ИСТИНА

Органические и неорганические полифосфаты играют ключевую роль в обеспечении энергией и регуляции многих биологических процессов, в том числе активного транспорта ионов через мембраны. В некоторых бактериях роль АТР как источника энергии для мембранного транспорта катионов может альтернативно выполнять пирофосфат (PPi). Считается, что PPi-зависимые белки сохранились с древних времен, когда АТР еще не было и вся энергетика клетки, возможно, базировалась на PPi. Данный проект направлен на установление химических механизмов, лежащих в основе координации гидролиза PPi с выделением тепла и транспортом катионов в бактериях. В рамках данного проекта мы изучали структуру, регуляцию и механизм действия двух эволюционно не связанных ферментов, превращающих PPi в бактериях – растворимой CBS-пирофосфатазы (CBS-РРазы) и мембранной Na-транспортирующей пирофосфатазы (мРРазы). CBS-РРазы имеют длинные вставки (сотни аминокислотных остатков), содержащие два CBS-домена. CBS-домены найдены в тысячах других белков (например, у человека есть 75 CBS-белков), и через них осуществляется регуляция адениновыми нуклеотидами. мРРазы используют энергию PPi для транспорта ионов H+ и Na+ через мембрану. Ниже приведены основные полученные результаты.

CBS-пирофосфатазы: - Получены в чистом виде CBS-пирофосфатазы бактерий Desulfitobacterium hafniense, Clostridium novyi, Clostridium perfringens, Eggerthella lenta и Ethanoligenens harbinense. - Методами электрофореза и аналитического ультрацентрифугирования показано, что молекулы этих ферментов состоят из двух одинаковых субъединиц. Субъединицы можно разделить удалив из ферментов ионы металлов. - Методами генетической инженерии из молекулы фермента удалены регуляторные CBS-домены. Полученный «укороченный» фермент проявляет каталитическую активность, но она, в отличие от полноразмерного фермента, не регулируется адениновыми нуклеотидами (AMP, ADP, ATP). - Обнаружено, что две субъединицы CBS-пирофосфатазы ведут себя не независимо при связывании субстрата и регулирующих нуклеотидов: их связывание в одной субъединице сильно стимулирует связывание во второй (т.е. проявляется положительная кооперативность связывания). Это свойство обеспечивает резкое изменение активности фермента при небольшом изменении концентрации адениновых нуклеотидов в клетке. - Диаденозинтетрафоcфат связывается с беспрецедентно высоким сродством (константа диссоциации комплекса – 10-8М), но некооперативно, поскольку занимает оба регуляторных центра фермента. Мембранные пирофосфатазы: - До недавнего времени считалось, что мембранные Na-транспортирующие пирофосфатазы бактерий и архей способны катализировать активный транспорт только ионов Na+. Мы показали, что Na-пирофосфатазы способны транспортировать также и Н+, но из-за того, что в клетке много Na+, Н+-транспортная активность не проявляется. - Обнаружено семейство мембранных пирофосфатаз, которые могут одновременно транспортировать ионы H+ and Na+ в присутствии физиологических концентраций Na+ (>10 мМ). Такие пирофосфатазы есть у многих бактерий, обитающих в желудочно-кишечном тракте человека. - Обнаружено семейство Н+-пирофосфатаз, которые, в отличие от всех известных Н+-пирофосфатаз, ингибируется ионами Na+. - В совокупности эти результаты показали, что Na+ и H+ могут транспортироваться по сходным механизмам, а переключение специфичности требует лишь небольших структурных изменений. - На основе анализа собственных и литературных данных сформулирован вероятный механизм транспорта катионов мембранными пирофосфатазами. Этот механизм принципиально отличается от механизма действия катион-транспортирующих АТРаз, в которых каталитический центр и транспортирующий канал разделены в пространстве и сопряжение гидролиза с транспортом осуществляется за счет аллостерических эффектов.