеназа (GadA), 5-кето-4-дезоксиуронатизомераза (KduI) из E. coli было изучено влияние белков-партнеров на каталитические параметры FbaB и KduI. Было обнаружено, что РРаза значительно активирует FbaB (на порядок); степень активации зависит от концентрации РРазы, в соответствии с этой зависимостью Kd комплекса составила 2.1 мкМ. Показано, что активирующее влияние РРазы на FbaB определяется снижением Km (от 18 до 2 мМ), в то время как Vmax практически не изменяется. GadA также существенно активирует FbaB, однако, в отличие от РРазы, данный эффект определяется увеличением Vmax. Показано, что все белки-партнеры активируют KduI, увеличивая Vmax на порядок без заметного изменения Km. Константы диссоциации бинарных комплексов KduI составили 3.2 мкМ (РРаза), 4.2 мкМ (GadA), 14 мкМ (FbaB). Обнаружено, что ферментативную активность проявляет именно димерная форма KduI, в то время как превалирующий в физиологических условиях гексамер неактивен. Изучено влияние комплексообразования на олигомерное состояние белков-партнеров. Показано, что в системе GadA:РРаза происходит диссоциация обоих гексамерных партнеров: РРазы - до тримера, GadA - до димера. Для характеристики комплексов был использован метод малоуглового рентгеновского рассеяния. В настоящее время обработаны наборы, снятые для индивидуальных белков. Показано, что кривые рассеяния РРазы, GadA и KduI соответствуют кристаллическим структурам, а FbaB - теоретической модели, предложенной нами ранее. Проведен скрининг коллекций трансгенных растений табака с защитным геном ингибитора сериновых протеиназ из растений в составе векторных конструкций разного дизайна и их семенного потомства. Все проанализированные линии демонстрировали наличие/сохранение трансгенной вставки в ряде поколений и экспрессию введенного целевого гена. В опытах in vitro сок контрольных растений в меньшей степени подавлял рост газона бактерий, чем сок трансгенных растений из всех групп. В водных вытяжках мицелия грибного симбионта, полученного из «грибных садов», обнаружены четко выраженные буферные свойства (значение буферной емкости – около 20 мэкв/Л - сравнимо с буферной емкостью крови человека - 37 мэкв/Л). Оптимум активности протеиназ, секретируемых грибным симбионтом, совпадает с рН, поддерживаемым в грибном саду, что обеспечивает максимальную эффективность деградации белков в этой системе. Переход к обитанию в системе с насекомыми приводит к изменению рН оптимума активности пептидаз грибного симбионта Leucoagaricus gongylophorus с рН 6.0 до 5.2 (рН «грибного сада»). Проведено сравнение энзиматических и физико-химических свойств рекомбинантного препарата наиболее высоко экспрессируемого в кишечнике личинок жука-вредителя Tribolium castaneum цистеинового катепсина L со свойствами катепсинов L и В млекопитающих. Показано, что несмотря на сходство физико-химических свойств, лишь катепсин насекомого способен гидролизовать трудногидролизуемые пептиды главных пищевых белков жука – глиадинов. Сопоставление данных по анализу транскриптома, филогенетических взаимосвязей, ингибиторного анализа и других публичных данных позволило выявить ключевые цистеиновые пептидазы, которые Т. castaneum использует для переваривания пищи и, следовательно, новые потенциальные цели для биологического контроля этого вредителя пищевых запасов.
4 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Было продолжено исследование бинарных комплексов в системе неорганическая пирофосфатаза (РРаза), фруктозо-1,6-бисфосфат альдолаза (FbaB), глутаматдегидрогеназа (GadA), 5-кето-4- дезоксиуронатизомераза (KduI) и дигидролипоилдегидрогеназа (LpD) из E. coli. Было изучено влияние белковых партнеров на гидролитическую активность и олигомерное состояние РРазы. Обнаружено, что при инкубации в нейтральной среде (рН 6,5) присутствие GAD приводит к диссоциации РРазы на тримеры. При инкубации в кислой среде (рН 4,6) LpD защищает РРазу от диссоциации на тримеры; показано, что в нейтральной среде LpD активирует тримерную форму РРазы в 3-4 раза за счет увеличения Vmax. Все перечисленные белки были исследованы в растворе методом малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS). Для KduI, GadA и LpD было показано, что они образуют в растворе равновесную смесь олигомерных форм. Для FbaB была подтверждена декамерная форма, предложенная ранее. Для РРазы и KduI выявлены тонкие различия между структурой белка в кристалле и в растворе. Был получен препарат Se-Met FbaB, восстановленный под действием NaBH4. Препарат был закристаллизован, тестирована его дифракция и снят набор дифракционных данных. Однако качество дифракции не позволяет решить структуру с полученного набора. Проведены эксперименты по молекулярной динамике тримерной и гексамерной форм РРазы из M. tuberculosis. Отработана методика определения активности Mt-РРазы для микроанализа, которая может быть использована для скрининга широкого набора возможных ингибиторов. Проведен сравнительный анализ семян разных поколений выборочной группы трансгенных растений, содержащих целевой ген ингибитора сериновых протеиназ из гречихи (ISP) в составе разных векторных конструкций. Показано, что большинство проанализированных линий демонстрировали наличие/сохранение трансгенной вставки при длительном (более 10 лет) вегетативном размножении в неселективных условиях и в ряде поколений, а также экспрессию введенного целевого гена в опытах in vitro. Анализ экспрессии введенного гена ингибитора показал, что экстракты всех трансгенных растений с геном ингибитора протеиназ в значительной степени подавляли прорастание спор фитопатогенного гриба Aspergillus nidulans. Сравнительный анализ физико-химических и кинетических свойств секретируемых пептидаз мицелиальных грибов, принадлежащих к различным экологическим группам, показал, что трофическое поведение грибов определяет тип главной секретируемой пептидазы. Для энтомопатогенов - это сериновая пептидаза субтилизиноподобного типа, для сапротрофов – металлопептидаза, а для мутуалистов – тоже металлопептидаза, но активная по субстратам субтилизиноподобных пептидаз. Все изученные ферменты имели сходные рН и температурные стабильности и температурный оптимум, но четко различались в отношении оптимума рН (от 9 до 5,2), Была выделена, очищена и охарактеризована пролин-специфичная пептидаза большого мучного хрущака Tenebrio molitor. Она активно гидролизовала глиадины, являющиеся главными пищевыми белками этого насекомого-вредителя запасов зерновых и продуктов их переработки, а сочетание её с постглутамин-расщепляющей цистеиновой пептидазой тенебрионид в процессе гидролиза глиадинов обладало синергическим эффектом. Проведена аннотация пептидаз в геномах 6 видов насекомых - вредителей с/культур. Выявлены консервативные и видоспецифические группы их пищеварительных пептидаз - катепсинов.
5 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: В отчетном году был продолжен скрининг коллекции трансгенных растений табака с геном ингибитора сериновых протеиназ гречихи (ISP) и проведено пополнение коллекции трансгенных растений табака с геном ISP. Впервые получена серия трансгенных растений табака с геном антимикробного пептида из дикого вида пшеницы Triticum kiharae и геном дефензина из звездчатки. Показано, что введение гетерологичных растительных генов разной природы, используемых растением в разных механизмах защиты от фитопатогенов, приводит к примерно одинаковому повышению фитопатогенной активности тканей трансгенных растений табака. Была исследована адсорбция секретируемых пептидаз Cordyceps militaris и A. bisporus на кутикуле Nauphoeta cinerea. Установлено, что выращивание гриба на среде с кутикулой приводит к увеличению адсорбционной способности фермента по сравнению с пептидазами, секретируемыми в культуральную среду с желатиной. Эффективность адсорбции пептидаз гриба на кутикуле хозяина определяет и лучшую расщепляемость белков покровов, которая составляла 18% для фермента энтомопатогена C. militaris и только 9% для пептидазы сапротрофа A. bisporus. Полученные результаты указывают на большую приспособленность ферментов энтомопатогенных грибов к расщеплению белков покровов насекомых. Сравнение профилей экспрессии транскриптов в кишечниках личинок двух жуков, Tenebrio molitor и Tribolium castaneum, показало что транскриптомы их кишечников содержат 11 521 генов у T. castaneum и 17 871 генов у T. molitor, среди которых лишь 6907 генов были ортологами. Полученные данные иллюстрируют общие черты и различия, которые могут быть связаны с видообразованием и адаптацией насекомых к окружающей среде. Из кишечника личинок Tenebrio molitor был выделен и охарактеризован новый фермент пролидаза и показано, что он относится к пролидазам первого типа. В отчетный период мы обнаружили ингибирование пирофосфатазы фруктозо-1-фосфатом (Fru-1-P). Для идентификации места связывания ингибитора на ферменте были получены пять мутантных форм фермента с единичной или двойной заменами аминокислотных остатков, входящих в аллостерический регуляторный центр пирофосфатазы. Устойчивость к ингибитору мутантных форм пирофосфатазы подтвердила участие Lys112, Lys115 и Arg48 в связывании ингибитора. Таким образом, Fru-1-P является физиологическим ингибитором пирофосфатазы, действующим через регуляторный центр фермента. Фруктозобисфосфатальдолаза (Fba) образует in vivo комплекс с пирофосфатазой. Для определения пространственной структуры Fba был получен белок, в котором все остатки метионина были замещены на селенометионин. Для определения структуры была использована рентгеновская съемка суспензии мелких кристаллов («серийная кристаллография») и получены первые обнадеживающие результаты. Метод определения фосфата модифицирован для целей высокопроизводительного скрининга ингибиторов в малых объёмах реакционных смесей. Среди большого числа предсказанных эффекторов пирофосфатазы Mycobacterium tuberculosis (Mt-РРазы) найдены 35 активаторов и два ингибитора Mt-РРазы.
6 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: В отчетном году проанализированы 33 вида грибов с секвенированными геномами, различающихся систематическим положением, жизненной формой и экологической нишей на наличие у них пролин-специфичных пептидаз (ПСП). Показано, что некоторые из обнаруженных ПСП являются таксоноспецифичными. Все найденные ПСП охарактеризованы относительно функциональных групп активного центра, наличия пре- и про- последовательностей, а также трансмембранного сегмента, что облегчает понимание механизма их действия и выполняемых ими функций. Проведены аннотации и сравнение генов цистеиновых пептидаз (ЦП) в новосеквенированных геномах насекомых в рамках глобального i5K проекта. Полученные данные показали, что экспансия генов ЦП и появление большого количества видоспецифичных ЦП, характерна для тех видов насекомых, у которых эти пептидазы участвуют в пищеварении. Аннотация генов ЦП в геноме колорадского жука Leptinotarsa decemlineata, у которого ЦП являются главными пищеварительными пептидазами, показала, что они представлены максимальным количеством копий, выявленных у насекомых – более 50, из них 28 являются «видоспецифическими». Продолжено изучение пептидаз жуков - тенебрионид. Показано, что ЦП и пролин-специфичные пептидазы участвуют в гидролизе трудногидролизуемых главных пищевых белков тенебрионид – глиадинов. Исследована функциональная значимость комплексообраования с пирофосфатазой для трех белков в бактерии Escherichia coli: фосфоглюкомутазы купинового типа, фруктозо-бисфосфатальдолазы класса I и глутаматдекароксилазы. Проведен анализ генов пирофосфатаз семейства II и предложена классификация внутри этого семейства по структурным признакам. В результате проведенных работ получены новые, важные данные о генах, строении и свойствах пролин-специфичных пептидаз (ПСП) фитопатогенов – мицелиальных грибов, цистеиновых пептидаз (ЦП) насекомых – широко распространенных вредителей важнейших с/х культур, а также пирофосфатаз. Поставленные на 2018 г. задачи выполнены полностью. Полученные результаты важны для оценки возможности использования пептидаз и пирофосфатаз в медицине, а также использования пептидаз для получения пищевых продуктов, не содержащих глютен, и разработки подходов к повышению устойчивости растений к насекомым-вредителям и фитопатогенам.
7 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Определены активности различных пролин-специфичных пептидаз (ПСП) в культуральных жидкостях и клеточных экстрактах пяти видов алкалофильных и алкалотолерантных мицелиальных дикариомицетов из семейства Plectosphaerellaceae (Glomerellales; Sordariomycetes) и одного алкалотолерантного вида из семейства Hypocreaceae (Hypocreales; Sordariomycetes). Все найденные активности имеют оптимум в пределах рН 7-8, но при этом устойчивы в диапазоне pH 5.0-12.0. Результаты ингибиторного анализа выявили, что DPP4 и PАP являются классическими сериновыми пептидазами, тогда как CND относится к классу металлопептидаз. Проведены аннотации и сравнительное изучение генов цистеиновых пептидаз (ЦП) в новосеквенированных геномах перепончатокрылых насекомых Athalia rosae и Orussus abietinus в рамках глобального i5K проекта.Разработаны селективные и высокоспецифичные пептидные субстраты ЦП семейства папаина и предложен метод прямой пост-электрофоретической детекции активности ЦП с использованием этих субстратов. Предложен метод получения рекомбинантных белков семейства S9 сериновых пролин-специфичных пептидаз и охарактеризован препарат рекомбинантной дипептидил пептидазы 4 (rTmDPP 4) Tenebrio molitor, полученный этим способом. На основании виртуального скрининга более 2 миллионов соединений и анализа доступных кристаллических структур пирофосфатазы из M. tuberculosis предложены ее потенциальные модуляторы. Соединения с наибольшим сродством по оценочной функции, связывающиеся в активном центре, сходны друг с другом по структуре и конформации. Действие нескольких новых ингибиторов и активаторов на пирофосфатазу из M. tuberculosis подтверждено прямыми измерениями активности. Ингибиторы представляют собой α-аминофосфонаты, производные 1-аминонафталин-5-сульфокислоты, АТР, фруктозо-1-фосфат и малат. Минимальная величина IC50 составила 7 мкМ. Соединение ARG-ANSA с пропильным заместителем в сульфамидной части является наиболее является перспективной стартовой молекулой для конструирования мощных и селективных ингибиторов пирофосфатазы из M. tuberculosis на пути создания новых терапевтических средств против туберкулеза. Обоснован механизм действия регуляторов пирофосфатазы из M. tuberculosis за счет связывания в активном и двух аллостерических центрах. Обнаруженные аллостерические центры находятся в низкоконсервативных зонах контакта субъединиц, что может обусловить высокую селективность связывающихся в них ингибиторов в общем ряду пирофосфатаз семейства I.
8 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Биоинформатический поиск гомологов субтилизин-подобных пептидаз (СПП), представляющих интерес ввиду наличия у некоторых из них активности в отношении богатых глутамином белков клейковины злаков, показал их наличие в геномах всех выбранных видов грибов (42 вида), при этом общее их число варьировало от 1 у Taphrina deformans до 31 у энтомопатогенного Metarhizium anisopliae. У всех видов, кроме T. deformans, были обнаружены гомологи СПП из семейства кексина, их число в пределах одного генома варьировало от 1 до 2; у всех видов, кроме Hypocrella siamensis, были обнаружены гомологи СПП из группы протеиназы K, наиболее перспективные с точки зрения постглутаминовой пептидазной активности, их количество в пределах вида варьировало до 1 до 19 (M. anisopliae). У 22 видов обнаружены гомологи СПП группы пиролизина и только у 3 видов – семейства OSP. Большинство обнаруженных последовательностей несёт N-концевой сигнальный пептид, гомологи кексина также содержат один трансмембранный домен в C-концевой трети последовательности; их предположительной локализацией является аппарат Гольджи. Гомологи пиролизина, OSP и протеиназы K, вероятнее всего, являются секретируемыми ферментами и выполняют трофическую функцию. Полученные данные показали, что количество гомологов СПП конкретного вида в основном определяется экологией, а не таксономией; наибольшее разнообразие СПП обнаружено у патогенных и паразитарных грибов. Найденное количество гомологов хорошо коррелировало с определением постглутамин-расщепляющей активности у изученных видов грибов: эта активность, определенная у патогенов растений и насекомых, в 4 раза превосходила активность, найденную у сапротрофных грибов. Проведены аннотации и сравнительное изучение генов цистеиновых пептидаз (ЦП) в новосеквенированном геноме злейшего всеядного вредителя из отряда клопов, Halyomorpha halys, в рамках глобального i5K проекта. У этого клопа была выявлена множественность генов ЦП (41 ген), что указывает на интенсивную дупликацию этих генов в эволюции и подтверждает участие ЦП в пищеварительном процессе. Опубликованы данные по сравнительной аннотации ЦП в геномах двух перепончатокрылых – паразитоида и эусоциального насекомых. Получен патент на разработанные нами пептидные глутамин-содержащие субстраты цистеиновых пептидаз семейства папаина и опубликованы данные по их синтезу и использованию для селективного тестирования ЦП в сложных многокомпонентных природных смесях, таких как содержимое пищеварительных органов тенебрионид. Подробно описаны свойства всех найденных в геноме человека пролин-специфичных пептидаз. Для оценки роли комплексов ферментов в регуляции метаболизма бактерий Escherichia coli были оценены концентрации четырех ферментов (пирофосфатазы, фосфоглюкозоизомеразы, фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазыи глутаматдекарбоксилазы) в клетке на основании литературных данных. Только пирофосфатаза является конститутивным ферментом, и ее концентрация самая большая – 3-11 мкМ. Концентрация фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы варьирует от 0,01 мкм в отсутствие глюкозы до 0,28 мкМ в ее присутствии. Концентрация фосфоглюкозоизомеразы самая низкая и не превышает 0,05 мкМ в различных условиях. Экспериментально измерены прочности образующихся комплексов и их активности. Основываясь на этих оценках, пирофосфатаза является наиболее важным регулятором в клетке. Пара пирофосфатаза/фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза представляет наибольший интерес, поскольку накопление фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы при индукции ее биосинтеза будет приводить к ингибированию пирофосфатазы и, следовательно, накоплению пирофосфата, который является ингибитором биосинтеза. Такое же ингибирование биосинтеза по принципу обратной связи может происходить и в случае глутаматдекарбоксилазы. Определены ростовые характеристики штаммов кишечной палочки с нокаутными и суперпродуцирующими генами четырех ферментов.
9 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Проведен филогенетический анализ для гомологов аминопептидаз P1 (АРР1) и цитозольной неспецифичной дипептидазы (CND) у 42 видов грибов. Всего обнаружен 51 гомолог APP и 86 гомологов CND. Проведен анализ доменных структур у гомологов исследованных пептидаз APP1 и CND. Проведены аннотации и сравнительное изучение генов цистеиновых пептидаз (ЦП) и пролин-специфичных пептидаз (ПСП) в новосеквенированном геноме жука - вредителя запасов зерновых культур Rhizopertha dominica в рамках глобального i5K проекта. Выделена и охарактеризована главная пищеварительная пептидаза жука Tribolium castaneum катепсин L. Получен и охарактеризован рекомбинантный препарат протеолитически активного гомолога сериновой пептидазы SerPH122 Tenebrio molitor. Описаны три методики измерения активности неорганической пирофосфатазы – распространенного фермента, превращающего пирофосфат в фосфат и контролирующего более 200 биосинтетических реакций в клетке, сопровождающихся образованием пирофосфата. Все методики ориентированы на достижения высокой чувствительности, позволяющей работать с низкими концентрациями субстрата. Две методики основаны на измерении продукта гидролиза, фосфата, одна - на измерении пирофосфата, образующегося из фосфата в обратной реакции синтеза. Непрерывный метод измерения гидролитической активности основан на образовании интенсивно окрашенного комплекса фосфомолибденовой кислоты с красителем метиловым зеленым. Соответствующая установка состоит из перистальтического насоса, обеспечивающего смешивание образца с двумя реагентами, проточного фотометра и самописца. Чувствительность достаточна для записи кривой гидролиза 0,5 мкм субстрата. Микрометод определения фосфата использует аналогичную цветную реакцию с малахитовым зеленым и измеряет накопление фосфата через фиксированное время ферментативной реакции. Использование сопряженной ферментной системы АТР-сульфурилаза+аденозинфосфосульфат/ люцифераза+люциферин позволяет измерять синтез пирофосфата в непрерывном режиме и «по точкам во времени». Подобраны оптимальные концентрации реагентов для определения фосфата и пирофосфата.
10 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Филогенетический анализ распространения гомологов сериновой дипептидилпептидазы 4 (DPP4) среди аскомицетных и базидиальных видов грибов показал наличие двух крупных кластеров гомологов, соответствующие секретируемым и встроенным в клеточную мембрану формам фермента. Данный тип DPP4 присутствует у всех исследованных в работе видов грибов и может быть потенциально использован для нужд филогенетического анализа. Ген лейцинаминопептидазы (LAP) присутствует в геномах в единственной копии. При этом последовательность LAP обнаружена в геномах всех исследованных базидиомицетов, в то время как среди аскомицетов была встречена лишь дважды. Сравнительное изучение генов цистеиновых пептидаз (ЦП) в геномах жуков - вредителей запасов зерновых культур Tribolium madens и Tribolium castaneum. Оба жука имеют ортологичные главные пищеварительные ЦП с максимальным уровнем экспрессии. Получены и охарактеризованы рекомбинантные препараты главной пищеварительной ЦП личинок T. castaneum. Изучено их гидролитическое действие на 8-, 10-, 26- и 33-членные иммуногенные пептиды глиадинов. Полученные результаты показали, что rTcCathL1 (катепсин L) является эффективной пептидазой, которую можно использовать для разработки препарата для ферментной терапии различных типов целиакии (неперевариваемость глютена). Продолжено изучение митохондриальной пирофосфатазы из дрожжей Hausenula polimorpha. Определено влияние ряда клеточных метаболитов на ферментативную активность белка. Обнаружено, что аминокислота аргинин при физиологических концентрациях ингибирует этот фермент. Было проведено гомологичное моделирование структур митохондриальных пирофосфатаз H. polymorpha и человека. Получены предварительные результаты по кристаллизации апоформы митохондриальной пирофосфатазы H. polymorpha. Определены каталитические характеристики цитоплазматической и митохондриальной РРаз H. polymorpha, параметры взаимодействия этих белков с рядом клеточных эффекторов. Были получены генетические конструкции для экспрессии мутантных вариантов митохондриальной пирофосфатазы H. polymorpha с заменами, соответствующими патогенным мутациям в белке человека. Один из мутантных вариантов (Glu252Pro, соответствующий мутации Gln294Pro у человека) был выделен в нативной и тагированной формах и охарактеризован; его активность практически не отличается от активности фермента дикого типа, но набор белков, с которыми белок взаимодействует в цельном дрожжевом лизате, отличается от такого набора для белка дикого типа. Клонированы гены митохондриальных пирофосфатаз из пекарских дрожжей и человека в делетированной форме (без сигнального пептида) и получены генно-инженерные конструкции на основе плазмиды рЕТ-42, позволяющие нарабатывать большие количества целевого белка в клетках E. coli. Отработаны методы очистки белков. Методом сайт направленного мутагенеза получены четыре мутантных гена для митохондриальной пирофосфатазы пекарский дрожжей и шесть для митохондриальной пирофосфатазы человека. Методами быстрой кинетики (“rapid-quench” и “pulse-chase”) с радиоактивно-меченным пирофосфатом показано, что стадия гидролиза является скорость-лимитирующей у мембранных пирофосфатаз-переносчиков ионов Na+. Хотя ионы Na+ необходимы для стадии гидролиза, их присутствие не требуется на стадии связывания субстрата (пирофосфата). Обнаружено, что замена Н2О на D2O одинаково уменьшает скорость гидролиза Na+- и Н+-транспортирующими мембранными пирофосфатазами, причем этот эффект был значительно больше, чем для нетранспортирующих растворимых пирофосфатаз. Показано также, что Na+-транспортирующая пирофосфатаза из Thermotoga maritima проявляет, как и другие мембранные пирофосфатазы, отрицательную кинетическую кооперативность в реакции гидролиза, а также зависимость от общекислотного катализа. Эти данные указывают на ключевую роль протона, генерируемого из молекулы воды при гидролизе пирофосфата, в осуществлении транспорта как Н+, так и Na+. На основании собственных и литературных данных сформулирован механизм сопряжения гидролиза пирофосфата с транспортом ионов. Согласно этому механизму, мембранная пирофосфатаза является первым первым неоксидоредуктазным мембранным протонным насосом с «прямым» сопряжением химической реакции с транспортом через мембрану. Этот тип сопряжения означает, что переносимый протон является прямым продуктом химической реакции. Развивая эту идею, мы сформулировали также «бильярдный» механизм транспорта Na+, согласно которому он выталкивается этим протоном из ион-транспортного канала. Таким образом, в основе транспорта ионов Н+ и Na+ лежит единый механизм. Полученные результаты могут в дальнейшем использоваться в медицине для энзимотерапии целиакии (неперевариваемость глютена) и получения пищевых продуктов, не содержащих в своем составе глютен, для создания ингибиторов мембранных пирофосфатаз патогенных микроорганизмов, а также для разработки подходов для повышения устойчивости растений к насекомым-вредителям, фитопатогенам и абиотическому стрессу.
11 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: С целью изучения факторов патогенности грибов проведен анализ особенностей распространения гомологов кислой эндопротеазы (EPR) внутри царства грибов. Методом биоинформатического анализа у 35 исследованных видов грибов обнаружено 115 гомологов кислой эндопротеазы (EPR). Средний размер гомологов EPR составляет 550 а.о. Бóльшая часть обнаруженных гомологов электронейтральна в диапазоне pH 4,5-5,7, однако у двух гомологов EPR изоэлектрическая точка лежит в слабощелочной области: Moelleriella libera (pI 7,21) и Drechslerella stenobrocha (pI 8,13). Общее число гомологов EPR в геномах одного вида грибов варьирует от 1 до 14. Проведенный филогенетический анализ показал, что на кладограмме можно выделить две крупные группы гомологов EPR, обозначенные нами как EPR1 и EPR2. Последовательности из группы EPR1 встречаются в геномах некоторых таксономических групп, а именно у сумчатых грибов классов Sordariomycetes, Eurotiomycetes, Leotiomycetes и Dothideomycetes подотдела Pezizomycotina и у базидиальных грибов классов Dacrymycetes, Agaricomycetes подотдела Agaricomycotina. Внутри кластера гомологов EPR1 наблюдается серия дупликаций данного гена, происходящих как на уровне порядков (Magnaporthales), так и на уровне отдельных родов и видов (Torrubiella hemipterigena, Mycosphaerella graminicola) с последующей утратой консервативных аминокислотных остатков у отдельных паралогов. Подобный паттерн может свидетельствовать об активном использовании данного фермента как экзофермента в трофических целях. Группа EPR2 представлена меньшим числом обнаруженных гомологов и отличается меньшей средней и максимальной копийностью в геноме. В отличие от EPR1, последовательности данной группы гомологов отмечены также в геномах базальных подотделов сумчатых (Taphrina deformans) и базидиальных (Ustilago maydis) грибов, а также у Drechslerella stenobrocha, представителя класса Orbiliomycetes. Можно предположить, что группа EPR2 является более эволюционно консервативной, в то время как EPR1 сформировалась в эволюции позднее и, возможно, распространилась среди неродственных групп грибов путём горизонтального переноса. За отчетный период была закончена характеристика 4-х мутантных форм главной пищеварительной цистеиновой пептидазы личинок жука-вредителя пищевых запасов Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae), выбрана форма с наиболее высокой стабильностью в кислой среде желудка человека и подана заявка на патент для последующего использования её в составе препарата для энзимотерапии целиакии и других форм непереносимости глютена, правообладателем которого является Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова. Заявка прошла экспертизу, зарегистирована, и патент находится на стадии оформления. В результате биоинформатического анализа обширного объединенного транскриптома Tenebrio molitor выявлено 269 последовательностей сериновых пептидаз семейства химотрипсина S1, из которых 137 предположительно являются активными пептидазами, 125 с заменами в каталитической триаде представляют собой неактивные гомологи сериновых пептидаз, а 7 последовательностей обладают сложной доменной организацией с двумя или тремя собственно пептидазными доменами. Все пептидазы аннотированы на основании структуры субстрат-связывающего сайта. Получен и охарактеризован по физико-химическим и энзиматическим свойствам рекомбинантный препарат пищеварительной химотрипсиноподобной пептидазы с неканонической структурой субстрат-связывающего сайта из кишечника личинок Tenebrio molitor. Поиск по ядерному геному термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha с использованием в качестве шаблона последовательности митохондриальной пирофосфатазы пекарских дрожжей обнаружил гены двух пирофосфатаз семейства I на хромосомах IV и VII. С помощью программы DeepMito предсказано митохондриальная локализация только для одной из пирофосфатаз. Ее последовательность на 8 остатков длиннее, чем у немитохондриального фермента за счет неканонического сигнального пептида на N-конце. Рекомбинантный митохондриальный фермент получен в высокоочищенном виде с помощью двух стадий хроматографии и закристаллизован. Пространственная структура димерного фермента определена с разрешением 1,8 ангстрема методом рентгеноструктурного анализа. Обнаружено, что структуры субъединиц совпадают в пределах 0,4 ангстрема. Зона контакта субъединиц практически симметрична и образована следующими остатками в порядке убывания значимости: Trp59 > Tyr91 > Phe287 > Pro92 > Pro188 > His94 > Arg135 > Asn283. Активные центры фермента содержат по два иона магния, которые удерживаются остатками аспарагиновой кислоты 124, 129 и 161 бидентатно и монодентатно. На основании гомологии с митохондриальной пирофосфатазой человека обнаружена консервативность 6 из 8 аминокислотных остатков, мутации которых у человека связана с синдромом внезапной смерти. Два из этих остатков принадлежат активному центру, один – зоне контакта субъединиц. Анализ структуры дрожжевого фермента показал таким образом, что она является хорошей моделью для изучения молекулярных основ синдрома внезапной смерти.
12 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа:
13 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен
2. Тезисы доклада Roma_ABstract.pdf 159,3 КБ 18 сентября 2020 [baykov]
3. Отчет по ГОСТ 2020 г project_report_gost_2020.pdf 39,3 КБ 17 декабря 2020 [baykov]
4. Otdel_belkov_rastenij_Publikatsii-2020-1_1.docx Otdel_belkov_rastenij_Publikatsii-2020-1_1.docx 27,8 КБ 1 декабря 2020 [BelozerskyMA]
5. project_report_gost_2023.pdf project_report_gost_2023.pdf 51,4 КБ 17 декабря 2023 [BelozerskyMA]