ИСТИНА

Целью проекта являлась разработка способов профилактики и лечения болезни Паркинсона на основе выявления новых механизмов, участвующих в индукции и развитии данного заболевания. В качестве основной новой мишени нами была выбрана глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД). В одной стороны известно, что некоторые лиганды (производные депренила), взаимодействующие с этим белком, каким-то образом влияют на развитие болезни Паркисона, оказывая выраженное терапевтическое воздействие. С другой стороны, механизмы наблюдаемого явления неизвестны. В своей работе мы сосредоточились на изучении прямого взаимодействия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с альфа-синуклеином, играющим определяющую роль в возникновении амилоидных структур при болезни Паркинсона.`Прежде всего, нами были выделены рекомбинантные глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и альфа-синуклеин человека, которые не содержали в своем составе никаких дополнительных мотивов (типа гистидинового «тэга» и др.). Рекомбинантная ГАФД человека обладала каталитической активностью, превышающей в несколько раз удельную активность всех известных препаратов этого фермента из данного источника, что свидетельствовало о том, что выделенный фермент находится в активной конформации и не содержит примеси неактивных или «неправильно свернутых» форм. Рекомбинантный альфа-синуклеин был освобожден от примеси цистеиновых мутантов, образующихся в результате ошибок трансляции при его экспрессии в бактериальных системах и, как было нами продемонстрировано, изменяющих способность альфа-синуклеина дикого типа к амилоидной трансформации. На препаратах белков с максимально близкими к нативному состоянию конформациями была впервые обнаружена инактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы при ее взаимодействии с альфа-синуклеином. Были также найдены соединения, которые вызывали уменьшение прочности ассоциации двух белков, вероятно, путем влияния на конформацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Было доказано изменение стабильности фермента при его связывании с альфа-синуклеина и предложены возможные механизмы обнаруженной нами инактивации. Особое значение обнаруженное влияние альфа-синуклеина на глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу имеет потому, что ненативные формы этого фермента принимают участие в индукции апоптоза при болезни Паркинсона, а развитие данного заболевания сопровождается изменением энергетического обмена. На основании выявления нового механизма влияния альфа-синуклеина на активность и стабильность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы может найти объяснение терапевтическое действие производных депренила при болезни Паркинсона и произведен целенаправленный поиск соединений, пригодных для разработки новых средств профилактики и лечения данного заболевания. На основании полученных результатов опубликовано 5 основных статьи и 3 статьи, частично связанных с темой проекта, в зарубежных журналах, из них одна в отечественном журнале «Биохимия». Одна статья подготовлена к печати (об инактивирующем воздействии альфа-синуклеина на глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу). Кроме того, результаты были доложены и опубликованы в виде тезисов на 4 международных конференциях и 1 российской конференции.

The aim of the project was to develop methods for the prevention and treatment of Parkinson's disease based on the identification of new mechanisms involved in the induction and development of this disease. As a major new target we used the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD). In one hand it is known that some ligands (derived deprenila) that interact with the protein somehow affects the development of Parkinson disease, exerting a pronounced therapeutic effect. On the other hand, the mechanisms of the observed phenomenon is unknown. In our work we have focused on the study of direct interaction of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with alpha-synuclein playing a decisive role in the occurrence of amyloid structures in Parkinson's disease.`First of all, we were allocated a recombinant glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and alpha-synuclein person, which did not contain in its composition any additional motives (such histidinemia "tag", etc.). Recombinant GAPD man possessed catalytic activity several times greater than the specific activity of all known preparations of this enzyme from this source, indicating that the isolated enzyme is in the active conformation and does not contain impurities inactive or "incorrectly folded" forms. Recombinant alpha-synuclein was liberated from impurities cysteine mutants arising from errors of translation in its expression in bacterial systems and, as we have demonstrated, changing the ability of alpha-synuclein wild-type-to-amyloid transformation. The drugs with the proteins as close as possible to the native state conformations were first discovered by the inactivation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with its interaction with alpha-synuclein. They also found compounds that caused a decrease in the strength of Association of two proteins, probably by affecting the conformation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. It has been proven a change in the stability of the enzyme during its binding with alpha-synuclein and suggested possible mechanisms of inactivation detected by us. Of particular importance found the effect of alpha-synuclein for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is because negativnye forms of this enzyme involved in the induction of apoptosis in Parkinson's disease, and the development of the disease is accompanied by changes in energy metabolism. On the basis of identification of a new mechanism of effect of alpha-synuclein on the activity and stability of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase can find an explanation for the therapeutic action derived deprenila in Parkinson's disease and produced a targeted search of compounds suitable for the development of new means of prevention and treatment of this disease. On the basis of the results published on 5 main articles and 3 articles, partly related to the theme of the project in international journals, including one in the national journal "Biochemistry". One article is prepared for printing (about inactivating the effects of alpha-synuclein for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). In addition, the results were presented and published papers in 4 international conferences and 1 Russian conference

При выполнении Научного проекта планируется проведение следующих исследований: 1. Выявление новых механизмов, участвующих в патогенезе болезни Паркинсона. Для реализации этой задачи, на базе сформулированной нами гипотезы о возможной роли глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФД) в развитии болезни Паркинсона, будут проведены исследования взаимодействия различных форм этого фермента с альфа-синуклеином и изучены особенности агрегации двух белков, а также участие шаперонов в этом процессе. Кроме того, будут получены данные об особенностях участия разных форм ГАФД в индукции апоптоза клеток нервных тканей. 2. На основе установленных новых механизмов развития болезни Паркинсона будут определены перспективные белки-мишени, взаимодействие с которыми различных лигандов должно влиять на развитие заболевания. К таким белкам-мишеням, прежде всего, следует отнести глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу. Изменение соотношения между различными изоформами дегидрогеназы и ее конформерами должно влиять как на индукцию апоптоза, вовлеченного в индукцию болезни Паркинсона, так и на формирования агрегатов и олигомеров альфа-синуклеина. Участие альфа-синуклеина и шаперонов, прежде всего БТШ70, в развитии данного заболевания указывает, что эти белки также могут быть белками-мишенями. При выборе лигандов к этим мишеням будут учтены новые механизмы развития болезни Паркинсона. 3. Будет проведен скрининг соединений, имеющихся в открытых и коммерческих библиотеках, для поиска перспективных лигандов, взаимодействующих с описанными выше белками-мишениями, и изучены параметры их связывания с белками с помощью молекулярного моделирования («докинга»). 4. Будут исследованы параметры связывания отобранных низкомолекулярных лигандов с белками- мишенями с помощью физико-химических (прежде всего, изотермической калориметрии) и кинетических (для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы) методов. 5. Будут получены данные о влиянии наиболее перспективных лигандов на процессы агрегации белков-мишеней, а также на эффективность индукции апоптоза в культуре клеток.

Ранее при выполнении работ по госбюджетным темам, проектам РФФИ и Роснауки нашим коллективом были получены важные результаты, имеющие прямое отношение к представленному проекту и являющиеся базой для его выполнения. Так, нами было начато исследование взаимодействия некоторых амилоидогенных белков (пептида бета-амилоида) с ненативными формами определенных глобулярных белков и доказана высокая прочность и специфичность такого рода взаимодействий [1]. Нами было также продемонстрировано накопление денатурированных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в мозгу животных при различных способах моделирования болезни Альцгеймера [2]. Нами были подробно исследованы особенности агрегации различных белков методами лазерного светорассеяния, а также другими физико-химическими методами (флуоресцентной и КД-спектроскопии, калориметрии и аналитического ультрацентрифугирования) [3-12]. Накопленный при проведении этих работ опыт позволит адекватно проводить исследования белок-белковых взаимодействий между белками, вовлеченными в развитие болезни Паркинсона, а также изучать их связывание с отобранными лигандами. Нами была предложена и подтверждена экспериментально гипотеза о блокировании системы шаперонов, участвующих в образовании амилоидных структур, неправильно свернутыми белками (misfolded proteins) [10, 11, 13]. Было доказано, что такое действие могут оказывать не только химически модифицированные или мутантные белки [11], но и развернутые окисленные полипетидные цепи [10].

В качестве основной новой мишени нами была выбрана глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД). В одной стороны известно, что некоторые лиганды (производные депренила), взаимодействующие с этим белком, каким-то образом влияют на развитие болезни Паркисона, оказывая выраженное терапевтическое воздействие. С другой стороны, механизмы наблюдаемого явления неизвестны. В своей работе мы сосредоточились на изучении прямого взаимодействия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с альфа-синуклеином, играющим определяющую роль в возникновении амилоидных структур при болезни Паркинсона.`Прежде всего, нами были выделены рекомбинантные глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и альфа-синуклеин человека, которые не содержали в своем составе никаких дополнительных мотивов (типа гистидинового «тэга» и др.). Рекомбинантная ГАФД человека обладала каталитической активностью, превышающей в несколько раз удельную активность всех известных препаратов этого фермента из данного источника, что свидетельствовало о том, что выделенный фермент находится в активной конформации и не содержит примеси неактивных или «неправильно свернутых» форм. Рекомбинантный альфа-синуклеин был освобожден от примеси цистеиновых мутантов, образующихся в результате ошибок трансляции при его экспрессии в бактериальных системах и, как было нами продемонстрировано, изменяющих способность альфа-синуклеина дикого типа к амилоидной трансформации. На препаратах белков с максимально близкими к нативному состоянию конформациями была впервые обнаружена инактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы при ее взаимодействии с альфа-синуклеином. Были также найдены соединения, которые вызывали уменьшение прочности ассоциации двух белков, вероятно, путем влияния на конформацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Было доказано изменение стабильности фермента при его связывании с альфа-синуклеина и предложены возможные механизмы обнаруженной нами инактивации. Особое значение обнаруженное влияние альфа-синуклеина на глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу имеет потому, что ненативные формы этого фермента принимают участие в индукции апоптоза при болезни Паркинсона, а развитие данного заболевания сопровождается изменением энергетического обмена. На основании выявления нового механизма влияния альфа-синуклеина на активность и стабильность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы может найти объяснение терапевтическое действие производных депренила при болезни Паркинсона и произведен целенаправленный поиск соединений, пригодных для разработки новых средств профилактики и лечения данного заболевания. На основании полученных результатов опубликовано 5 основных статьи и 3 статьи, частично связанных с темой проекта, в зарубежных журналах, из них одна в отечественном журнале «Биохимия». Одна статья подготовлена к печати (об инактивирующем воздействии альфа-синуклеина на глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу). Кроме того, результаты были доложены и опубликованы в виде тезисов на 4 международных конференциях и 1 российской конференции.