Исследование механизмов преобразования энергии в мембранных системах, связанных с циклическим переносом ионов водорода и натрия ферментами электрон-транспортных цепей, механизмов продукции активных форм кислорода и их роли в физиологии клеткиНИР

Investigation of the mechanisms of energy transformation in membrane systems, resulting from the cyclic transfer of hydrogen ions and sodium enzymes of electron-transport chains, mechanisms of production of reactive oxygen species and their role in cell physiology

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Исследование механизмов преобразования энергии в мембранных системах, связанное с циклическим переносом ионов водорода и натрия ферментами электрон-транспортных цепей, механизмов продукции активных форм кислорода и их роли в физиологии клетки
Результаты этапа: В 2019 году активно разрабатывался новый митохондриально-направленный краситель MitoCLox для детекции перекисного окисления митохондриальной мембраны. Были проведены исследования на липосомах, митохондриям и культурах клеток. Было проведено исследование развития острого повреждения почек и гибели животных в модели сочетанной травмы при ишемии/реперфузии почки на фоне системного введения митохондрий. Показано, что внутрибрюшинное введение митохондрий вызывает появление в периферической крови митохондриальной ДНК, что может активировать клетки врожденного иммунитета, вызывая нейтрофилез и лейкоцитоз. При введении митохондрий, как и при ишемии/реперфузии почки, наблюдаются провоспалительные изменения, в первую очередь лейкоцитоз и гранулоцитоз. Сочетание ишемии/реперфузии с введением митохондрий вызывает резкое увеличение гибели животных, что может указывать на связь активации TLR-сигнализации и высокой смертности пациентов при сочетанных травмах и полиорганной недостаточности в условиях реанимационных отделений. Лечение митохондриально-адресованным антиоксидантом приводило к увеличению выживания животных, что предполагает участие митохондриальных активных форм кислорода в развитии системного воспалительного ответа и гибели организма при острой почечной недостаточности. Проведено исследование важности различных консервативных аминокислотных остатков NqrC для его флавинилирования. Механизм ApbE-зависимого флавинилирования на настоящий момент неизвестен. На первом этапе флавинилирования субстраты реакции, FAD и белок-мишень, связываются с ApbE. Дальнейшее развитие событий может заключаться в образовании фосфоэфирной связи между Thr(Ser) и остатком FMN с дальнейшим переносом этого остатка из центра связывания флавина в ApbE во флавин-связывающий центр NqrC. Альтернативное развитие событий может состоять в переносе FMN-части молкулы FAD из ApbE во флавин-связывающий центр NqrC с последующим разрывом фосфоангидридной связи в FAD и образованием фосфоэфирной связи между остатком FMN и Thr(Ser). Для проверки этих альтернативных гипотез были сконструированы варианты NqrC с заменой аминокислотных остатков, участвующих в связывании изоаллоксазинового кольца FMN (Leu180Asp и Thr231Ala). Показано, что проведенные мутации приводят к существенному изменению спектра поглощения вариантов NqrC, свидетельствующему о том, что изоаллоксазиновое кольцо FMN в этих мутантных формах не связано с белком и экспонировано в водную фазу. В то же время мутантные варианты NqrC оказались способны подвергаться флавинилированию под действием ApbE. Эти данные означают, что в ходе флавинилирования реакция образования фосфоэфирной связи предшествует переносу FMN из центра связывания флавина в ApbE во флавин-связывающий центр белка-мишени. Показано, что гормоны трийод-тиронин, эстрадиол и тестостерон, а также близкий к ним по структуре холекальциферол (витамин Д3) способны модулировать работу цитохромоксидазы, связываясь в специальном центре связывания жирных кислот, который локализован на внутренней стороне каталитической субъединицы I близи входа в протонный канал К, доставляющий в каталитический центр фермента протоны, необходимые для образования воды. Полученные результаты указывают на возможность существования неизвестного ранее пути влияния гормонов на окислительное фосфорилирование: через прямое взаимодействие с ключевым ферментом дыхательной цепи, вызывающее изменение его активности.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Исследование механизмов преобразования энергии в мембранных системах, связанное с циклическим переносом ионов водорода и натрия ферментами электрон-транспортных цепей, механизмов продукции активных форм кислорода и их роли в физиологии клетки
Результаты этапа: В рамках гостемы в 2020 году было проведено многоплановое исследование. Новые флуоресцентные зонды, адресованные в митохондрии, помогли подробно изучить окисление митохондриального кардиолипина и его роль в регуляции аутофагии в различных клеточных моделях. Показана важная роль АФК, производимых в митохондриях, в воспалительной и аллергической активации. Получено 2 патента на разработку тест-модели для исследования действия лекарственных препаратов на заболевание рассеянным склерозом in vitro, позволяющую достоверно оценить степень непосредственного воздействия лекарственных препаратов. Открыта новая натрий-перекачивающая цитохромоксидаза, обнаруженная у экстремоалкалифильных микробов. Фермент позволяет избежать проблемы низкого уровня мембранного дельта-мю Н+ в экстремально щелочных условиях, эффективно преобразуя его в дельта-мю Na+. C целью подобрать условия и разработать модели защиты от альтерирующего воздействия ишемии-реперфузии были исследованы последствия этого воздействия на моделях органа (почки и мозга) и травмы (мозг), а для клеточных культур – кислородно- глюкозная депривация как модель ишемии. Изучено также положительное влияние ограничения калорийности (ОК) на ишемию-реперфузию, проявляющееся только у молодых крыс. В результате обобщения современных знаний об изменениях внутриклеточных механизмов контроля Na+ и Ca2+ в процессе заболевания и их последствия для митохондриального гомеостаза Ca2+ сделано предположение, что окислительно-восстановительный статус сердца вместе с цитоплазматическими концентрациями Na+ могут действовать как регуляторы митохондриального уровня Ca2+ в этой патологии и ответа, который в конечном итоге будет стимулировать поставку АТФ и регулировать окислительный стресс. Используя клетки дрожжей с регулируемым уровнем экспрессии переносчика адениновых нуклеотидов AAC2, была исследована взаимосвязь активности AAC2 со структурой митохондрий, показавшая, что снижение экспрессии AAC2 практически полностью блокирует обмен АТФ и АДФ между матриксом митохондрий и цитоплазмой, а также вызывает фрагментацию митохондрий. Было показано, что разобщители оказались эффективными индукторами системы множественной лекарственной устойчивости АВС, что снижает эффективность антигрибкового действия стандартных азольных антимикотиков. Показано, что эстрадиол, тестостерон и другие стероидные гормоны ингибируют цитохром с оксидазу (ЦО) из сердца быка. Предполагается, что гормоны могут связываться с ЦО в специальном сайте связывания желчных кислот, описанным недавно группой Фергюсон-Миллер, и нарушать транспорт протонов по К-каналу. Результаты указывают на возможность существования неизвестного ранее пути влияния гормонов на окислительное фосфорилирование: через прямое взаимодействие с ключевым ферментом дыхательной цепи, вызывающее изменение его активности. Полученные в 2020г мутантные штаммы почвенной азотофиксирующей бактерии Azotobacter vinelandii с инактивированными NADH:хинон оксидоредуктазами NDH-1, NQR и NDH-2 позволили показать, что NQR является единственным генератором натриевого потенциала в дыхательной цепи A. vinelandii и инактивация этого фермента может приводить к отсутствию движущей силы для работы RNF и к недостатку восстановленного ферредоксина (флаводоксина) для работы нитрогеназного комплекса.
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Исследование механизмов преобразования энергии в мембранных системах, связанное с циклическим переносом ионов водорода и натрия ферментами электрон-транспортных цепей, механизмов продукции активных форм кислорода и их роли в физиологии клетки
Результаты этапа: С помощью митохондриально-направленных зондов на основе SkQ1 в рамках гостемы в 2021 году было проведено многоплановое исследование участия митохондрий в регуляции воспалительных реакций и патологий, связанных с окислительным стрессом, а также детекции окисления кардиолипина.. В частности, проанализировано участие митохондрий в нейтрофильном воспалениии и нарушении функций эндотелия при острых легочных инфекциях, включая COVID-19. Продолжено изучение участия митохондрий в регуляции аутофагии и роли различных механизмов элиминации дефектных митохондрий в клеточной физиологии. Методом электронной микроскопии проанализирована роль митохондриального аппарата в процессах старения. Сравнение состояния митохондрий скелетных мышц у быстро стареющих организмов (мышей и крыс Wistar и OXYS) и нестареющего голого землекопа показало, что у голого землекопа наблюдается нарастающая с возрастом эффективность работы фосфорилирующей системы, предупреждающая развитие саркопении, что отличает его от мышей, крыс Wistar и OXYS, где обусловленные возрастом нарушения структурной организации митохондриального аппарата могут являться одной из основных причин развития возраст-зависимых патологий. Методом крио-электронной томографии впервые удалось реконструировать надмолекулярную структуру крист внутренней мембраны митохондрий и показать, что ряды суперкомплексов ферментов дыхательной цепи могут стыковаться с рядами АТФ-синтаз, образуя организованные структурные кластеры. Подвергнута сомнению положительная роль так называемого «мягкого» разобщения окислительного фосфорилирования, основная суть которого состоит в направленном уменьшении эффективности работы энергетической машины митохондрий, производящей АТР, Анализ показал, что наряду с явно положительными эффектами, мягкое разобщение сопровождается рядом трудно контролируемых и достаточно опасных процессов в клетке и организме, которые особенно выражены при работе головного мозга. Показано, что в разобщающем действии динитрофенола (ДНФ) участвует АДФ-АТФ-транслокатор (ANT), причем активное участие во взаимодействии ДНФ с ANT принимает аргинин 79. Изучен также механизм множественной лекарственной устойчивости у пекарских дрожжей и роль в этом процессе АВС-переносчиков. В рамках изучения молекулярного механизма преобразования энергии в биологических мембранах, связанного с циклической трансмембранной транслокацией ионов натрия, сделано заключение, что у A. vinelandii RNF-комплексы, катализирующие перенос электронов между ферредоксином и NAD+, сопряженный с векторным переносом Na+ через цитоплазматическую мембрану,. являются основным источником необходимых для азотофиксации низкопотенциальных восстановителей, а флавин трансфераза ApbE вовлечена в флавинилирование этих комплексов и необходима для их ферментативной активности. Показано, что механизм ингибирования цитохромоксидазы (ЦО) детергентом тритоном Х-100 сходен с механизмом действия на нее стероидных и тироидных гормонов и определяется нарушением движения протонов по К-каналу.
4 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Исследование механизмов преобразования энергии в мембранных системах, связанное с циклическим переносом ионов водорода и натрия ферментами электрон-транспортных цепей, механизмов продукции активных форм кислорода и их роли в физиологии клетки
Результаты этапа: Продолжение исследований участия митохондрий в регуляции воспалительных реакций позволило показать, что «роение» нейтрофилов, а также образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET) зависят от митохондриальных АФК. Получены важные данные по обоснованию гипотезы, согласно которой АТФ-синтаза (F1Fo) может кроме установленного транспорта протонов, также осуществлять транспорт ионов калия и синтезировать АТФ за счет градиента К+. Показано, что АТФ-синтаза выполняет функции первичного митохондриального К+ “унипортера”. Компьютерное моделирование позволяет оценить роль K-движущей силы в модуляции энергетических характеристик митохондрий. Полученные результаты подтверждают имеющиеся экспериментальные данные о синтезе АТФ, обусловленном транспортом K+ и H+ через АТФ-синтазу F1Fo. Использование штаммов пекарских дрожжей с делецией генов ингибиторных белков InhIpи/илиStfIp, а также штамма, в котором снижено АДФ-ингибирование АТФазной активности протонной F1Fo АТФ-синтазы показало роль исследуемых регуляторных механизмов ингибирования АТФ-азной активности в сохранении жизнеспособности дрожжевой клетки, в частности при голодании. Изучение взаимосвязи клеточной энергетики и системы лекарственной резистентности дрожжей показало, что дефицит углерода в стационарной фазе роста дрожжей приводит к значительному снижению содержание в клетках ABC-переносчиков с широкой субстратной специфичностью. Использование двух независимых подходов (длинноволнового сдвига полос поглощения гема а2+, вызываемого ионами Са2+ и фотовыцветание полос гемов, вызываемое фемтосекундными лазерными вспышками) позволило реконструировать индивидуальные спектры восстановленных гемов, которые характеризуются расщеплением электронных переходов B0x-, B0y. , длинноволновым сдвигом гема а2+ по отношению к гему а3.и плечом при ~425нм, принадлежащим гему а32+. Доказано, что энергетика бактерий Thioalkalivibrio действительно базируется на использовании натриевого насоса на конце дыхательной цепи - Na+-транспортирующей цитохром-с-оксидазы (ЦО) . Впервые показано, что терминальная оксидаза обладает функцией первичного транспортера Na+ и генерирует высокий электрический потенциал. Разобщение под действием BAM15 более чувствительно к КАТР в митохондриях сердца, чем в печени. В обоих случаях ингибитор антипортера вызывает частичное ресопряжение митохондрий. Эти результаты свидетельствуют об участии белка внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии BAM15.
5 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Исследование механизмов преобразования энергии в мембранных системах, связанное с циклическим переносом ионов водорода и натрия ферментами электрон-транспортных цепей, механизмов продукции активных форм кислорода и их роли в физиологии клетки
Результаты этапа: В результате работ по гостеме в 2023 году был получен целый ряд важных результатов. Показано, что перекисное окисление липидов необходимо для развития ферроптоза, который можно предотвратить с помощью SkQ1 и метиленового синего. TNF препятствует миогенезу в культуре миобластов, но под действием SkQ1 эффект ослабляется. Предполагается, что он связан с повышением уровня активных форм кислорода в митохондриях. Представлены данные указывающие на преимущества в использовании митохондриально-направленных антиоксидантов для терапии некоторых форм рака. Получен мутант цитохрома с, лишенный в результате замен своей основной функции транспорта электронов в дыхательной цепи, который предложено использовать как эффективный детектор для слежения за генерацией супероксида в митохондриях или других системах. В бактерии Escherichia coli обнаружен цитохром bd-I гораздо более устойчивый к ингибированию CO, чем другие имеющиеся у этой бактерии цитохром bd-II и цитохром bo3, что имеет важное значение для физиологии. Постулировано, аргументировано, а потом и доказано наличие в митохондриях сопряженного с синтезом АТР транспорта катионов щелочных металлов через канал, образованный с-кольцами части Fo АТР синтазы. Анализ механизма малого (регуляторного) набухания митохондрий показал, что оно обеспечивается исключительно транспортом воды через АТР синтазу, сопряженным с транспортом катионов. В результате этого АТР синтазу можно считать как некую водопроводную систему в клетке наряду с известными воднотранспортными системами типа аквапоринов. Доказана эквипотенциальность внутренней мембраны митохондриального ретикулума при неизменном градиенте ионов водорода через мембрану, что обеспчивает уравнивание рН внутри клетки. Исследован механизм MgАДФ-ингибирования АТФ-синтазы термофильной бактерии Bacillus sp. PS3. Показано воздействие на него LDAO и замены V363I в субъединице α. Изучено влияние Эргостерина с пришитым трифенилфосфонием на скорость роста дрожжей S.cerevisiae дикого типа, а также разнообразных мутантов с изменением биосинтеза и транспорта эргостерина. Выдвинута и проанализирована теоретическая модель, объясняющая синхронное открывание двух связанных грамицидиновых каналов в бислойной липидной мембране. Проведен контекстный анализ расположения гена, кодирующего периплазматическую DMSP-лиазу DddY у различных бактерий. Показано, что в геноме многих бактерий (например, из родов Shewanella, Ferrimonas и Arcobacter) этот ген соседствует с генами гипотетических флавоцитохромов с.
6 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Исследование механизмов преобразования энергии в мембранных системах, связанное с циклическим переносом ионов водорода и натрия ферментами электрон-транспортных цепей, механизмов продукции активных форм кислорода и их роли в физиологии клетки
Результаты этапа:
7 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Исследование механизмов преобразования энергии в мембранных системах, связанное с циклическим переносом ионов водорода и натрия ферментами электрон-транспортных цепей, механизмов продукции активных форм кислорода и их роли в физиологии клетки
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен
1. Статья в высокорейтинговом журнале ijms-25-08237.pdf 3,6 МБ 9 декабря 2024 [VygodinaTV]
2. Статья в высокорейтинговом журнале ijms-25-01277.pdf 3,9 МБ 9 декабря 2024 [VygodinaTV]