Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментовНИР

Structure, mechanism, role and bioengineering of hydrolytic enzymes

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
2 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Было продолжено исследование бинарных комплексов в системе неорганическая пирофосфатаза (РРаза), фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза (FbaB), глутаматдегидрогеназа (GadA) и 5-кето-4-дезоксиуронатизомераза (KduI) из бактерии Escherichia coli. Было измерено влияние белков-партнеров на каталитические параметры FbaB и KduI и было обнаружено, что РРаза значительно активирует FbaB (на порядок); степень активации зависит от концентрации РРазы, в соответствии с этой зависимостью константа диссоциации комплекса составила 2,1 мкМ. Показано, что активирующее влияние РРазы на FbaB определяется снижением константы Михаэлиса от 18 до 2 мМ, в то время как каталитическая константа практически не изменяется. GadA также существенно активирует FbaB, однако, в отличие от РРазы, данный эффект определяется увеличением каталитической константы. Показано, что все белки-партнеры активируют KduI, увеличивая каталитическую константу на порядок без заметного изменения константы Михаэлиса. Константы диссоциации бинарных комплексов KduI составили 3,2 мкМ (РРаза), 4,2 мкМ (GadA), 14 мкМ (FbaB). Обнаружено, что ферментативную активность проявляет димерная форма KduI, в то время как превалирующий в физиологических условиях гексамер неактивен. Изучено влияние комплексообразования на олигомерное состояние белков-партнеров. Показано, что в системе GadA:РРаза происходит диссоциация обоих гексамерных партнеров: РРазы - до тримера, GadA - до димера. Для характеристики комплексов был использован метод малоуглового рентгеновского рассеяния. В настоящее время обработаны наборы, снятые для индивидуальных белков. Показано, что кривые рассеяния РРазы, GadA и KduI соответствуют кристаллическим структурам, а FbaB - теоретической модели, предложенной нами ранее. Продолжено сравнительное изучение инсерционных мутантов табака, содержащих синтетический ген ингибитора сериновых протеиназ гречихи в составе векторных конструкций разного дизайна. Полученные факты свидетельствуют о повышении устойчивости трансгенных растений с ингибитором протеиназ к фитопатогенам в опытах in vitro и обнаруженных противоречиях в опытах in vivo. Возможно, это связано с наличием целевого белка в экстрактах тканей и недостаточности его количнества для защиты от фитопатогенов в опытах in vivo, а также возможном явлении замолкания чужеродных генов или изменении сигнальных путей защитных реакций растения при введении трансгена любой природы, что требует дальнейшего изучения и полного скрининга полученных коллекций инсерционных мутантов табака и арабидопсиса в наших коллекциях. Изучение мутуалистической системы «грибной сад», образованной муравьями, принадлежащими к разным родам и видам трибы Attini, и грибом L. gongylophorus, выявило интересную закономерность: величина активности пептидаз коррелировала со степенью эволюционной «прогрессивности» видов муравьев. В водных смывах мицелия из колоний низших муравьев регистрировалась сравнительно низкая активность как сериновых, так и металлопротеиназ, в то время как грибные симбионты высших муравьев и муравьев-листорезов преимущественно секретировали пептидазы, принадлежащие к одному из классов. Грибные симбионты муравьев-листорезов секретировали, в основном, металлопротеиназы, в то время как в колониях высших муравьев регистрировалась преимущественно активность сериновых пептидаз. Выявленное распределение активности может указывать на связь между филогенетическим положением штаммов гриба и спектром секретируемых ими ферментов. Проведен подробный биоинформатический анализ наборов пролин-специфичных пептидаз в транскриптомах кишечников личинок T. molitor и T. castaneum с использованием баз данных, полученных на платформе Illumina. Исследованы физико-химические и энзиматические свойства идентифицированной дипептидил-пептидазы IV из T. molitor. Исследованы изменения уровней экспрессии сериновых и цистеиновых пептидаз в транскриптоме кишечника личинок T. molitor под действием энтомоцидного токсина Cry3Aa из Bacillus thuringiensis.
3 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Описана группа из 46 бактериальных и одного архейного белков, которые лишь отдаленно напоминают известные мембранные пирофосфатазы, но имеют полный набор из 12 полярных остатков, контактирующих с субстратом, нуклеофильной молекулой воды и 5 ионами магния в канонических мембранных пирофосфатазах. Они также содержат остаток лизина, определяющий зависимость фермента от ионов К+. Два новых белка (из Chlorobium limicola и Cellulomonas fimi) были экспрессированы в E. coli и показали электрогенный транспорт Н+, но не Na+ в обращенных мембранных везикулах. Уникальные особенности новых пирофосфатаз включают ингибирование ионами Na+ и ингибирование или активацию ионами К+. Кинетический анализ гидролиза пирофосфата в широких диапазонах концентраций кофактора (Mg2+) и субстрата (Mg2PPi) показал, что ионы щелочных металлов вытесняют Mg2+ из комплекса с ферментом, делая невозможным гидролиз субстрата. Таким образом, новые белки представляют собой новое семейство Н+-транспортирующих пирофосфатаз, которые частично унаследовали механизм регуляции ионами Na+ и K+ от предшественника - Na+-транспортирующей РРазы. В плане исследования бинарных комплексов в системе неорганическая пирофосфатаза (РРаза), фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза (FbaB), глутаматдегидрогеназа (GadA), 5-кето-4-дезоксиуронатизомераза (KduI) из E. coli было изучено влияние белков-партнеров на каталитические параметры FbaB и KduI. Было обнаружено, что РРаза значительно активирует FbaB (на порядок); степень активации зависит от концентрации РРазы, в соответствии с этой зависимостью Kd комплекса составила 2.1 мкМ. Показано, что активирующее влияние РРазы на FbaB определяется снижением Km (от 18 до 2 мМ), в то время как Vmax практически не изменяется. GadA также существенно активирует FbaB, однако, в отличие от РРазы, данный эффект определяется увеличением Vmax. Показано, что все белки-партнеры активируют KduI, увеличивая Vmax на порядок без заметного изменения Km. Константы диссоциации бинарных комплексов KduI составили 3.2 мкМ (РРаза), 4.2 мкМ (GadA), 14 мкМ (FbaB). Обнаружено, что ферментативную активность проявляет именно димерная форма KduI, в то время как превалирующий в физиологических условиях гексамер неактивен. Изучено влияние комплексообразования на олигомерное состояние белков-партнеров. Показано, что в системе GadA:РРаза происходит диссоциация обоих гексамерных партнеров: РРазы - до тримера, GadA - до димера. Для характеристики комплексов был использован метод малоуглового рентгеновского рассеяния. В настоящее время обработаны наборы, снятые для индивидуальных белков. Показано, что кривые рассеяния РРазы, GadA и KduI соответствуют кристаллическим структурам, а FbaB - теоретической модели, предложенной нами ранее. Проведен скрининг коллекций трансгенных растений табака с защитным геном ингибитора сериновых протеиназ из растений в составе векторных конструкций разного дизайна и их семенного потомства. Все проанализированные линии демонстрировали наличие/сохранение трансгенной вставки в ряде поколений и экспрессию введенного целевого гена. В опытах in vitro сок контрольных растений в меньшей степени подавлял рост газона бактерий, чем сок трансгенных растений из всех групп. В водных вытяжках мицелия грибного симбионта, полученного из «грибных садов», обнаружены четко выраженные буферные свойства (значение буферной емкости – около 20 мэкв/Л - сравнимо с буферной емкостью крови человека - 37 мэкв/Л). Оптимум активности протеиназ, секретируемых грибным симбионтом, совпадает с рН, поддерживаемым в грибном саду, что обеспечивает максимальную эффективность деградации белков в этой системе. Переход к обитанию в системе с насекомыми приводит к изменению рН оптимума активности пептидаз грибного симбионта Leucoagaricus gongylophorus с рН 6.0 до 5.2 (рН «грибного сада»). Проведено сравнение энзиматических и физико-химических свойств рекомбинантного препарата наиболее высоко экспрессируемого в кишечнике личинок жука-вредителя Tribolium castaneum цистеинового катепсина L со свойствами катепсинов L и В млекопитающих. Показано, что несмотря на сходство физико-химических свойств, лишь катепсин насекомого способен гидролизовать трудногидролизуемые пептиды главных пищевых белков жука – глиадинов. Сопоставление данных по анализу транскриптома, филогенетических взаимосвязей, ингибиторного анализа и других публичных данных позволило выявить ключевые цистеиновые пептидазы, которые Т. castaneum использует для переваривания пищи и, следовательно, новые потенциальные цели для биологического контроля этого вредителя пищевых запасов.
4 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Было продолжено исследование бинарных комплексов в системе неорганическая пирофосфатаза (РРаза), фруктозо-1,6-бисфосфат альдолаза (FbaB), глутаматдегидрогеназа (GadA), 5-кето-4- дезоксиуронатизомераза (KduI) и дигидролипоилдегидрогеназа (LpD) из E. coli. Было изучено влияние белковых партнеров на гидролитическую активность и олигомерное состояние РРазы. Обнаружено, что при инкубации в нейтральной среде (рН 6,5) присутствие GAD приводит к диссоциации РРазы на тримеры. При инкубации в кислой среде (рН 4,6) LpD защищает РРазу от диссоциации на тримеры; показано, что в нейтральной среде LpD активирует тримерную форму РРазы в 3-4 раза за счет увеличения Vmax. Все перечисленные белки были исследованы в растворе методом малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS). Для KduI, GadA и LpD было показано, что они образуют в растворе равновесную смесь олигомерных форм. Для FbaB была подтверждена декамерная форма, предложенная ранее. Для РРазы и KduI выявлены тонкие различия между структурой белка в кристалле и в растворе. Был получен препарат Se-Met FbaB, восстановленный под действием NaBH4. Препарат был закристаллизован, тестирована его дифракция и снят набор дифракционных данных. Однако качество дифракции не позволяет решить структуру с полученного набора. Проведены эксперименты по молекулярной динамике тримерной и гексамерной форм РРазы из M. tuberculosis. Отработана методика определения активности Mt-РРазы для микроанализа, которая может быть использована для скрининга широкого набора возможных ингибиторов. Проведен сравнительный анализ семян разных поколений выборочной группы трансгенных растений, содержащих целевой ген ингибитора сериновых протеиназ из гречихи (ISP) в составе разных векторных конструкций. Показано, что большинство проанализированных линий демонстрировали наличие/сохранение трансгенной вставки при длительном (более 10 лет) вегетативном размножении в неселективных условиях и в ряде поколений, а также экспрессию введенного целевого гена в опытах in vitro. Анализ экспрессии введенного гена ингибитора показал, что экстракты всех трансгенных растений с геном ингибитора протеиназ в значительной степени подавляли прорастание спор фитопатогенного гриба Aspergillus nidulans. Сравнительный анализ физико-химических и кинетических свойств секретируемых пептидаз мицелиальных грибов, принадлежащих к различным экологическим группам, показал, что трофическое поведение грибов определяет тип главной секретируемой пептидазы. Для энтомопатогенов - это сериновая пептидаза субтилизиноподобного типа, для сапротрофов – металлопептидаза, а для мутуалистов – тоже металлопептидаза, но активная по субстратам субтилизиноподобных пептидаз. Все изученные ферменты имели сходные рН и температурные стабильности и температурный оптимум, но четко различались в отношении оптимума рН (от 9 до 5,2), Была выделена, очищена и охарактеризована пролин-специфичная пептидаза большого мучного хрущака Tenebrio molitor. Она активно гидролизовала глиадины, являющиеся главными пищевыми белками этого насекомого-вредителя запасов зерновых и продуктов их переработки, а сочетание её с постглутамин-расщепляющей цистеиновой пептидазой тенебрионид в процессе гидролиза глиадинов обладало синергическим эффектом. Проведена аннотация пептидаз в геномах 6 видов насекомых - вредителей с/культур. Выявлены консервативные и видоспецифические группы их пищеварительных пептидаз - катепсинов.
5 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: В отчетном году был продолжен скрининг коллекции трансгенных растений табака с геном ингибитора сериновых протеиназ гречихи (ISP) и проведено пополнение коллекции трансгенных растений табака с геном ISP. Впервые получена серия трансгенных растений табака с геном антимикробного пептида из дикого вида пшеницы Triticum kiharae и геном дефензина из звездчатки. Показано, что введение гетерологичных растительных генов разной природы, используемых растением в разных механизмах защиты от фитопатогенов, приводит к примерно одинаковому повышению фитопатогенной активности тканей трансгенных растений табака. Была исследована адсорбция секретируемых пептидаз Cordyceps militaris и A. bisporus на кутикуле Nauphoeta cinerea. Установлено, что выращивание гриба на среде с кутикулой приводит к увеличению адсорбционной способности фермента по сравнению с пептидазами, секретируемыми в культуральную среду с желатиной. Эффективность адсорбции пептидаз гриба на кутикуле хозяина определяет и лучшую расщепляемость белков покровов, которая составляла 18% для фермента энтомопатогена C. militaris и только 9% для пептидазы сапротрофа A. bisporus. Полученные результаты указывают на большую приспособленность ферментов энтомопатогенных грибов к расщеплению белков покровов насекомых. Сравнение профилей экспрессии транскриптов в кишечниках личинок двух жуков, Tenebrio molitor и Tribolium castaneum, показало что транскриптомы их кишечников содержат 11 521 генов у T. castaneum и 17 871 генов у T. molitor, среди которых лишь 6907 генов были ортологами. Полученные данные иллюстрируют общие черты и различия, которые могут быть связаны с видообразованием и адаптацией насекомых к окружающей среде. Из кишечника личинок Tenebrio molitor был выделен и охарактеризован новый фермент пролидаза и показано, что он относится к пролидазам первого типа. В отчетный период мы обнаружили ингибирование пирофосфатазы фруктозо-1-фосфатом (Fru-1-P). Для идентификации места связывания ингибитора на ферменте были получены пять мутантных форм фермента с единичной или двойной заменами аминокислотных остатков, входящих в аллостерический регуляторный центр пирофосфатазы. Устойчивость к ингибитору мутантных форм пирофосфатазы подтвердила участие Lys112, Lys115 и Arg48 в связывании ингибитора. Таким образом, Fru-1-P является физиологическим ингибитором пирофосфатазы, действующим через регуляторный центр фермента. Фруктозобисфосфатальдолаза (Fba) образует in vivo комплекс с пирофосфатазой. Для определения пространственной структуры Fba был получен белок, в котором все остатки метионина были замещены на селенометионин. Для определения структуры была использована рентгеновская съемка суспензии мелких кристаллов («серийная кристаллография») и получены первые обнадеживающие результаты. Метод определения фосфата модифицирован для целей высокопроизводительного скрининга ингибиторов в малых объёмах реакционных смесей. Среди большого числа предсказанных эффекторов пирофосфатазы Mycobacterium tuberculosis (Mt-РРазы) найдены 35 активаторов и два ингибитора Mt-РРазы.
6 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: В отчетном году проанализированы 33 вида грибов с секвенированными геномами, различающихся систематическим положением, жизненной формой и экологической нишей на наличие у них пролин-специфичных пептидаз (ПСП). Показано, что некоторые из обнаруженных ПСП являются таксоноспецифичными. Все найденные ПСП охарактеризованы относительно функциональных групп активного центра, наличия пре- и про- последовательностей, а также трансмембранного сегмента, что облегчает понимание механизма их действия и выполняемых ими функций. Проведены аннотации и сравнение генов цистеиновых пептидаз (ЦП) в новосеквенированных геномах насекомых в рамках глобального i5K проекта. Полученные данные показали, что экспансия генов ЦП и появление большого количества видоспецифичных ЦП, характерна для тех видов насекомых, у которых эти пептидазы участвуют в пищеварении. Аннотация генов ЦП в геноме колорадского жука Leptinotarsa decemlineata, у которого ЦП являются главными пищеварительными пептидазами, показала, что они представлены максимальным количеством копий, выявленных у насекомых – более 50, из них 28 являются «видоспецифическими». Продолжено изучение пептидаз жуков - тенебрионид. Показано, что ЦП и пролин-специфичные пептидазы участвуют в гидролизе трудногидролизуемых главных пищевых белков тенебрионид – глиадинов. Исследована функциональная значимость комплексообраования с пирофосфатазой для трех белков в бактерии Escherichia coli: фосфоглюкомутазы купинового типа, фруктозо-бисфосфатальдолазы класса I и глутаматдекароксилазы. Проведен анализ генов пирофосфатаз семейства II и предложена классификация внутри этого семейства по структурным признакам. В результате проведенных работ получены новые, важные данные о генах, строении и свойствах пролин-специфичных пептидаз (ПСП) фитопатогенов – мицелиальных грибов, цистеиновых пептидаз (ЦП) насекомых – широко распространенных вредителей важнейших с/х культур, а также пирофосфатаз. Поставленные на 2018 г. задачи выполнены полностью. Полученные результаты важны для оценки возможности использования пептидаз и пирофосфатаз в медицине, а также использования пептидаз для получения пищевых продуктов, не содержащих глютен, и разработки подходов к повышению устойчивости растений к насекомым-вредителям и фитопатогенам.
7 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Определены активности различных пролин-специфичных пептидаз (ПСП) в культуральных жидкостях и клеточных экстрактах пяти видов алкалофильных и алкалотолерантных мицелиальных дикариомицетов из семейства Plectosphaerellaceae (Glomerellales; Sordariomycetes) и одного алкалотолерантного вида из семейства Hypocreaceae (Hypocreales; Sordariomycetes). Все найденные активности имеют оптимум в пределах рН 7-8, но при этом устойчивы в диапазоне pH 5.0-12.0. Результаты ингибиторного анализа выявили, что DPP4 и PАP являются классическими сериновыми пептидазами, тогда как CND относится к классу металлопептидаз. Проведены аннотации и сравнительное изучение генов цистеиновых пептидаз (ЦП) в новосеквенированных геномах перепончатокрылых насекомых Athalia rosae и Orussus abietinus в рамках глобального i5K проекта.Разработаны селективные и высокоспецифичные пептидные субстраты ЦП семейства папаина и предложен метод прямой пост-электрофоретической детекции активности ЦП с использованием этих субстратов. Предложен метод получения рекомбинантных белков семейства S9 сериновых пролин-специфичных пептидаз и охарактеризован препарат рекомбинантной дипептидил пептидазы 4 (rTmDPP 4) Tenebrio molitor, полученный этим способом. На основании виртуального скрининга более 2 миллионов соединений и анализа доступных кристаллических структур пирофосфатазы из M. tuberculosis предложены ее потенциальные модуляторы. Соединения с наибольшим сродством по оценочной функции, связывающиеся в активном центре, сходны друг с другом по структуре и конформации. Действие нескольких новых ингибиторов и активаторов на пирофосфатазу из M. tuberculosis подтверждено прямыми измерениями активности. Ингибиторы представляют собой α-аминофосфонаты, производные 1-аминонафталин-5-сульфокислоты, АТР, фруктозо-1-фосфат и малат. Минимальная величина IC50 составила 7 мкМ. Соединение ARG-ANSA с пропильным заместителем в сульфамидной части является наиболее является перспективной стартовой молекулой для конструирования мощных и селективных ингибиторов пирофосфатазы из M. tuberculosis на пути создания новых терапевтических средств против туберкулеза. Обоснован механизм действия регуляторов пирофосфатазы из M. tuberculosis за счет связывания в активном и двух аллостерических центрах. Обнаруженные аллостерические центры находятся в низкоконсервативных зонах контакта субъединиц, что может обусловить высокую селективность связывающихся в них ингибиторов в общем ряду пирофосфатаз семейства I.
8 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Биоинформатический поиск гомологов субтилизин-подобных пептидаз (СПП), представляющих интерес ввиду наличия у некоторых из них активности в отношении богатых глутамином белков клейковины злаков, показал их наличие в геномах всех выбранных видов грибов (42 вида), при этом общее их число варьировало от 1 у Taphrina deformans до 31 у энтомопатогенного Metarhizium anisopliae. У всех видов, кроме T. deformans, были обнаружены гомологи СПП из семейства кексина, их число в пределах одного генома варьировало от 1 до 2; у всех видов, кроме Hypocrella siamensis, были обнаружены гомологи СПП из группы протеиназы K, наиболее перспективные с точки зрения постглутаминовой пептидазной активности, их количество в пределах вида варьировало до 1 до 19 (M. anisopliae). У 22 видов обнаружены гомологи СПП группы пиролизина и только у 3 видов – семейства OSP. Большинство обнаруженных последовательностей несёт N-концевой сигнальный пептид, гомологи кексина также содержат один трансмембранный домен в C-концевой трети последовательности; их предположительной локализацией является аппарат Гольджи. Гомологи пиролизина, OSP и протеиназы K, вероятнее всего, являются секретируемыми ферментами и выполняют трофическую функцию. Полученные данные показали, что количество гомологов СПП конкретного вида в основном определяется экологией, а не таксономией; наибольшее разнообразие СПП обнаружено у патогенных и паразитарных грибов. Найденное количество гомологов хорошо коррелировало с определением постглутамин-расщепляющей активности у изученных видов грибов: эта активность, определенная у патогенов растений и насекомых, в 4 раза превосходила активность, найденную у сапротрофных грибов. Проведены аннотации и сравнительное изучение генов цистеиновых пептидаз (ЦП) в новосеквенированном геноме злейшего всеядного вредителя из отряда клопов, Halyomorpha halys, в рамках глобального i5K проекта. У этого клопа была выявлена множественность генов ЦП (41 ген), что указывает на интенсивную дупликацию этих генов в эволюции и подтверждает участие ЦП в пищеварительном процессе. Опубликованы данные по сравнительной аннотации ЦП в геномах двух перепончатокрылых – паразитоида и эусоциального насекомых. Получен патент на разработанные нами пептидные глутамин-содержащие субстраты цистеиновых пептидаз семейства папаина и опубликованы данные по их синтезу и использованию для селективного тестирования ЦП в сложных многокомпонентных природных смесях, таких как содержимое пищеварительных органов тенебрионид. Подробно описаны свойства всех найденных в геноме человека пролин-специфичных пептидаз. Для оценки роли комплексов ферментов в регуляции метаболизма бактерий Escherichia coli были оценены концентрации четырех ферментов (пирофосфатазы, фосфоглюкозоизомеразы, фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазыи глутаматдекарбоксилазы) в клетке на основании литературных данных. Только пирофосфатаза является конститутивным ферментом, и ее концентрация самая большая – 3-11 мкМ. Концентрация фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы варьирует от 0,01 мкм в отсутствие глюкозы до 0,28 мкМ в ее присутствии. Концентрация фосфоглюкозоизомеразы самая низкая и не превышает 0,05 мкМ в различных условиях. Экспериментально измерены прочности образующихся комплексов и их активности. Основываясь на этих оценках, пирофосфатаза является наиболее важным регулятором в клетке. Пара пирофосфатаза/фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза представляет наибольший интерес, поскольку накопление фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы при индукции ее биосинтеза будет приводить к ингибированию пирофосфатазы и, следовательно, накоплению пирофосфата, который является ингибитором биосинтеза. Такое же ингибирование биосинтеза по принципу обратной связи может происходить и в случае глутаматдекарбоксилазы. Определены ростовые характеристики штаммов кишечной палочки с нокаутными и суперпродуцирующими генами четырех ферментов.
9 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Проведен филогенетический анализ для гомологов аминопептидаз P1 (АРР1) и цитозольной неспецифичной дипептидазы (CND) у 42 видов грибов. Всего обнаружен 51 гомолог APP и 86 гомологов CND. Проведен анализ доменных структур у гомологов исследованных пептидаз APP1 и CND. Проведены аннотации и сравнительное изучение генов цистеиновых пептидаз (ЦП) и пролин-специфичных пептидаз (ПСП) в новосеквенированном геноме жука - вредителя запасов зерновых культур Rhizopertha dominica в рамках глобального i5K проекта. Выделена и охарактеризована главная пищеварительная пептидаза жука Tribolium castaneum катепсин L. Получен и охарактеризован рекомбинантный препарат протеолитически активного гомолога сериновой пептидазы SerPH122 Tenebrio molitor. Описаны три методики измерения активности неорганической пирофосфатазы – распространенного фермента, превращающего пирофосфат в фосфат и контролирующего более 200 биосинтетических реакций в клетке, сопровождающихся образованием пирофосфата. Все методики ориентированы на достижения высокой чувствительности, позволяющей работать с низкими концентрациями субстрата. Две методики основаны на измерении продукта гидролиза, фосфата, одна - на измерении пирофосфата, образующегося из фосфата в обратной реакции синтеза. Непрерывный метод измерения гидролитической активности основан на образовании интенсивно окрашенного комплекса фосфомолибденовой кислоты с красителем метиловым зеленым. Соответствующая установка состоит из перистальтического насоса, обеспечивающего смешивание образца с двумя реагентами, проточного фотометра и самописца. Чувствительность достаточна для записи кривой гидролиза 0,5 мкм субстрата. Микрометод определения фосфата использует аналогичную цветную реакцию с малахитовым зеленым и измеряет накопление фосфата через фиксированное время ферментативной реакции. Использование сопряженной ферментной системы АТР-сульфурилаза+аденозинфосфосульфат/ люцифераза+люциферин позволяет измерять синтез пирофосфата в непрерывном режиме и «по точкам во времени». Подобраны оптимальные концентрации реагентов для определения фосфата и пирофосфата.
10 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Филогенетический анализ распространения гомологов сериновой дипептидилпептидазы 4 (DPP4) среди аскомицетных и базидиальных видов грибов показал наличие двух крупных кластеров гомологов, соответствующие секретируемым и встроенным в клеточную мембрану формам фермента. Данный тип DPP4 присутствует у всех исследованных в работе видов грибов и может быть потенциально использован для нужд филогенетического анализа. Ген лейцинаминопептидазы (LAP) присутствует в геномах в единственной копии. При этом последовательность LAP обнаружена в геномах всех исследованных базидиомицетов, в то время как среди аскомицетов была встречена лишь дважды. Сравнительное изучение генов цистеиновых пептидаз (ЦП) в геномах жуков - вредителей запасов зерновых культур Tribolium madens и Tribolium castaneum. Оба жука имеют ортологичные главные пищеварительные ЦП с максимальным уровнем экспрессии. Получены и охарактеризованы рекомбинантные препараты главной пищеварительной ЦП личинок T. castaneum. Изучено их гидролитическое действие на 8-, 10-, 26- и 33-членные иммуногенные пептиды глиадинов. Полученные результаты показали, что rTcCathL1 (катепсин L) является эффективной пептидазой, которую можно использовать для разработки препарата для ферментной терапии различных типов целиакии (неперевариваемость глютена). Продолжено изучение митохондриальной пирофосфатазы из дрожжей Hausenula polimorpha. Определено влияние ряда клеточных метаболитов на ферментативную активность белка. Обнаружено, что аминокислота аргинин при физиологических концентрациях ингибирует этот фермент. Было проведено гомологичное моделирование структур митохондриальных пирофосфатаз H. polymorpha и человека. Получены предварительные результаты по кристаллизации апоформы митохондриальной пирофосфатазы H. polymorpha. Определены каталитические характеристики цитоплазматической и митохондриальной РРаз H. polymorpha, параметры взаимодействия этих белков с рядом клеточных эффекторов. Были получены генетические конструкции для экспрессии мутантных вариантов митохондриальной пирофосфатазы H. polymorpha с заменами, соответствующими патогенным мутациям в белке человека. Один из мутантных вариантов (Glu252Pro, соответствующий мутации Gln294Pro у человека) был выделен в нативной и тагированной формах и охарактеризован; его активность практически не отличается от активности фермента дикого типа, но набор белков, с которыми белок взаимодействует в цельном дрожжевом лизате, отличается от такого набора для белка дикого типа. Клонированы гены митохондриальных пирофосфатаз из пекарских дрожжей и человека в делетированной форме (без сигнального пептида) и получены генно-инженерные конструкции на основе плазмиды рЕТ-42, позволяющие нарабатывать большие количества целевого белка в клетках E. coli. Отработаны методы очистки белков. Методом сайт направленного мутагенеза получены четыре мутантных гена для митохондриальной пирофосфатазы пекарский дрожжей и шесть для митохондриальной пирофосфатазы человека. Методами быстрой кинетики (“rapid-quench” и “pulse-chase”) с радиоактивно-меченным пирофосфатом показано, что стадия гидролиза является скорость-лимитирующей у мембранных пирофосфатаз-переносчиков ионов Na+. Хотя ионы Na+ необходимы для стадии гидролиза, их присутствие не требуется на стадии связывания субстрата (пирофосфата). Обнаружено, что замена Н2О на D2O одинаково уменьшает скорость гидролиза Na+- и Н+-транспортирующими мембранными пирофосфатазами, причем этот эффект был значительно больше, чем для нетранспортирующих растворимых пирофосфатаз. Показано также, что Na+-транспортирующая пирофосфатаза из Thermotoga maritima проявляет, как и другие мембранные пирофосфатазы, отрицательную кинетическую кооперативность в реакции гидролиза, а также зависимость от общекислотного катализа. Эти данные указывают на ключевую роль протона, генерируемого из молекулы воды при гидролизе пирофосфата, в осуществлении транспорта как Н+, так и Na+. На основании собственных и литературных данных сформулирован механизм сопряжения гидролиза пирофосфата с транспортом ионов. Согласно этому механизму, мембранная пирофосфатаза является первым первым неоксидоредуктазным мембранным протонным насосом с «прямым» сопряжением химической реакции с транспортом через мембрану. Этот тип сопряжения означает, что переносимый протон является прямым продуктом химической реакции. Развивая эту идею, мы сформулировали также «бильярдный» механизм транспорта Na+, согласно которому он выталкивается этим протоном из ион-транспортного канала. Таким образом, в основе транспорта ионов Н+ и Na+ лежит единый механизм. Полученные результаты могут в дальнейшем использоваться в медицине для энзимотерапии целиакии (неперевариваемость глютена) и получения пищевых продуктов, не содержащих в своем составе глютен, для создания ингибиторов мембранных пирофосфатаз патогенных микроорганизмов, а также для разработки подходов для повышения устойчивости растений к насекомым-вредителям, фитопатогенам и абиотическому стрессу.
11 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: С целью изучения факторов патогенности грибов проведен анализ особенностей распространения гомологов кислой эндопротеазы (EPR) внутри царства грибов. Методом биоинформатического анализа у 35 исследованных видов грибов обнаружено 115 гомологов кислой эндопротеазы (EPR). Средний размер гомологов EPR составляет 550 а.о. Бóльшая часть обнаруженных гомологов электронейтральна в диапазоне pH 4,5-5,7, однако у двух гомологов EPR изоэлектрическая точка лежит в слабощелочной области: Moelleriella libera (pI 7,21) и Drechslerella stenobrocha (pI 8,13). Общее число гомологов EPR в геномах одного вида грибов варьирует от 1 до 14. Проведенный филогенетический анализ показал, что на кладограмме можно выделить две крупные группы гомологов EPR, обозначенные нами как EPR1 и EPR2. Последовательности из группы EPR1 встречаются в геномах некоторых таксономических групп, а именно у сумчатых грибов классов Sordariomycetes, Eurotiomycetes, Leotiomycetes и Dothideomycetes подотдела Pezizomycotina и у базидиальных грибов классов Dacrymycetes, Agaricomycetes подотдела Agaricomycotina. Внутри кластера гомологов EPR1 наблюдается серия дупликаций данного гена, происходящих как на уровне порядков (Magnaporthales), так и на уровне отдельных родов и видов (Torrubiella hemipterigena, Mycosphaerella graminicola) с последующей утратой консервативных аминокислотных остатков у отдельных паралогов. Подобный паттерн может свидетельствовать об активном использовании данного фермента как экзофермента в трофических целях. Группа EPR2 представлена меньшим числом обнаруженных гомологов и отличается меньшей средней и максимальной копийностью в геноме. В отличие от EPR1, последовательности данной группы гомологов отмечены также в геномах базальных подотделов сумчатых (Taphrina deformans) и базидиальных (Ustilago maydis) грибов, а также у Drechslerella stenobrocha, представителя класса Orbiliomycetes. Можно предположить, что группа EPR2 является более эволюционно консервативной, в то время как EPR1 сформировалась в эволюции позднее и, возможно, распространилась среди неродственных групп грибов путём горизонтального переноса. За отчетный период была закончена характеристика 4-х мутантных форм главной пищеварительной цистеиновой пептидазы личинок жука-вредителя пищевых запасов Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae), выбрана форма с наиболее высокой стабильностью в кислой среде желудка человека и подана заявка на патент для последующего использования её в составе препарата для энзимотерапии целиакии и других форм непереносимости глютена, правообладателем которого является Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова. Заявка прошла экспертизу, зарегистирована, и патент находится на стадии оформления. В результате биоинформатического анализа обширного объединенного транскриптома Tenebrio molitor выявлено 269 последовательностей сериновых пептидаз семейства химотрипсина S1, из которых 137 предположительно являются активными пептидазами, 125 с заменами в каталитической триаде представляют собой неактивные гомологи сериновых пептидаз, а 7 последовательностей обладают сложной доменной организацией с двумя или тремя собственно пептидазными доменами. Все пептидазы аннотированы на основании структуры субстрат-связывающего сайта. Получен и охарактеризован по физико-химическим и энзиматическим свойствам рекомбинантный препарат пищеварительной химотрипсиноподобной пептидазы с неканонической структурой субстрат-связывающего сайта из кишечника личинок Tenebrio molitor. Поиск по ядерному геному термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha с использованием в качестве шаблона последовательности митохондриальной пирофосфатазы пекарских дрожжей обнаружил гены двух пирофосфатаз семейства I на хромосомах IV и VII. С помощью программы DeepMito предсказано митохондриальная локализация только для одной из пирофосфатаз. Ее последовательность на 8 остатков длиннее, чем у немитохондриального фермента за счет неканонического сигнального пептида на N-конце. Рекомбинантный митохондриальный фермент получен в высокоочищенном виде с помощью двух стадий хроматографии и закристаллизован. Пространственная структура димерного фермента определена с разрешением 1,8 ангстрема методом рентгеноструктурного анализа. Обнаружено, что структуры субъединиц совпадают в пределах 0,4 ангстрема. Зона контакта субъединиц практически симметрична и образована следующими остатками в порядке убывания значимости: Trp59 > Tyr91 > Phe287 > Pro92 > Pro188 > His94 > Arg135 > Asn283. Активные центры фермента содержат по два иона магния, которые удерживаются остатками аспарагиновой кислоты 124, 129 и 161 бидентатно и монодентатно. На основании гомологии с митохондриальной пирофосфатазой человека обнаружена консервативность 6 из 8 аминокислотных остатков, мутации которых у человека связана с синдромом внезапной смерти. Два из этих остатков принадлежат активному центру, один – зоне контакта субъединиц. Анализ структуры дрожжевого фермента показал таким образом, что она является хорошей моделью для изучения молекулярных основ синдрома внезапной смерти.
12 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Работа в отчетный период была направлена на отработку системы для определения состава митохондриальных комплексов, образуемых митохондриальная РРаза РРА2 с другими белками, методом pulldown. Были отработаны протоколы выделения митохондрий из дрожжей S. cerevisiae и из сердца быка. Для этого использовали стандартные подходы, которые в случае митохондрий животных включали гомогенизацию ткани в лизис-буфере, отделение неразрушенных клеток и ядерной фракции центрифугированием при 500 g и осаждение митохондрий из суспензии центрифугированием при 12000 g. В случае дрожжей сначала с помощью литиказы из наработанной клеточной культуры получали сферопласты, которые затем гомогенизировали и выделяли митохондрии как описано выше. Митохондрии инкубировали в лизис-буфере, удаляли нерастворившуюся фракцию центрифугированием и использовали лизат в экспериментах pulldown. В качестве «наживки» в pulldown с дрожжевым митохондриальным лизатом предполагалось использовать выделенный ранее белок РРА2 дрожжей, тагированный шестью остатками His по N-концу. Однако было обнаружено, что этот белок необратимо агрегировал в связанном с Ni-NTA-агарозой состоянии после контакта с лизатом митохондрий. Поэтому последующие эксперименты pulldown проводились с митохондриями животных. С использованием имеющейся плазмиды для выделения митохондриальной РРазы человека hPPA2 были получены генетические конструкции на основе плазмидыpET28a для экспрессии 6-His-тагированной формы hPPA2. Для получения тагированного по N-концу белка ген зрелой формы hPPA2 (остатки 33-334) был клонирован в плазмиду по сайтам рестрикции NdeI и XhoI, после чего белок был наработан и очищен по стандартным протоколам, как было описано ранее для нетагированной нативной hPPA2. Однако этот вариант белка не связывался с NiNTA-агарозой, поэтому был также получен вариант с 6-His-тагированием по С-концу. Для этого был синтезирован ген с сайтами рестрикции для NcoI на 5’-конце и HindIII на 3’-конце и полученный фрагмент был амплифицирован и клонирован в плазмиду pET33b с использованием праймеров 5’-ccgtgccatggccctgtac-3’и 5’-gcaagcttgccaaggaagtgc-3’. После этого были проведенынаработка и очистка белка как описано ранее для ферментаhPPA2. Вариант hPPA2 с 6-His-тагом на С-конце хорошо связывался с NiNTA-агарозой, что позволит использовать его для экспериментов pulldown. Была также продолжена работа с CBS-пирофосфатазой. В частности, используя стандартные подходы генетической инженерии нам удалось получить её вариант с делецией домена DRTGGв регуляторной части (есть основания считать, что DRTGG-домен отвечает за связывания диаденозинполифосфатов – клеточных алармонов). Полученный генно-инженерным путем белок сохранил тетрамерную структуру, но его активность упала в 10 раз. Нам также удалось генно-инженерными методами вставить полную регуляторную часть, состоящую из трех доменов (2CBS + DRTGG), в нерегулируемую пирофосфатазу. В результате она из гомодимера превратилась в гомотетрамер и частично потеряла активность, т.е стала похожей на типичную регулируемую CBS-пирофосфатазу. В будущем планируется установить влияние делеций и вставок на кинетическую кооперативность и возможность регуляции адениновыми производными. Это позволит значительно продвинутся в понимании механизма регуляции CBS-пирофосфатаз и докажет, что CBS-домены являются удобными мобильными элементами для направленного дизайна регулируемых белков. Проведено исследование доменной структуры гомологов пролин-специфичной кислой эндопептидазы аскомицетных и базидиальных видов грибов как важного фактора их фитопатогенной активности. Все гомологи кислой эндопептидазы имели одинаковую доменную структуру и содержали единственный домен суперсемейства Abhydrolase. Гены суперсемейства Abhydrolase кодируют белки, которые имеют специфическую структуру, называемую альфа-бета-гидролазной складкой. Эта складка состоит из чередующихся альфа-спиралей и бета-структур. Большинство гомологов содержат на N-конце сигнальный пептид, однако у 23 гомологов сигнального пептида не обнаружено, а у кислых эндопептидаз грибов видов Coccidioides immitis и Tilletia indica вместо сигнального пептида выявляется трансмембранный домен. Кроме того, у кислой эндопептидазы вида Tilletia indica обнаружен второй трансмембранный участок (258-280 а.о.). Кислая эндопептидаза относится к семейству сериновых пептидаз S28 по базе данных MEROPS, и у подавляющего большинства обнаруженных гомологов в домене суперсемейства Abhydrolase была обнаружена консервативная триада аминокислотных остатков сериновых пептидаз (серин, аспарагиновая кислота и гистидин). Исключениями являются гомологи кислых эндопептидаз видов Taphrina deforman и Cordyceps confragosa, утратившие остаток гистидина, а также гомологи кислых эндопептидаз видов Magnaporthiopsis poae и Daedalea quercina, утратившие как остаток аспартата, так и остаток гистидина; при этом лишь у вида Taphrina deformans отсутствуют иные гомологи кислой эндопептидазы, в остальных случаях в геномах имеются неповреждённые копии гена данной пептидазы. Кислая эндопептидаза представлена большим числом копий у фито- и энтомопатогенов, чем у микоризообразователей и сапротрофов (у последних чаще 1-2 копии), консервативные домены у всех гомологов одинаковые, идентичные суперсемейству Аbhydrolase. Были продолжены исследования пищеварительных пептидаз личинок жука Tenebrio molitor, злостного вредителя зерна и продовольственных запасов. В отчетном периоде изучались свойства очищенного рекомбинантного препарата пептидазы SerP38 с неканонической структурой субстрат-связывающего сайта (G-G-A) из кишечника личинок Tenebrio molitor. Детальное исследование энзиматических свойств пептидазы показало, что она способна гидролизовать только субстраты химотрипсина, в отличие от описанной ранее более широкой специфичности подобных пептидаз ракообразных. При этом константы специфичности субстратов Suc-AAPF-pNA и Ac-Y-pNA были сопоставимы (4,2 и 0,9 мкМ*мин-1, соответственно), что отличает SerP38 от главной пищеварительной пептидазы T. molitor, которая, как было показано ранее, не способна гидролизовать короткие пептидные субстраты. Оптимум активности SerP38 наблюдался при рН 9.0. Пептидаза ингибировалась синтетическими ингибиторами, такими как PMSF, TPCK, химостатин, в то время как ЭДТА, Е-64, пепстатин не влияли на активность фермента. Очищенный фермент был стабилен при щелочных рН, а в присутствии бычьего сывороточного альбумина (БСА) также и при кислых рН. В присутствии БСА SerP38демонстрировал высокую стабильность в течение 2,5 ч. Следует отметить, что короткий жизненный цикл насекомого и секреция множества пептидаз в средней кишке личинок T. molitor с высокой каталитической активностью и стабильностью могут сделать это насекомое отличным альтернативным источником промышленно важных ферментов для использования в качестве добавок в различных биопрепаратах (например, пятновыводителях, моющих средствах и т. п.). Была подробно проанализирована экспрессия генов сериновых пептидаз на разных стадиях онтогенеза жука T. molitor. Максимальное количество генов активных пептидаз, 61 ген, экспрессировалось практически только на питающихся стадиях личинки и взрослой особи, причем они демонстрировали максимальные уровни экспрессии и не имели регуляторных доменов в составе пропептида. Интересно, что на этих стадиях экспрессировалось также 95 генов предположительно неактивных гомологов сериновых пептидаз, тоже без регуляторных доменов, и уровни экспрессии части из них были высокими. Возможно, обе эти группы могут быть связаны с пищеварительным процессом. На стадиях развития и метаморфоза – яйца и куколки – экспрессировалось значительно меньшее количество генов пептидаз и их гомологов, причем уровни их экспрессии были ниже и большинство из них имели регуляторные домены в составе пропептида. И также небольшая, но важная группа генов пептидаз и их гомологов экспрессировалась на всех или большинстве стадий развития T. molitor. Большая часть из них имела регуляторные домены в составе пропептида и предположительно принимает участие в таких важных физиологических процессах как иммунная защита, адгезия, регуляция развития и метаболизма.
13 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: Реферат Проведен биоинформатический анализ гомологов пролин-специфичной дипептидилпептидазы 4 (DPP4) и способной отщеплять пролин лейцинаминопептидазы в геномах базидиальных и аскомицетных грибов. DPP4 относится к семейству сериновых пептидаз S9 по базе данных MEROPS и существует в виде трансмембранного и секретируемого гомологов. DPP4 в исследованных видах двухкопийна, оба гомолога по структуре близки и содержат домен DPP4 в первой трети аминокислотной последовательности с N-конца и пролилолигопептидазный домен Peptidase_S9 вблизи С-конца. Показано, что секретируемая пролин-специфическая пептидаза DPP4 широко распространена в мицелиальных грибах, включая алкалофильные и алкалотолерантные виды. Ферменты этих видов были активны и стабильны в щелочных условиях и при высоких концентрациях солей, что делает их хорошими кандидатами для применения в биотехнологии и биоинженерии. Лейцинаминопептидаза - фермент, способный отщеплять N-концевой пролин, оказалась однокопийной у всех базидиомицетов, кроме Agaricus bisporus, у которого 2 копии этого фермента; из доменов она имеет мотив пептидаз M17, в одном случае (у Beauveria bassiana) вместо этого близкий к ней участок PRK00913, в другом случае (Pseudozyma hubeiensis) на N-конце обнаружена гомология с 5-формилтетрагидрофолатциклолигазой. Было продолжено исследование пептидаз и их гомологов у личинок жука Tenebrio molitor, являющегося злостным вредителем запасов зерновых и продуктов их переработки. Шесть гомологов сериновых пептидаз (SPH), содержащих в активном центре триаду His-Asp-Thr вместо His-Asp-Ser, были представлены секретируемыми пре-про-последовательностями и не имели регуляторных доменов в пропептиде. Сравнение последовательности наиболее экспрессируемой из них (SerPH122) с последовательностями других SPH и наиболее экспрессируемых пищеварительных пептидаз T. molitor со сходной доменной организацией показало максимальную идентичность (57%) с эластазоподобной пептидазой SerP41. Получены данные, указывающие на способность рекомбинантного препарата пробелка rSerPH122 к автопроцессингу. SerPН122 характеризуется широкой субстратной специфичностью; наиболее эффективно протекает гидролиз субстратов химотрипсиноподобных и трипсиноподобных пептидаз. Консервативная замена Ser195Thr в активном центре препятствовала полноценному функционированию SerPН122 в гидролизе пищевых белков, и делает возможной,роль этого белка в регуляции других пищеварительных пептидаз. Биаллельные мутации в ядерном гене PPA2 человека, кодирующем митохондриальную неорганическую пирофосфатазу hPPA2, вызывают митохондриальные дисфункции, приводящие к тяжелой патологии сердца. Для лучшего понимания молекулярных механизмов митохондриальной дисфункции, вызванной мутациями в гене PPA2, необходима подробная характеристика метаболической роли hPPA2. В данной работе мы изучаем in vitro эффекты ряда метаболитов, а также других факторов, на активность рекомбинантной hPPA2. Это исследование дополнено оценкой возможных механизмов наблюдаемых закономерностей in silico. Мы показали, что при концентрациях Mg2+, типичных для митохондриального матрикса, hPPA2 работает в режиме ненасыщения, следовательно, факторы, изменяющие концентрацию Mg2+, будут оказывать существенное влияние на активность hPPA2. Мы также продемонстрировали, что активность hPPA2 регулируется окислительно-восстановительным состоянием остатков цистеина. Наконец, мы обнаружили, что некоторые метаболиты, включая промежуточные продукты центрального метаболизма, влияют на активность hPPA2. Анализ hPPA2 in silico позволил получить структурное объяснение наблюдаемых свойств. Особый интерес представляет W-петля, уникальная для белков PPA2 животных и кинетопластид, которая может участвовать во взаимодействии с низкомолекулярными эффекторами. Домен цистатионин-β-синтазы (CBS), присутствующий во многих белках, связывает производные аденозина, которые регулируют функции белков посредством малопонятного механизма. В данном исследовании мы установили механизм, посредством которого домены CBS опосредуют аллостерическое ингибирование прокариотической пирофосфатазы семейства II (CBS-PPазы) под действием АМР и активацию диаденозинтетрафосфатом. В этом ферменте CBS-домены являются частью регуляторной вставки, расположенной в одном из двух каталитических доменов, образующих активный центр и соединенных гибким линкером. Используя моделирование и метод молекулярной динамики, мы получили неизвестные ранее структуры полноразмерной CBS-PPазы в комплексах с АМР и диаденозинтетрафосфатом (Ap4A). Структуры предполагают, что тетрамеризация белка через периферические CBS-домены создает напряжение в ядре, образованном четырьмя парами каталитических доменов, препятствуя их открытию и закрытию во время каталитического цикла («внутреннее ингибирование»). Ap4A снимает напряжение посредством механизма, опосредованного CBS-доменом, тем самым облегчая функционирование активного центра, тогда как AMP увеличивает напряжение, фиксируя активный центр в закрытой или открытой конформации. В согласии с этими данными, Ap4A ускорял, а AMP замедлял реакции синтеза PPi, катализируемые PPазой, которые включают стадии связывания Pi с активным центром и высвобождение PPi из него. Эффект достигались за счет коррелированного действия на каталитическую константу и константу Михаэлиса. Таким образом, наши результаты связывают регуляторную функцию CBS-доменов с их ролью в олигомеризации CBS-PPase и, как следствие, ограничением подвижности одного из каталитических доменов. Пептидазы мицелиальных грибов Продолжены биоинформатические исследования пептидаз мицелиальных грибов, участвующих в обеспечении физиологической пластичности микромицетов для их адаптации к экстремальным местообитаниям, а также принимающих прямое участие в гидролизе трудно гидролизуемых белков. Анализ филогенетического дерева гомологов дипептидилпролинпептидазы (DPP4) позволил предположить, что в ранней эволюции грибов до расхождения эволюционных линий аскомицетов и базидиомицетов произошла дупликация соответствующего гена, которая привела к появлению трансмембранного и секретируемого гомологов. У всех видов грибов, кроме Cordyceps confragosa, содержащей четыре копии, DPP4 двухкопийна, оба гомолога по структуре близки и содержат домен DPP IV в первой трети аминокислотной последовательности с N-конца и пролилолигопептидазный домен Peptidase_S9 вблизи С-конца. В геноме алкалофильного гриба Sodiomyces alkalinus F11 были обнаружены две последовательности, принадлежащих к группе DPP4. Одна из них (ROT37187.1) соответствует белку длиной 947 аминокислот, содержащему трансмембранный участок; другая (ROT38925.1) лишена трансмембранного участка, но содержит классический сигнальный пептид. Величины pI данных последовательностей составляют 4,80 и 4,66; молекулярные массы – 106,0 и 87,5 кДа. Обе последовательности содержат консервативную триаду аминокислот, необходимую для катализа. Показано, что секретируемая пролин-специфическая пептидаза DPP4 широко распространена в мицелиальных грибах, включая алкалофильные и алкалотолерантные виды. Ферменты из алкалофильных и алкалотолерантных видов имели некоторые индивидуальные особенности, но в обоих случаях исследованные DPP4 были активны и стабилны в щелочных условиях и при высоких концентрациях солей, что делает их хорошими кандидатами для применения в биотехнологии и биоинженерии. Кроме того, DPP4 может быть использован в качестве препарата для расщепления трудногидролизуемых богатых пролином пептидов в условиях, соответствующих условиям в кишечнике человека, и поэтому может рассматриваться как потенциальный кандидат для ферментативной терапии целиакии. Лейцинаминопептидаза - фермент, способный отщеплять N-концевой пролин, оказалась однокопийной у всех базидиомицетов, кроме Agaricus bisporus, у которого две копии этого фермента; из доменов она имеет мотив пептидаз M17, в одном случае (у Beauveria bassiana) вместо этого близкий к ней участок PRK00913, в другом случае (Pseudozyma hubeiensis) на N-конце обнаружен участок, гомологичный 5-формилтетрагидрофолатциклолигазе. Проанализированы результаты работ по адаптивной лабораторной эволюции, демонстрирующие и объясняющие связь мутаций с наблюдаемыми фенотипическими и биохимическими изменениями, рассмотрены возможности использования грибов как модельных объектов для проведения лабораторных эволюционных экспериментов и проверки различных эволюционных гипотез. Продолжено исследование пептидаз и их гомологов у личинок Tenebrio molitor, являющегося злостным вредителем запасов зерновых и продуктов их переработки. Среди 269 аминокислотных последовательностей, гомологичных сериновым пептидазам, выявленным с помощью геномного и транскриптомного анализов T. molitor, 125 имели различные замены в каталитической триаде активного центра (предположительно неактивные гомологи или псевдопептидазы, SPH). Шесть SPH, содержащих в активном центре аминокислотные остатки триады His-Asp-Thr с консервативной заменой существенного для катализа аминокислотного остатка Ser на остаток Thr (Ser195Thr, HDT-тип замены), были представлены секретируемыми пре-про-последовательностями и не имели регуляторных доменов в пропептиде. Все шесть последовательностей продуцировались практически только на питающихся стадиях имаго и личинки возраста IV, причем уровень экспрессии мРНК был максимальным у гомолога SerPH122. Сравнение аминокислотных последовательностей SerPH122, других гомологов HDT-типа и наиболее экспрессируемых пищеварительных пептидаз T. molitor со сходной доменной организацией показало максимальную идентичность (57%) последовательностей SerPH122 и эластазоподобной пептидазы SerP41. Профили экспрессии мРНК в жизненном цикле сходны у этих двух белков, но отличаются от других пищеварительных пептидаз, что указывает на их родство. Гомолог SerPH122 с самым высоким уровнем экспрессии мРНК был получен в рекомбинантной форме в экспрессионной системе дрожжей Komagataella kurtzmanii на предыдущем этапе работы. В текущем отчетном периоде была продолжена характеристика этого белка. Был проведен поиск каталитической активности у полученного препарата белка. Поскольку пропептид пробелка SerPH122 заканчивался аргинином, процессинг препарата проводили трипсином по остатку Arg. При этом обнаружили, что после нескольких минут инкубации в растворе, исходный синтезированный с пропоследовательностью рекомбинантный препарат пробелка rSerPH122 уже проявлял активность, что может указывать на способность полученного препарата к автопроцессингу. Это хорошо согласуется с результатами изучения субстратной специфичности, которое показало предпочтение субстратов, содержащих остаток аргинина в положении P1, Z-FR-pNA и Z-RR-pNA. Дополнительный процессинг трипсином приводил к возрастанию активности белка только в 1,5 раза. rSerPH122 проявлял также активность по широкому кругу химотрипсиноподобных, эластазоподобных и цистеиновых пептидаз, однако предпочтительными явились субстраты химотрипсиноподобных пептидаз Suc-AAPF-pNA, Glp-AAF-pNA, Glp-F-pNA, Ac-Y-pNA. Показано, что SerPH122 максимально активна при рН 8,5 и с стабильна в диапазоне рН 4,0-8,0. Отметим, что выявленные гидролитические активности SerPH122 были низкими - по субстрату химотрипсина в 4500 раз ниже, чем у химотрипсиноподобной пищеварительной пептидазы SerP38 T. molitor. Это указывает на то, что консервативная замена остатка активного центра Ser195Thr препятствует полноценному функционированию SerPН122 как активного фермента, предназначенного для гидролиза пищевых белков, и предполагает иную роль этого белка в пищеварительном процессе, возможно, в регуляции или активации других пищеварительных пептидаз. Митохондриальная пирофосфатаза В отчетный период была продолжена работа по характеристике митохондриальной пирофосфатазы человека hPPA2. В рамках исследования метаболической роли митохондриальной пирофосфатазы и ее взаимодействия с низкомолекулярными метаболитами было обнаружено, что уридин и его производные активируют фермент. Активирующий эффект уридина на некоторые митохондриальные ферменты был известен ранее, но для пирофосфатаз он описан впервые. Активирующий эффект проявляется при микромолярных концентрациях уридина, что говорит о его специфическом связывании с hPPA2. Зависимость каталитической активности hPPA2 от концентрации активатора имела сигмоидальный характер; при ее аппроксимации эмпирическим уравнением Хилла значение K0.5 составило 1.1 ± 0.1 мкM. Более детальное исследование механизма активирующего влияния уридина на hPPA2 показало, что этот эффектор не влияет на рН-зависимость активности фермента. Зависимость активности hPPA2 от концентрации субстрата MgPPi, определенная при 2 мМ Mg2+ в отсутствие и в присутствии 10 мкМ уридина, показала, что эффектор увеличивает значение Km (с 7,5 ± 0,2 мкМ до 16 ± 2 мкМ), а также увеличивает kcat (с 72 ± 5 до 90 ± 8 с-1). Степень активации hPPA2 уридином при 50 мкM MgPPi зависела от концентрации кофактора Mg2+: если при 2 мМ Mg2+ степень активации составляла 20%, то при 1 мМ Mg2+ степень активации составила 42%. Поэтому далее было исследовано влияние уридина на образование комплекса hPPA2 с кофактором Mg2+. Согласно полученным результатам, уридин изменяет как характер зависимости активности hPPA2 от концентрации Mg2+, так и сродство фермента к кофактору. В присутствии 10 мкМ уридина концентрационная зависимость активности hPPA2 от [Mg2+] имела сигмоидальную форму, что соответствовало кооперативному связыванию кофактора в двух или более центрах. Значение константы полунасыщения K0.5 составило 0.51 ± 0.03 мM, а значение коэффициента Хилла – 2.0 ± 0.2. Значение максимальной активности при насыщении фермента магнием не зависело от присутствия уридина. Полученные результаты показывают, что основной причиной активирующего действия уридина на hPPA2 является увеличение сродства фермента к кофактору Mg2+, необходимому для работы фермента. Предполагается, что уридин способствует увеличению популяции активного фермента в условиях митохондриального матрикса, где концентрация свободного Mg2+ составляет 0,4 – 0,7 мМ, что соответствует лишь частичному насыщению кофактром в отсутствие уридина (константа диссоциации комплекса hPPA2 с Mg2+ составляет 1,3 мM). Взаимодействие уридина с hPPA2 было также исследовано расчетными методами. Был проведен молекулярный докинг уридина в модель пространственной структуры hPPA2. Основным предсказанным сайтом связывания уридина является межсубъединичный интерфейс в димерной молекуле белка: связывание в нем уридина дает среднее значение предсказанной энергии связывания -6,3 ккал/моль. Статистический анализ полученных данных показывает, что это основной центр связывания данного эффектора: в межсубъединичном интерфейсе кластеризуются 42% всех предсказанных индивидуальных позиций, в том числе в нем расположены 5 из 10 кластеров с наилучшими оценочными функциями. Также уридин обнаруживается в центре связывания, расположенном у входа в активный центр (здесь сосредоточено 16% всех предсказанных позиций, образующих 3 из 10 кластеров с лучшими значениями оценочной функции) со средней энергией связывания -6,6 ккал/моль. Характер распределения позиций связывания уридина в hPPA2 уникален среди других исследованных эффекторов; так, например, активатор NADH также в основном связывается в межсубъединичном интерфейсе, однако не обнаруживается у входа в активный центр. Активирующее действие уридина при его связывании в межсубъединичном интерфейсе может быть связано с облегчением динамики белковой молекулы, которая необходима для заполнения центров связывания магния в активном центре. В дальнейшем планируется провести симуляцию молекулярной динамики для проверки этого предположения. Регулируемая нуклеотидами CBS-пирофосфатаза Поскольку представленные в этой части данные не опубликованы, они представлены более подробно и с приложением некоторых рисунков. 1. Моделирование структур комплексов Dh-PPase с аденозинфосфатами Трехмерные структурные модели Dh-PPase, связанной с аденозиновым лигандом, были созданы в три этапа. Во-первых, структура тетрамерного полноразмерного фермента без лиганда была предсказана с использованием AlphaFold2. Во-вторых, структура апо-тетрамера с наилучшим результатом была дополнена восемью ионами Mg2+ в четырех активных центрах и двумя молекулами Ap4A или четырьмя молекулами AMP в четырех регуляторных центрах. Координация лиганда была взята из кристаллических структур канонической PPase семейства II Bacillus subtilis (Bs-PPase; PDB ID: 2HAW) и регуляторной части CBS-PPase Clostridium perfringens (Cp-PPase; PBD IDs: 3L2B и 2L31) соответственно. Полученные исходные структуры были уточнены с помощью моделирования молекулярной динамики (МД), выполненного в трех повторениях в течение 800 нс. Структура комплекса Ap4A, полученная таким образом, показана на рисунке 1; структура комплекса AMP была похожа, но не идентична. Для сравнения с кристаллическими структурами гомологичных доменов PPаз семейства II предсказанные структуры Dh-PPазы были разделены на отдельные домены. Затем они были наложены на кристаллические структуры Bs-PPазы, связанной с Mg2+ (домены DHH и DHHA2 в открытой конформации активного центра; PDB ID: 1K23), или на регуляторную часть Cp-PPазы, связанную с Ap4A или AMP (домены CBS1+DRTGG и CBS2; PDB ID: 3L2B и 2L31 соответственно). В этом анализе домены CBS1 и DRTGG можно было рассматривать как единое твердое тело. В целом, значения RMSD для этих наложений не зависели существенно от связанного аденозинового лиганда и субъединицы, использованной в конкретном сравнении. Типичные значения RMSD находились в диапазоне 1,4–2,5 Å для доменов CBS1+DRTGG и CBS2, 1,0–1,7 Å для доменов DHH и 1,6–1,9 Å для доменов DHHA2. Очень похожие значения RMSD (различие < 0,1 Å) были получены при аналогичном раздельном наложении каталитических доменов Dh-PPазы на домены Bs-PPазы с аналогом субстрата (имидодифосфатом), связанным в активных центрах (идентификатор PDB: 3HAW, закрытая конформация активного центра). В совокупности эти данные указывают на «твердотельное» поведение доменов CBS1+DTRGG и CBS2 во время связывания аденозинфосфата. Однако для структур, наложенных друг на друга фрагментами CBS1+DRTGG, значение RMSD для домена CBS2 было меньше в одной субъединице (2,3 Å), чем в других (3,5–3,9 Å) в комплексе Ap4A, но больше в одной субъединице, чем в других (6,4 Å против 2,4–3,2 Å) в комплексе AMP. Эти данные позволяют предположить, что регуляторная часть имеет разную степень изгиба между доменами DRTGG и CBS2 в некоторых субъединицах по сравнению с кристаллическими структурами регуляторной вставки (структуры 3L2B и 2L31. 2. Сравнение моделированных структур субъединиц внутри тетрамеров Далее, предсказанные структуры субъединиц Dh-PPазы, связанных с Ap4A и AMP, сравнивались внутри каждого из тетрамеров. В этих сравнениях субъединицы накладывались друг на друга во всех возможных парах (шесть пар на тетрамер) по их фрагментам CBS1+DRTGG, и были рассчитаны значения RMSD для доменов CBS2, DHH и DHHA2. Это сравнение характеризовало сходство субъединиц внутри тетрамеров (т.е. симметрию/асимметрию тетрамера). Большое значение RMSD для пары субъединиц ожидалось при существенно различающейся конформации конкретного домена в одной субъединице. Эта субъединица могла быть идентифицирована по аналогично повышенным значениям RMSD в двух других парах, включающих ту же субъединицу. На основании этих критериев, пары доменов CBS1+DRTGG очень похожи во всех субъединицах тетрамеров, связанных с Ap4A и AMP. Значения RMSD для CBS2-домена несколько больше в тримере, связанном с Ap4A, и значительно больше в тримере, связанном с AMP, что указывает на a2 как на наиболее искаженную субъединицу. Та же субъединица тетрамера, связанного с AMP, продемонстрировала наибольшие структурные различия в доменах DHH и DHHA2. В отличие от этого, субъединица a3, по-видимому, имеет наиболее искаженную структуру доменов DHH и DHHA2 в тетрамере, связанном с Ap4A. Примечательно, что домен DHH субъединицы a3 также, по-видимому, сильно искажен в комплексе с AMP. Эти выводы подтвердился при наложении всех четырех субъединиц тетрамеров. Субъединица a3 заметно отличалась от остальных в тетрамере, связанном с Ap4A, причем это различие проявлялось в доменах DHH и распространялось на домены DHHA2. В тетрамере, связанном с AMP, наибольшее различие демонстрировала субъединица a2, которое проявлялось в домене CBS2 и распространялось на домены DHH и DHHA2. Субъединица a3 комплекса AMP также заметно отличалась в своих доменах DHH и DHHA2. Таким образом, связывание AMP вызывало более глубокие изменения в структуре Dh-PPase по сравнению со связыванием Ap4A. Более того, вся симметрия тетрамера была искажена — каждый тетрамер не являлся димером симметричных димеров, и только димер a1/a4 был более или менее симметричен сам по себе. Димер a2/a3 был явно асимметричным из-за изменения a3 (в комплексе Ap4A) или a2 (в комплексе AMP). Партнерские субъединицы (a2 и a3, соответственно) конформационно были ближе к субъединицам a1/a4, что указывает на конформационную стехиометрию 3:1 каждой молекулы тетрамера Симметрия D2, проявляемая тетрамерным вариантом Dh-PPase, лишенным доменов DHHA2, явно утрачивается в полноразмерном ферменте, в котором димеры регуляторных частей скручены в противоположных направлениях вокруг своих самых длинных осей (рис. 7А). Угол скручивания, который был близок к нулю в варианте без DHHA2, составлял 31º на пару субъединиц в комплексе Ap4A (рис. 1С) и немного меньше (26º) в комплексе с AMP. Таким образом, конформация последнего комплекса ближе к ненапряженной линейной конформации варианта с делецией, что предполагает, что AMP вызывает большее стерическое напряжение, связанное с DHHA2, по сравнению с Ap4A. В соответствии с этим, общая структура тетрамера заметно изогнута при связывании с AMP, но почти линейна при связывании с Ap4A (рис. 1). 3. Зоны контакта субъединиц и сравнение моделированных структур субъединиц между тетрамерами Два димера регуляторных частей хорошо разделены в пространстве в тетрамерах (рис. 1А) и могут образовывать те же внутренние взаимодействия, что и в кристаллических структурах димерных регуляторных частей. В канонических PPазах семейства II, образованных доменами DHH и DHHA2, димерная структура поддерживается за счет общего β-листа, включающего DHH-домены обеих субъединиц. Этот тип взаимодействий доменов DHH также обнаружен в каталитическом ядре тетрамерной Dh-PPазы (рис. 1А,D), где две пары DHH-DHH образуются перекрестным образом. Например, субъединица a1 взаимодействует с a4 через свои регуляторные части, а с a2 — через каталитические домены DHH. Аналогично, субъединица a4 взаимодействует с a3 через домены DHH, как и субъединицы a2 и a3. «Канонические» контакты (контакты, аналогичные тем, которые наблюдаются в кристаллических структурах) в обоих полноразмерных тетрамерах Dh-PPase показаны на рис. 2. Наиболее важные канонические взаимодействия включают образование водородных связей, которые подкрепляются гидрофобными контактами CBS1 Trp91 и Ile125, DRTGG Val164, Val166, Thr234 и Phe235, а также стэкинг-контактом остатков Tyr124. Примечательно, что в комплексе AMP с Dh-PPase отсутствует довольно много канонических водородных связей, включая те, которые поддерживают β-связь в димере a1/a2 и, частично, в димере a2/a4. В регуляторной части большинство водородных связей, соединяющих две пары доменов CBS, не образуются в комплексе AMP, что соответствует кристаллографическим данным. В комплексе Ap4A отсутствуют несколько водородных связей, поддерживающих регуляторную часть в димере a2/a3. В целом, каталитические домены оказывают гораздо большее влияние на сеть водородных связей в комплексе с AMP, чем в комплексе с Ap4A, что указывает на большее напряжение в комплексе с AMP. Эти выводы были подтверждены анализом площади скрытой поверхности в зонах контакта субъединиц. Они показали, что как регуляторная, так и каталитическая части образуют менее обширные зоны контакта в моделированных структурах Dh-PPase по сравнению с кристаллическими структурами. Зоны контакта регуляторных доменов больше в комплексе AMP (из-за большего вклада CBS2), тогда как для каталитических доменов верно обратное. В модели тетрамерной Dh-PPase, лишенной домена DHHA2, домены DHH образуют канонические контакты внутри димеров субъединиц (аналогичные димерам a1/a2 и a3/a4 на рисунке 1A), но взаимодействуют между такими димерами очень слабо. Однако домены DHHA2 полноразмерной Dh-PPазы вызывают стерические столкновения в переполненном ядре, которые искажают общую структуру. В результате появляются два неканонических контакта субъединиц через каталитические домены (a1/a3 и a2/a4) (рисунок 3), которых нет в кристаллических структурах канонических PPase семейства II. Дополнительные контакты возникают главным образом между доменами DHHA2 субъединиц a1 и a2 и доменами DHH субъединиц a3 и a4 — три водородные связи в комплексе с Ap4A и семь в комплексе с AMP. Один контакт DHHA2 в комплексе Ap4A и два в комплексе AMP образуются с CBS2-доменлм субъединицы a4. Домены DHHA2 двух других субъединиц (a3 и a4) образуют только три водородные связи, все в комплексе с AMP. Неканонические контакты вряд ли существенно стабилизируют олигомерную структуру, поскольку они, по-видимому, возникли из «отталкивающих» взаимодействий, вызванных стерическими препятствиями Визуальное сравнение зон контакта субъединиц в разных субъединицах (рисунки 2 и 3) убедительно свидетельствует о существенной структурной асимметрии в тетрамере Dh-PPase. Во-первых, канонический контакт, объединяющий субъединицы a1 и a4 через их регуляторные части (контакт a1/a4), включает остатки домена CBS2, тогда как аналогичный контакт a2/a3 не включает их (в комплексе с Ap4A) или почти не включает (в комплексе с AMP). Аналогично, домены DHH делегируют одинаковое количество остатков для взаимодействия в парах a1/a2 и a3/a4 комплекса Ap4A, тогда как их количество значительно варьируется в этих парах при связывании с AMP. Во-вторых, все неканонические контакты включают разные остатки во всех парах контактирующих субъединиц. 4. Конформации активного центра Относительное движение каталитических доменов во время моделирования Dh-PPазы методом молекулярной динамики анализировали с точки зрения расстояния между атомами Cα DHH Gly336 и DHHA2 Met444 в каждой субъединице (расстояние 1 на рисунке 1D). Чем больше расстояние, тем более открытым является соответствующий активный центр. На рисунке 4 показана эволюция этого расстояния во время моделирования методом молекулярной динамики обоих типов тетрамеров. В закрытой структуре канонической Bs-PPase это расстояние составляет 9,6 Å. Оценки для открытой структуры несколько различаются и составляют 45 Å в кристаллической структуре Bs-PPase и 25 Å в этой структуре, уравновешенной с помощью моделирования методом молекулярной динамики. Поэтому мы сочли 25 Å наиболее надежной оценкой. Как показано на рисунке 10, все активные центры в комплексе Ap4A были открыты или почти открыты. В комплексе AMP только один активный центр демонстрировал аналогичное поведение, два были полузакрыты, а один был чрезмерно открыт, что также могло препятствовать связыванию субстрата. Примечательно, что домены DHHA2 продолжали колебаться до самого конца времени моделирования в комплексе Ap4A (рисунок 5), но занимали фиксированные, хотя и несколько переменные положения относительно домена DHH в разных субъединицах тетрамера Dh-PPазы, связанного с AMP. Неканонические контакты между субъединицами, вызванные скученностью доменов в каталитическом ядре, приводят к дальнейшей асимметрии в тетрамере Dh-PPase, что характеризуется расстояниями между остатками Gly315 двух доменов DHH, принадлежащих к паре субъединиц a2/a4 или a1/a3 (расстояние 2 на рисунке 2D). В структуре, связанной с Ap4A, эти расстояния очень похожи (20,4 и 20,0 Å соответственно), тогда как в структуре, связанной с AMP, они значительно различаются (16,8 и 21,0 Å соответственно). Уменьшение расстояния до 16,8 Å с сопутствующим ограничением активности активного центра является ожидаемым поведением для ингибитора. Увеличение расстояния в паре субъединиц a1/a3, вероятно, является следствием неканонических контактов доменов DHHA2 (рисунок 3), частично препятствующих закрытию активного центра. В результате структура домена CBS2 в субъединице a2, с которой a3 взаимодействует через регуляторные части (рис. 1А), принимает заметно искаженную конформацию, чтобы предотвратить напряжение, связанное со столкновениями DHHA2. Примечательно, что расстояние между двумя доменами CBS2 в паре субъединиц a2/a3 со связанным AMP (15 Å) аналогично расстоянию в кристаллической структуре отдельной регуляторной части Cp-PPase, связанной с Ap4A, где оно уменьшается до 9 Å в комплексе с AMP. 5. Кинетика синтеза PPi в растворе В более ранних исследованиях регуляции CBS-PPазы аденозинфосфатами рассматривалась только реакция гидролиза PPi. Здесь мы измерили влияние Ap4A и AMP на обратную реакцию — синтез PPi. Эта реакция включает связывание двух молекул Pi, каждая из которых образует комплекс с Mg2+, которые вместе более громоздки, чем молекула комплекса MgPPi, субстрат обратной реакции. Следовательно, ожидается, что синтетическая активность будет более подвержена стерическим препятствиям, предположительно создаваемым регуляторными доменами и олигомерной структурой в CBS-PPase. Поэтому в кинетическом анализе мы сосредоточились на параметрах, характеризующих доступность активного центра к субстрату MgPi. На рисунке 6А показано, что активность Dh-PPase в синтезе PPi в отсутствие аденозинфосфатов была на два порядка ниже, чем активность канонической, нерегулируемой PPase семейства II из S. gordonii во всем диапазоне используемых концентраций Pi. Эта активность измерялась с помощью ненепрерывного анализа PPi, чтобы избежать ингибирования Dh-PPазы под действием APS, компонента реакционной среды. Аналогичные измерения синтеза PPi были проведены с CBS-PPазы из Ethanoligenens harbinense (Eh-PPазы), в которой домены CBS не связывают аденозинфосфаты из-за естественной мутации, и с модифицированным вариантом Dh-PPазы, лишенным регуляторных доменов (Dh-PPазаΔCDC). Качественно, последний вариант был более активен в синтезе PPi, чем аутентичная Dh-PPase без Ap4A, тогда как Eh-PPase превзошла как активированную Ap4A Dh-PPase, так и каноническую Sg-PPase (рисунок 6B). Данные на рисунке 6 были количественно проанализированы с использованием уравнения Хилла (уравнение 1), где Amax — предельное значение активности A при бесконечной концентрации Pi ([P]), а K0,5 — [P], при которой A равно половине Amax. Хотя уравнение 1 является лишь приближением истинного уравнения скорости, его параметры дают приблизительные оценки каталитической эффективности, связывания Pi и кооперативности связывания. A = Amax/{1 + (K0,5/[P])h} (1) Полученные с помощью уравнения 1 значения параметров подтверждают и дополнительно детализируют вышеизложенные выводы. AMP снижал активность Dh-PPазы, экстраполированную до бесконечной концентрации Pi, Amax, в 100 раз, а Ap4A увеличивал ее в 30 раз, приближаясь к активности нерегулируемых Eh-PPазы и Sg-PPазы. Удаление регуляторного домена значительно (в 4 раза) ускоряло синтез PPi ферментом Dh-PPазой. Поскольку влияние на Amax обратно коррелировало с влиянием на значения K0.5 для Pi, их отношение Amax/K0.5 демонстрировало ту же, но значительно усиленную тенденцию. Это отношение аналогично отношению kcat/Km, используемому в энзимологии для характеристики эффективности фермента, и устанавливает нижний предел константы скорости второго порядка для ассоциации фермента и субстрата. В отличие от этого, коэффициент Хилла h изменялся незначительно, и его значение, близкое к 2, может указывать на необходимость двух молекул Pi для образования PPi с небольшим вкладом кооперативности активного центра, ранее продемонстрированной в реакции гидролиза (см. ниже).
14 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: -
15 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: -
15 1 января 2028 г.-31 декабря 2028 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: -
16 1 января 2029 г.-31 декабря 2029 г. Структура, механизм, роль и биоинженерия гидролитических ферментов
Результаты этапа: -

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен