![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Актуальным направлением в изучении биологии вирусов является выявление функций клеточного ядра и субъядерных структур в инфекционном цикле. Важная роль ядра в регуляции различных этапов жизненного цикла вирусов показана для вирусов человека и животных. Для многих вирусов растений выявлена локализация вирусспецифических белков в ядре, однако значение ядерной фазы для вирусной инфекции за редким исключением неизвестно. C использованием трансгенных растений с выключенной с помощью малой интерферирующей РНК экспрессией гена коилина нами было показано, что коилин и/или тельца Кахаля опосредуют развитие "мягкой" инфекции растений РНК-содержащими тобра- и гордеивирусами, а их отсутствие приводит к значительно более суровому фенотипу симптомов. Нам также удалось выявить вирусные белки, способные in vitro прямо взаимодействовать с рекомбинантным коилином, а именно белок 16К тобравируса, являющийся супрессором посттранскрипционного умолкания генов и детерминантой патогенности, и белок ТБГ1 гордеивируса, отвечающий за транспорт вирусного генома в растении. Цель настоящего проекта состоит в выявлении молекулярного механизма/механизмов вовлечения коилина/телец Кахаля в инфекционный цикл торба- и гордеивирусов и изучении роли вирусных белков в этом процессе. Дополнительно предполагается изучить возможность взаимодействия коилина и белка ядрышек фибрилларина, дефицит которого в трансгенных растениях приводит к эффектам, аналогичным наблюдаемым при дефиците коилина, при инфекции вышеназванными вирусами. Реализация данного проекта позволит получить новые знания об участии клеточных белков в таких процессах, как распространение вирусной инфекции, защитная реакция растения и контрзащитная реакция вируса. Данные, полученные в этом проекте, внесут вклад в новую быстро развивающуюся область исследований неканонических функций клеточных белков при вирусных инфекциях, и приблизят нас к пониманию молекулярных механизмов взаимодействия вирус-клетка.
В трансгенных растениях N.benthamiana с угнетенной экспрессией коилина/отсутствием телец Кахаля наблюдается значительное усиление симптомов инфекции РНК-содержащими тобравирусом погремковости табака (ВПТ) и гордеивирусом штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ). Изучен эффект отсутствия коилина/телец Кахаля на различные стадии инфекции при заражении трансгенных растений этими вирусами. Трансгенные растения способны запускать специфический РНК сайленсинг против ВПТ и ВШМЯ на уровне, сравнимом с растениями дикого типа. Однако, в противоположность растениям дикого типа, в трансгенных растениях в случае ВПТ (в системных листьях) и ВШМЯ (в инокулированных листьях) вирусные РНК, видимо, не являются мишенью (или эффективной мишенью) индуцированного сайленсинга. Результаты свидетельствуют в пользу предположения, что коилин/тельца Кахаля вовлечены в реализацию защитной реакции растения, отличную от посттранкрипционного умолкания генов, причем в реализации этой реакции определяющую роль играет прямое взаимодействие вирусного белка и коилина. С использованием дополнительных мутантов картированы участки взаимодействия в составе вирусспецифических белков 16К ВПТ и 58К ВШМЯ и растительного коилина.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 15 мая 2013 г.-31 декабря 2013 г. | Выявление взаимодействия между вирусным белком 16К ВПТ и коилином растений |
Результаты этапа: Отсутствие коилина/телец Кахаля в трансгенных растениях N.benthamiana приводит к усилению симптомов инфекции РНК-содержащим тобравирусом погремковости табака (ВПТ). Показано, что вирусспецифический белок 16К, супрессор посттранскрипционного умолкания генов, прямо взаимодействует in vitro с растительным коилином. С использованием серии делеционных мутантов локализованы участки взаимодействия в молекулах вирусного и клеточного белков. Это – участок, включающий с 40 по 60 аминокислотные остатки белка 16К, который содержит предполагаемый «цинковый палец», и участок в центральном домене коилина с 194 по 211 аминокислотные остатки, в состав которого входит предполагаемый сигнал локализации белка в ядрышке. Получены структурные и биохимические характеристики рекомбинантного вирусного белка 16К ВПТ. Изучены биологический эффект суперпродукции экзогенного коилина в растениях и эффект отсутствия коилина на устойчивость растений к абиотическим стрессам. Выявлено, что агроинфильтрация конструкций, экспрессирующих ген коилина, в листья растений вызывает быстро развивающуюся некротизацию инфильтрированной зоны листа. Однако трансгенные безкоилиновые растения проявляют большую устойчивость к абиотическим стрессам (окислительному и осмотическому) по сравнению с растениями дикого типа. Полученные результаты свидетельствуют в пользу предположения, что коилин/тельца Кахаля вовлечены в реализацию защитной реакции растения в ответ на инфекцию тобравирусом. Возможным сигналом является прямое взаимодействие коилина с вирусным белком 16К, вследствие чего восприимчивость растения к заражению вирусом угнетается. | ||
2 | 28 марта 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Коилин как модулятор эффективности заражения растений РНК-содержащими тобравирусами и гордеивирусами |
Результаты этапа: В трансгенных растениях N.benthamiana с угнетенной экспрессией коилина/отсутствием телец Кахаля наблюдается значительное усиление симптомов инфекции РНК-содержащими тобравирусом погремковости табака (ВПТ) и гордеивирусом штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ). Изучен эффект отсутствия коилина/телец Кахаля на различные стадии инфекции при заражении трансгенных растений этими вирусами. В случае ВПТ уровень вируса, определяемого в верхних (юных, вновь образованных) симптоматических листьях трансгенных растений, существенно выше, определяемого в соответствующих листьях растений дикого типа (выздоравливающих), тогда как в инокулированных и нижних (старых) системных (симпоматических) листьях уровень вируса сравним для растений обоих типов. Напротив, существенно более высокий уровень накопления ВШМЯ в трансгенных линиях растений N. benthamiana по сравнению с растениями дикого типа наблюдался только на начальных стадиях инфекции в инокулированных листьях. Трансгенные растения способны запускать специфический РНК сайленсинг против ВПТ и ВШМЯ на уровне, сравнимом с растениями дикого типа. Однако, в противоположность растениям дикого типа, в трансгенных растениях в случае ВПТ (в системных листьях) и ВШМЯ (в инокулированных листьях) вирусные РНК, видимо, не являются мишенью (или эффективной мишенью) индуцированного сайленсинга. Результаты свидетельствуют в пользу предположения, что коилин/тельца Кахаля вовлечены в реализацию защитной реакции растения, отличную от посттранкрипционного умолкания генов, причем в реализации этой реакции определяющую роль играет прямое взаимодействие вирусного белка и коилина. С использованием дополнительных мутантов уточнены участки взаимодействия в составе вирусспецифических белков 16К ВПТ и 58К ВШМЯ и растительного коилина. Для обеих белков с участком в центральном домене коилина, включающим а.о. с 194 по 211, взаимодействуют положительно заряженные участки белка 16К (содержащие сигналы локализации в ядрышке NLS1 и NLS2), а в составе белка 58К положительно заряженный участок, включающий а.о.137-146. | ||
3 | 11 февраля 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Изучение защитного механизма растения, опосредованного взаимодействием в ядре вирусного белка с коилином |
Результаты этапа: Ранее показано, что в трансгенных растениях N.tabacum и N.benthamiana с угнетенной экспрессией гена коилина/отсутствием телец Кахаля наблюдается значительное усиление симптомов инфекции РНК-содержащим тобравирусом погремковости табака (ВПТ), что проявляется в отсутствии эффекта выздоровления от вирусной инфекции системных листьев растений. Показано, что неструктурный вирусный белок 16К ВПТ прямо взаимодействует с ядерным белком коилином, релокализуя его из субъядерных структур – телец Кахаля в ядрышки. Участки взаимодействия в молекулах вирусного и клеточного белков локализованы. Выявлен клеточный партнер коилина – поли(ADP-рибозо) полимераза (PARP), ядерный белок, который, как известно, влияет на собственную активность и активность различных ядерных белков путем добавления к ним полимеров ADP-рибозы. Показано, что коилин непосредственно взаимодействует с PARP и задерживает его в ядрышке, что приводит к модификации активности PARP и последующему развитию защитной реакции растения на вирусную инфекцию. Таким образом, коилин выступает как сенсор инфекции растений ВПТ, функция которого модулируется взаимодействием с вирусным белком 16К. При заражении трансгенных растений с выключенным геном коилина гордеивирусом штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) вирусная инфекции также приобретает более «суровый» характер. В этом случае партнером коилина является вирусный белок 58К, прямое взаимодействие которого с коилином также продемонстрировано. Механизм участия коилина в гордеивирусной инфекции не ясен и, видимо, отличается от выявленного для тобравирусной инфекции. Тем не менее, в обоих случаях наблюдается новый коилин-зависимый механизм/механизмы развития защитной реакции растения на вирусную инфекцию, опосредованный прямым взаимодействием вирусного белка и коилина в ядрышке растительной клетки. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".