Изучение внутри- и межклеточных взаимодействий методами молекулярной и клеточной биологии, физиологии, математики и биоинформатикиНИР

The study of intra- and intercellular interactions by molecular, cell biology, physiology, and mathematical methods and bioinformatics

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Изучение внутри- и межклеточных взаимодействий с использованием методов молекулярной и клеточной биологии, физиологии, математики и биоинформатики.
Результаты этапа: 1. Исследована роль ингибиторов, взаимодействующих с разными системами цитоскелета. Бета- и гамма-актины четко сегрегированы в митотических клетках нормального эпителия. Подобное распределение немышечных актинов было обнаружено и в митотических клетках рака молочной железы. Помимо архитектурной сегрегации была исследована регуляторная роль изоформ актина в делении и продвижении по циклу клеток MCF-7 и MDA-MB-231. Снижение экспрессии любой цитоплазматической изоформы актина резко подавляло пролиферацию клеток рака молочной железы, но только супрессия бета-актина дополнительно вызывала значительное уменьшение популяции диплоидных клеток, накопление тетраплоидных и анеуплоидных клеток. Мы обнаружили связь цитоплазматических актинов с белками-регуляторами клеточного цикла. Результаты опубликованы. 2. Получены новые результаты о клеточных механизмах действия новых митохондриально-направленных молекул. Обработаны и проанализированы результаты клинических испытаний митохондриально-направленных антиоксидантов. Выдвинуты предположения о необходимости дальнейших клинических испытаний.Работа опубликована. Разработан оптимизированный метод пермеабилизации нейтрофилов для визуализации ядерных белков методом проточной цитометрии. Нововведения будут полезны для изучения активации Nrf2-зависимых сигнальных каскадов митохондриально-направленными соединениями. Работа опубликована. Проведен обзор имеющихся данных о роли транскрипционного фактора DUX4 в развитии лице-лопаточно-плечевой мышечной дистрофии (ЛЛПМД, дистрофии Ландузи-Дежерина). Обсуждаются новые подходы к терапии ЛЛПМД, в том числе с применением митохондриально-направленных соединений. Работа опубликована. Показана способность разобщителей дыхания и окислительного фосфорилирования и митохондриально-направленных соединений снижать степень повреждения межклеточных контактов эпителия кишечника in vitro. Данные представлены на международной конференции. Обнаружена замена в последовательности АТФ-синтазы E.coli, делающая фермент способным подвергаться АДФ-ингибированию. Мутантный фермент (βL249Q) по своим свойствам приближается к гомологичным ферментам хлоропластов и митохондрий. Работа опубликована. 3. Получены новые результаты об эволюцию отдельных генов и систем генов. Открыто и изучено новое явление - наличие длинных точных палиндромов в кодирующей последовательности нескольких генов, закодированных в митохондриальных геномах четырех видов нематоморф. Эволюция палиндромных последовательностей в кодирующей последовательности существенно сужает возможности мутаций аминокислотных последовательностей. Результаты опубликованы. Описана эволюция двух классов систем рестрикции-модификации на основе полногеномных данных. В ходе работы разработан новый алгоритмы сравнения филогенетических деревьев белков из одного класса систем. Показано, что горизонтальный перенос систем этих классов и отдельных их генов превалирует над вертикальным наследованием. Публикация готовится. Изучен горизонтальный перенос генов бактериальных систем рестрикции-модификации на основе метагеномных данных. 4. Впервые изучено влияние новых классов митохондриальных разобщителей на активность нейронов Lymnaea stagnalis (прудовика). Новый разобщитель MitoFluo деполяризует нейроны и модифицирует спайковую активность, вызывая расширение спайков, снижение их амплитуды и увеличение частоты. Результаты опубликованы. 5. Исследовано влияние пептида Р4 (RTKLWEMLVELGNMDKAVKLWRKLKR), сконструированного на основе CRAC-содержащих альфа-спиралей из вирусного белка М1, на взаимодействие культивируемых макрофагов с частицами, имитирующими микробы. результаты опубликованы. Результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о холестерин-распознающей аминокислотной консенсусной последовательности в белках и могут стать основой для дизайна новых пептидных модуляторов клеточных процессов и иммуномодуляторов в частности. 6. Показано, что охлаждение гифы Neurospora crassa существенно уменьшает скорость роста и замедляет ветвление, увеличивая расстояние между ветвями. При этом заметно увеличивалось время формирования нового сегмента, но практически не менялась длина, как гифального, так и апикального сегментов, точно так же, как мы наблюдали ранее в экспериментах при комнатной температур 7. В 2019 году было проведено очередное обновление базы структур ДНК-белковых и РНК-белковых комплексов NPIDB. Выполнена работа по анализу особенностей формы ДНК в комплексах с белками нескольких широко распространённых семейств. Продолжалась работа по совершенствованию классификации ДНК-белковых комплексов, основанной на взаимодействующих элементах обеих молекул и удобному отражению этой классификации в веб-интерфейсе базы. 8. Общедоступная система сравнительной оценки качества программ реконструкции филогении пополнена новыми эталонными выравниваниями. Сформировано 12 наборов ортологических рядов, по 60 белковых доменов в каждом ряду; общее количество рядов — более 10 000. Каждый набор ортологических рядов соответствует своему множеству из 60 видов живых организмов и представляет собой все ортологические ряды эволюционных доменов, которые удалось получить из этих видов. Для каждого набора построено филогенетическое дерево видов, служащее эталоном для реконструкций по отдельным ортологическим рядам. Выбран оптимальный метод сравнения реконструкций с эталоном. 9. Получены новые результаты в области теоретической математики. Получена явная формула, выражающая пси-функцию Чебышёва через дискретный спектр оператора Лапласа на фундаментальной области модулярной группы. Результат опубликован. Опубликован обзор последних результатов в знаменитой проблеме круга. Сформулирована сильная гипотеза универсальности, связывающая поведение величины P(x) с поведением второго члена в формуле Вейля для оператора Лапласа на замкнутом двумерном римановом многообразии с интегрируемым геодезическим потоком. Для произвольных некомпактных гиперболических римановых поверхностей конечной площади получены тождества, связывающие дискретный спектр оператора Лапласа и спектр резонансов (полюсов матрицы рассеяния). Результат опубликован 10. Показано частичное восстановление миелиновых оболочек аксонов при действии митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1 в модели рассеянного склероза. Результаты опубликованы. 11. На основе ранее полученных результатов о принципах управления гладкими мышцами, генерирующими ритмические сокращения у брюхоногих, выдвинута м обоснована гипотеза о мышечных механизмах, контролирующих скорость транспортировки эмбрионов через фаллопиеву трубу человека. Эта гипотеза является первым описанием трубных мышечных механизмов, определяющих нормальную и любую разновидность внематочной беременности при хронических нарушениях сократимости канальцев. 12. Подобраны оптимальные условия выделения малой РНК из лейкоцитов человека и сперматозоидов с высоким содержанием малой РНК. Результаты готовятся к публикации. Выделена и секвенирована малая РНК из паразитического червя Intoshia. Проведена пробоподготовка библиотек бактериальных транскриптомов Nocardioides simplex. Ввиду того, что планируемый к деплеции рибосомальной РНК кит с производства был снят, был использован другой набор, результаты признаны неудовлетворительными, требуют дополнительной работы по сравнению других имеющихся коммерческих наборов для деплеции рибосомальной бактериальной РНК. Проведены работы по сиквенсу ГЦ-богатых участков. Заполнена четверть элементов, отсутствующих в сборке после применения методов полногеномного секвенирования.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Изучение внутри- и межклеточных взаимодействий с использованием методов молекулярной и клеточной биологии, физиологии, математики и биоинформатики.
Результаты этапа: 1. Исследовано распространение систем рестрикции-модификации (Р-М) в микробиоме антарктического озера Глубокое. Показан горизонтальный перенос систем Р-М в этом холодном гипер солёном малонаселенном озере. Рукопись готовится к отсылке в журнал. 2. Исследован функциональный вклад изоформ актина в процесс митотического деления нормальных и опухолевых клеток. Изучен механизм комплексного воздействия низкомолекулярных ингибиторов, взаимодействующих с разными системами цитоскелета. Показан различный вклад изоформ в митотический процесс. Изучен механизм синергичного действия ингибиторов разных систем цитоскелета. 3. Показано, что соединения на основе трифенилфосфония при действии на культуры клеток, содержащих эстрогеновые рецепторы, не вызывает значительной пролиферации клеток, а также повышения экспрессии генов, типичных для эстрогенового сигналинга. 4. Оптимизирована методика выделения малой РНК из тканей с очень малым содержанием РНК: из сперматозоидов человека в количестве 1-10 млн (малое количество) и менее 1 млн (очень малое количество). Оптимизированы методики пробоподготовки библиотек секвенирования для малой РНК из этих тканей. Отработан новый метод очистки библиотек от димеров адаптеров. Рукопись находится на стадии ответа рецензентам. Опубликованы результаты работы, включающей оптимизацию методик пробоподготовки малой РНК сперматозоидов крыс. 5. Проведена пробоподготовка и секвенирование библиотек бактериальных транскриптомов Nocardioides simplex. Проведено сравнение различных наборов для деплеции рибосомальной РНК, выбран набор (Zymo-Seq RiboFree Total RNA Library Kit), наилучшим образом осуществляющий деплецию рибосомальной РНК для данных организмов. Результаты опубликованы. 6. Проведена пробподоготовка и секвенирование библиотек транскриптомов Arabidopsis thaliana в процессе старения. Результаты опубликованы. 7. Проведено секвенирование и сборка ГЦ-богатых участков бактерии Paenibacillus sp. RUD330. Показана эффективность методик Nanopore и длинных чтений для сиквенса сложных участков генома, которые не собирались методом секвенирования и сборки коротких чтений по методике Illumina. Результаты опубликованы. 8. Исследована роль холестерин-распознающих (CRAC) мотивов в механизме эффекта пептида RTKLWEMLVELGNMDKAVKLWRKLKR (P4), сконструированного из двух α-спиральных участков белка M1 вируса гриппа и модулирующего холестерин-зависимую функцию культивируемых макрофагов. Показано, что пептиды с заменами мотивообразующих аминокиcлот теряют активность, присущую пептиду Р4, что подтвержает ключевую роль CRAC-мотивов в эффектах пептида Р4. Результаты опубликованы. 9. Сформулированы представления о роли энергетической кооперации в трихомах нитчатых цинобактрией на основе электрической связи между клетками (Результаты опубликованы в статье и тезисах и представлены на конференции). Рассмотрена гипотеза о возможной роли локальных межклеточных электрических токов в самоорганизации внутриклеточных структур при верхушечном росте гифы мицелиального гриба Neurospora crassa (Результаты представлены на конференции, опубликованы в тезисах и находятся в печати в ж. Цитология) 10. В области теоретической математики указан класс явных формул, каждая из которых дает выражение остаточного члена в асимптотике функции Чебышёва через спектр оператора Лапласа на фундаментальной области модулярной группы
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Изучение внутри- и межклеточных взаимодействий с использованием методов молекулярной и клеточной биологии, физиологии, математики и биоинформатики.
Результаты этапа: 1. Создана база выравниваний белковых последовательностей и референсных филогенетических деревьев для них, предназначенная для тестирования программ реконструкции филогении. Статья с описанием алгоритмов формирования, содержания и возможностей базы отправлена в журнал. Существует большое количество компьютерных программ, предназначенных для реконструкции филогении белков по их последовательностям. Разные программы часто выдают различающиеся результаты (филогенетические деревья) на одних и тех же исходных данных (которыми являются множественные выравнивания последовательностей). Кроме того, большинство программ предоставляют пользователям возможность менять параметры их алгоритма, от которых результат также нередко зависит. Проблема подбора оптимальной программы или набора параметров чаще всего решалась тестированием программ на симулированных белковых последовательностях. Несомненно более обоснованным является сравнение различных программ на последовательностях реальных природных белков из организмов различных таксономических групп. Создана база PhyloBench и веб-интерфейс к ней. База включает около 10000 выравниваний каждого из трёх размеров: по 15, 30 и 45 последовательностей. Выравнивания состоят из последовательностей ортологичных белков и снабжены референсными филогенетическими деревьями, что позволяет сравнивать программы реконструкции филогении на основе близости их результатов к референсным деревьям. На материале базы протестирована чувствительность семи различных мер расстояний между филогенетическими деревьями к ошибкам реконструкции. Выяснено, что наиболее чувствительной мерой является расстояние Робинсона – Фоулдса. Статья с описанием базы, процедуры её создания и возможностей её применения, а также с описанием результатов сравнения мер, отправлена в редакцию журнала "Systematic Biology" и в настоящее время находится на рецензировании. Созданная нами база PhyloBench и система сравнения программ реконструкции филогении позволит выработать обоснованные рекомендации по использованию филогенетического программного обеспечения. 2. Исследовали морфологические изменения в ядре опухолевых клеток карцином человека различного тканевого происхождения при изменении соотношения цитоплазматических изоформ актина. Были изучены морфология и распределение ядерных телец, а также уровень экспрессии и накопления ядрышковых белков. Выявлены возможные функции β-актина: контроль размера ядра, плоидности и упаковки хроматина; поддержание стабильности ядерной оболочки. Напротив, возможные функции γ-актина заключаются в декомпактизации хроматина и снижении стабильности ядерной оболочки. Повышение экспрессии бета-актина или супрессия гамма-актина снижают инвазивность и пролиферативный потенциал опухолевых клеток. Проведен поиск ядерных мишеней, на которые влияют изменения экспрессии изоформ актина. Выявлены иммуноцитохимические и морфологические различия ядер и ядерных структур: изменения морфологии ядра и хроматина, накопление ламина B в ядерной оболочке. Были исследованы морфология и распределение ядерных телец, а также уровень экспрессии и накопления ядрышковых белков. Подавление экспрессии цитоплазматических изоформ актина изменяет фенотип и кариотип клеток рака молочной железы MDA-MB-231, а также карциномы легких A549. Подавление экспрессии бета-актина приводило к усилению мезенхимального фенотипа, тогда как снижение экспрессии гамма-актина индуцировала эпителиоидный фенотип. С помощью иммунофлуоресцентной N-SIM микроскопии в клетках с измененным соотношением уровней экспрессии изоформ актина были выявлены изменения морфологии ядра и хроматина. Клетки с подавленной экспрессией бета актина имели большую площадь ядер по сравнению с контрольными. Интенсивность флуоресценции ядра по DAPI увеличивалась при подавлении экспрессии гамма-актина. Более того, подавление экспрессии бета изоформы актина приводит к прогрессии хромосомной нестабильности с эндоредупликацией и увеличением анеуплоидности. Напротив, подавление экспрессии гамма изоформы актина приводит не только к снижению количества митозов, но и к стабилизации хромосомного набора, уменьшению полиплоидности и исчезновению анеуплоидности в клеточной популяции. Изменение экспрессии бета или гамма изоформы актина влияет на структуру ядра опухолевых клеток: относительное подавление экспрессии бета-актина влечет за собой изменения, связанные с опухолевой прогрессией: изменение плоидности, структуры хроматина и оболочки ядра. Подавление экспрессии гамма-актина, напротив, приводит к нормализации плоидности, компактизации хроматина и увеличению стабильности ядерной ламины. 3. Мультисистемные дисфункции человека не связаны с мутацией PANX1 ARG217HIS. Паннексины – семейство белков, открытое нами в 2000 году (Panchin et al., 2000). Мы подробно изучили модификацию гена паннексина1 ARG217HIS, который был зарегистрирован в случае с выраженными симптомами первичной недостаточности яичников, тяжелой умственной отсталости, нейросенсорной тугоухости и кифоза (Shao et al., 2016). Мы редуплицировали нокаут гена Panx1 и воспроизвели замену в позиции 217 (p.Arg217His) в модели мышей. В обоих случаях явных изменений фенотипа, не наблюдается. Результаты наших исследований позволяют предположить, что мультисистемные дисфункции человека (Shao et al., 2016) не связаны с заменой ARG217HIS, а имеют другую этиологию. Кроме того, мы попытались воспроизвести предыдущее исследование функций сна/бодрствования у мышей с нокаутом Panx1 и обнаружили, что ранее описанные эффекты, вероятно, не были вызваны с самим нокаутом Panx1, а с пассажирской мутацией в использованой линии мышей. Паннексины – семейство белков, открытое нами в 2000 году в результате сравнения генов человека с генами беспозвоночных животных (Panchin et al., 2000). В последнее время появились работы, связывающие мутации гена PANX1 с патологиями человека и с функций сна/бодрствования. Мы подробно изучили модификацию гена паннексина1 ARG217HIS, который был зарегистрирован в случае с выраженными симптомами первичной недостаточности яичников, тяжелой умственной отсталости, нейросенсорной тугоухости и кифоза (Shao et al., 2016). Мы редуплицировали нокаут гена Panx1 и воспроизвели замену в позиции 217 (p.Arg217His) в модели мышей с помощью метода CRISPR/Cas9. В обоих случаях явных изменений фенотипа, таких как размер, масса тела, плодовитость и т. д. не наблюдается. Кроме того, мы попытались воспроизвести предыдущее исследование функций сна/бодрствования и двигательной активности у мышей с нокаутом Panx1 и обнаружили, что ранее описанные эффекты, вероятно, не были вызваны с самим нокаутом Panx1, а с пассажирской мутацией в использованой линии мышей. Хотя известны случаи мутаций, фенотипы которых радикально отличаются у человека и мыши (например, коннексин 26), результаты наших исследований позволяют предположить, что мультисистемные дисфункции человека (Shao et al., 2016) не связаны с заменой ARG217HIS, а имеют другую этиологию. Влияние нокаута на функцию сна/бодрствования не подтверждается. 4. Исследован вопрос о необходимости и ограничениях длительности сна. Существуют ли непреодолимые физические или биологические ограничения для сокращения продолжительности сна? Насколько этого можно избежать без фатальных последствий? Какие средства могут сократить продолжительность сна? Широко распространено мнение, что сон необходим для долгосрочного выживания. Мы рассмотрели ограниченные, но интригующие доказательства, которые не согласуются с этим понятием. Широко распространено мнение, что сон необходим для долгосрочного выживания. Мы рассмотрели ограниченные, но интригующие доказательства, которые не согласуются с этим понятием. Мы сконцентровались на клинических случаях полной и частичной потери сна и на человеческих мутациях, которые приводят к фенотипу короткого сна. Эти наблюдения подтверждаются новыми исследованиями на животных и обсуждаются с точки зрения эволюции сна. Две отдельные гипотезы предполагают различные подходы к перенастройке механизма сна. Если сон выполняет неопознанную жизненно важную физиологическую функцию, эту незаменимую функцию необходимо определить до того, как можно будет разработать "протез сна" (технический, биологический или химический). Если сон не имеет жизненно важной функции, а скорее представляет собой временной механизм для адаптивного бездействия, сон может быть уменьшен путем изменения самой системы генерации сна без каких-либо побочных эффектов. Если сон выполняет неопознанную жизненно важную физиологическую функцию, эту незаменимую функцию необходимо определить до того, как можно будет разработать "протез сна" (технический, биологический или химический). Если сон не имеет жизненно важной функции, а скорее представляет собой временной механизм для адаптивного бездействия, сон может быть уменьшен путем изменения самой системы генерации сна без каких-либо побочных эффектов. Battulin N, Kovalzon VM, Korablev A, Serova I, Kiryukhina OO, Pechkova MG, Bogotskoy KA, Tarasova OS, Panchin Y. Pannexin 1 Transgenic Mice: Human Diseases and Sleep-Wake Function Revision. Int J Mol Sci. 2021 May 17;22(10):5269. Panchin Y, Kovalzon VM. Total Wake: Natural, Pathological, and Experimental Limits to Sleep Reduction. Front Neurosci. 2021. 5. Сформулированы обобщающие представления о передаче энергии через ПК между клетками эволюционно различных многоклеточных организмов: нитчатых цианобактерий, мицелиальных грибов и животных. Рассмотрена гипотеза о возможном влиянии активности неорганических ионов в культуральной среде на все фазы жизненного цикла животной клетки. При анализе проблемы самоорганизации в любой небольшой группе клеток важно принимать во внимание вероятность наличия локальных электрических полей, которые создаются неравномерным распределением между клетками генераторов МП, расходующих энергию внутренних или внешних ресурсов, и потребителей энергии, аккумулированной в форме мембранного потенциала (МП), что создает предпосылки для передачи энергии через проницаемые межклеточные контакты (ПК) в многоклеточных системах. (1) На основе энергетической кооперации с помощью электрической связи через ПК на заре эволюции миллиарды лет назад появилось разделение труда в трихомах нитчатых цианобактерий — первых многоклеточных организмов нашей планеты: между генерирующими МП при фотосинтезе вегетативными клетками и гетероцистами, потребляющими энергию МП в процессе фиксации азота. На верхушке растущей гифы мицелиального гриба Neurospora crassa благодаря разделению между соседними клетками, электрически связанными через ПК, функций генерации МП и использования его энергии создается и поддерживается локальное электрическое поле, которое может принимать участие в самоорганизации внутриклеточных структур при поляризованном верхушечном росте [Потапова Т.В. 2021. Мембранная биоэнергетика и разделение труда в системах электрически связанных клеток. Цитология,Т. 63 (№1) – с. 30 – 42. Potapova T.V. 2021. Cell and Tissue Biology, V.15 (4) — p.p. 326-336.]. (2) Анализ экспериментальных данных по оценке времени дифференцировки и времени жизни культивируемых клеток нейробластомы показал, что низкое содержание ионов Na+ и защелачивание цитоплазмы способствуют значительному увеличению продолжительности жизни [Смолянинов В.В., Потапова Т.В., Мякишева С.Н., Асланиди К.Б. 2021. Жизненный цикл клетки и активность неорганических ионов // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. №10. - С.27 – 30]. (1) Представления об особенностях электрических процессов и явлений, сопровождающих транспорт энергии через ПК в многоклеточных биологических системах, могут быть полезны при анализе многих важных вопросов, связанных с рассмотрением механизмов реализации генетических «инструкций» в конкретных жизненных процессах. (2) Представления о влиянии неорганических ионов на жизненный циекл клетки могут быть полезны при подборе культуральных сред для выращивания различных клеток. 6. Получены результаты по двум задачам теории графов и её применению. При анализе проблем, возникающих при анализе биологических данных математические задачи часто формулируются на языке графов. Поэтому в НИР решаются математические задачи о графах и их динамике – как в задаче об окруживании. Последняя задача отвечает на вопрос: как на основе локальных правил изменений, заданных в каждой вершине графа в трехмерном пространстве возникают определенные структуры, например, окружность. Подготовлена статья «Об оценках числа отображений деревьев в произвольные графы и о неравенстве А.Ф.Сидоренко». В работе получены наилучшие (не улучшаемые) оценки снизу для числа отображений линейного графа в произвольные графы с фиксированной средней степенью вершин. Исследована динамическая система с локальными однородными правилами взаимодействия, связанная с так называемой задачей окруживания (совместно с И.А.Сидоровым, LUMC Нидерланды и Е. Мироновой, студенткой ФББ МГУ). Были получены как теоретические результаты, так и результаты большого числа компьютерных экспериментов. 7. В культуре иммортализованных миобластов определены гены, экспрессия которых повышается под действием DUX4, но нормализуется антиоксидантами. Показана роль одного из найденных генов, PITX1, в регуляции дифференцировки миобластов. Мышцы людей, страдающих лице-лопаточно-плечевой миодистрофией, экспрессируют белок DUX4 и характеризуются повышенным окислительным стрессом, а также нарушением дифференцировки миобластов. Механизмы нарушения дифференцировки на данный момент изучены не полностью, их изучение улучшит понимание развития заболевания. В культуре иммортализованных миобластов MB135-DUX4 было обнаружено 200 генов, экспрессия которых повышается под действием DUX4, но нормализуется антиоксидантами. Некоторые из этих генов, в частности, PITX1, ранее были проассоциированы с лице-лопаточно-плечевой миодистрофией и/или мышечной дифференцировкой. Экспрессия PITX1 была повышена так же в первичных миобластах пациентов, страдающих лице-лопаточно-плечевой миодистрофией. Было показано, что PITX1 является редокс-зависимым геном. По полученным данным опубликована работа (Karpukhina et al, 2021). PITX1 является АФК-зависимым геном, принимающем участие в регуляции дифференцировки миобластов. Примененный нами подход может применяться для поиска потенциальных мишеней для терапии ряда заболеваний. 8. Был разработан чувствительный и специфический метод для количественной оценки внутриклеточной микроРНК-39 МикроРНК являются одним из ключевых регуляторов экспрессии генов в клетках. Количественное определение содержания специфической внутриклеточной микроРНК может дать информацию о состоянии генетического аппарата клетки. Для усиления чувствительности метода использовались изотермическая реакция полимеризации с круговым вытеснением, полипероксидаза, конъюгированная с стрептавидином, и в условиях усиленной хемилюминисценции. Была показана высокая специфичность реакции по отношению к микроРНК-39. Сравнение калибровочных кривых для микроРНК-39 в буфере и очищенном лизате клеток MCF-7 показало пренебрежимо малый матричный эффект. Всё перечисленное указывает на высокую чувствительность и специфичность метода. По полученным данным опубликована работа (Solovjev et al, 2021). Предложенный метод позволяет оценивать количество микроРНК, выделенной из клеточных культур, что необходимо для количественного определения внутриклеточной микроРНК. 9. Впервые было показано, что для миокарда предсердий мышей линии B6CBAF1 характерен эктопический автоматизм. Для экспериментального изучения механизмов фибрилляции предсердий (ФП) необходимы модели на животных. Гибридные мыши B6CBAF1 широко используются в качестве фона для создания проявлений различных заболеваний. Однако электрофизиология предсердий, вегетативная симпатическая иннервация сердца и потенциал этой линии мышей для исследования ФП охарактеризованы недостаточно. В настоящем исследовании мы восполнили этот пробел, используя разные методы для выявления признаков и характеристики электрической активности предсердий у мышей B6CBAF1 В настоящем исследовании мы использовали записи ЭКГ и микроэлектродов из многоклеточных препаратов предсердий, чтобы выявить атрибуты предсердной электрической активности у мышей B6CBAF1. Кроме того, были проведены эксперименты с флуоресцентным нейромедиатором ложного моноамина и окрашиванием на основе глиоксиловой кислоты, чтобы охарактеризовать функциональную и морфологическую катехоламинергическую иннервацию предсердий B6CBAF1. Предсердный миокард B6CBAF1 очень склонен к эктопической автоматичности и проявляет аномальные пост-спонтанные потенциалы действия которые приводят к проаритмической триггерной активности, в отличие от двух родительских штаммов C57Bl / 6 и CBA. Эксперименты in vivo показали, что гибриды B6CBAF1 более восприимчивы к индуцированной норэпинефрином ФП. Кроме того, симпатические нервные окончания у B6CBAF1 частично дисфункциональны, что свидетельствует о более низкой способности накапливать и высвобождать нейротрансмиттеры в отличие от двух родительских штаммов. Полученные результаты позволяют рассматривать мышей линии B6CBAF1 как кандидатов для создания моделей ранних изменений вегетативной нервной и сердечно-сосудистой систем, типичных для фибрилляции предсердий. (2021 Proarrhythmic atrial ectopy associated with heart sympathetic innervation dysfunctions is specific for murine B6CBAF1 hybrid strain Kuzmin Vlad S., Potekhina Viktoriia M., Odnoshivkina Yulia G., Chelombitko Maria A., Fedorov Artem V., Averina Olga A., Borodkov Alexey S., Shevtsova Anna A., Lovat Maxim L., Petrov Alexey M. в журнале Life Sciences, издательство Elsevier BV (Netherlands), том 266) 10. Показано, что соединения на основе трифенилфосфония при действии на культуру клеток базофильной лейкемии крысы RBL-2H3 предотвращают дисфункцию митохондрий. FcεRI-зависимая активация и дегрануляция тучных клеток (MC) играют важную роль в аллергических заболеваниях. Ранее мы продемонстрировали, что антиоксидант на основе трифенилфосфония (ТФФ) SkQ1 ингибирует дегрануляцию тучных клеток, но точный механизм этого ингибирования не был изучен. В отчётном периоде исследование этих механизмов было сосредоточено на изучении влияния соединений на основе TPP SkQ1 и C12TPP на FcεRI-зависимую дисфункцию митохондрий и передачу сигналов во время дегрануляции MC. Исследовано действие соединений на основе трифенилфосфония на культуру клеток базофильной лейкемии крысы RBL-2H3. Эта культура клеток используется в качестве модели тучных клеток. Следствием действия соединений на основе трифенилфосфония является ингибирование дегрануляции клеток в ходе FcεR -зависимой стимуляции. Исследование возможных механизмов, опосредующих ингибиторные эффекты соединений на основе трифенилфосфония показало усиление киназной активности Erk1/2. Результаты опубликованы (2021 Mitochondria-targeted triphenylphosphonium-based compounds inhibit FceRI-dependent degranulation of mast cells by preventing mitochondrial dysfunction through Erk1/2 Pavlyuchenkova Anastasia N., Zinovkin Roman A., Makievskaya Ciara I., Galkin Ivan I., Chelombitko Maria A. в журнале Life Sciences, издательство Elsevier BV (Netherlands)). Полученные данные о действии соединений на основе трифенилфосфония на культуру клеток базофильной лейкемии крысы RBL-2H3расширяют фундаментальные представления о роли митохондрий в активации тучных клеток, а также вносят вклад в обоснование разработки митохондриально-направленных лекарств для лечения аллергических заболеваний. 11. Разработан алгоритм идентификации сигналов разрывной транскрипции (TRS) в полных геномах коронавирусов. Детектированы сигналы TRS в 430 000 геномов вирусов SARS-CoV-2 и описаны мутации в них. Разрывная транскрипция является необходимой частью транскрипции всех коронавирусов. С помощью этого механизма синтезируются мРНК всех «поздних» генов вируса, которые включают все структурные гены, необходимые для создания капсида вируса и, следовательно, размножения вируса. Разрывная транскрипция каждого позднего гена носит вероятностный характер, согласно опубликованным экспериментальным данным, мутации в сигнале TRS влияют на экспрессию соответствующего позднего гена. Актуальным вопросом является изучение того, какие еще факторы и как влияют на экспрессию поздних генов. А также, описание мутаций в TRS у природных коронавирусов и их влияния на жизненный цикл коронавирусов. Разработан алгоритм идентификации сигналов разрывной транскрипции TRS в геномах коронавирусов. При тестировании этот алгоритм показал хороший результата на геномах, в которых ранее были опубликованы сигналы TRS. Для описания мутаций в коронавирусах SARS-CoV-2, алгоритм был применен в 430 377 геномам этого вируса, доступным в базе данных Refseq NCBI на сентябрь 2021 год. Описаны мутации, встречающиеся в TRS каждого из 10 поздних генов Предложенный алгоритм определения TRS показал, что мутации в этих сигнала в геномах SARS-CoV-2 человека встречаются с определенной частотой. В дальнейшей работе, в зависимости от объёма доступных транскриптомных данных, планируется оценить вклад мутаций в TRS на экспрессию поздних генов. Такие данные могут внести свой вклад в объяснение заразности разных штаммов коронавирусов. 12. Работы связанные с секвенированием. 12.1 Опубликована методологическая статья на основании экспериментов по оптимизации выделения малой РНК и пробоподготовки библиотек секвенирования из сперматозоидов человека с малым и сверхмалым содержанием сперматозоидов. Малая РНК в последнее время активно изучается как регуляторный элемент экспрессии генов. Для целей полномасштабного секвенирования малой РНК необходимо иметь надёжные протоколы её выделения из тканей, в которых она содержится в очень небольшом количестве, а также методики пробоподготовки библиотек секвенирования. Для полномасштабного секвенирования малой РНК подготовлен протокол по оптимальному выделению её из образцов сперматозоидов с малым (1-10 млн) и сверхмалым (менее 1 млн) количеством сперматозоидов. Разработана методика очистки библиотек секвенирования от адаптеров. Результаты опубликованы. Опубликованы результаты по выделению и пробоподготовке малых РНК из образцов сперматозоидов с малым количеством сперматозоидов. 12.2 Проведены пробоподготовка и секвенирование библиотек малой РНК, полученных из экзосом семенной жидкости человека. Семенная плазма рассматривается как многообещающая среда для поиска маркеров нарушения фертильности и эффективности репродуктивных технологий. Одним из направлений исследования семенной плазмы является поиск эпигенетических регуляторов в сравнении с протеомными исследованиями, одним из которых является малая РНК. Исследования, посвящённые малым РНК как эпигенетическим регуляторам, предполагают их высокопроизводительное секвенирование для установления всего их многообразия и дифференциальной экспрессии в конкретных тканях. Задачей исследования являлось определение возможности выделения малых РНК из экзосом семенной плазмы в количестве, достаточном для приготовления библиотек секвенирования. На основании предыдущих исследований разработан протокол выделения малых РНК из экзосом семенной плазмы в количестве, достаточном для приготовления библиотек секвенирования. Разработан протокол выделения малых РНК из экзосом семенной плазмы. 12.3 Проведена оптимизация одновременного выделения ДНК и РНК из образцов сперматозоидов со сверхмалым содержанием (менее 1 млн) сперматозоидов. В задачи лонгитюдного исследования репродуктивных функций человека входит длительное хранение различных биологических образцов (крови, сперматозоидов, семенной плазмы и др), и максимальное извлечение из них материала для спектра разноообразных исследований. Это особенно важно в случае образцов с очень малым количеством биологического материала. Были поставлены эксперименты для получения оптимального протокола одновременного выделения РНК и ДНК из образцов с малым (1-10 млн) и сверхмалым (менее 1 млн) содержанием сперматозоидов. Разработан оптимальный протокол для одновременного выделения РНК и ДНК из образцов с малым (1-10 млн) и сверхмалым (менее 1 млн) содержанием сперматозоидов. Разработан протокол для одновременного выделения РНК и ДНК из образцов с малым содержанием сперматозоидов. 12.4 Проводится исследование биохимического пути синтеза псораленов у вида Heracleum: получены штаммы дрожжей с гетерологической экспрессией кандидатных псорален и ангелицин-синтаз. Растения рода Heracleum содержат фотосенсибилизирующие вещества, резко усиливающие ожоги кожи под действием ультрафиолетового излучения. Одно из таких веществ - псорален, являющийся причиной жгучести и ядовитости растения Heracleum sosnowsky. Целью исследования является установление генетики путей синтеза псоралена в растении. Определён список генов для поиска ферментов синтеза псоралена в роде Борщевик. К ним относятся псорален-синтазы, ангелицин-синтазы, бергаптол- и ксантотоксол-синтазы, диметилаллилпирофосфат-умбеллиферон диметилаллил-трансферазы, мармезинсинтаза, а также гены начальных этапов синтеза: фенилаланинаммиаклиаза, циннамат-4-гидроксилаза, 4-кумарат-коА-лигаза, кумароил-коА-2'-гидроксилаза. На основании предварительных транскриптомных данных выделены кандидатные гены для спектра генов синтеза псоралена. С целью проверки физиологического значения найденных генов получены штаммы дрожжей с гетерологической экспрессией кандидатных генов псорален- и ангелицин-синтазы. Ведётся работа по определению генов и ферментов синтеза псоралена в роде Борщевик. Получены штаммы дрожжей с гетерологической экспрессией кандидатных генов псорален-синтаз.
4 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Изучение внутри- и межклеточных взаимодействий с использованием методов молекулярной и клеточной биологии, физиологии, математики и биоинформатики.
Результаты этапа:
5 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Изучение внутри- и межклеточных взаимодействий с использованием методов молекулярной и клеточной биологии, физиологии, математики и биоинформатики.
Результаты этапа:
6 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Изучение внутри- и межклеточных взаимодействий с использованием методов молекулярной и клеточной биологии, физиологии, математики и биоинформатики.
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы


Имя Описание Имя файла Размер Добавлен
1. tez-SZV-2019.pdf tez-SZV-2019.pdf 65,5 КБ 12 декабря 2019 [TVPotapova]