Вирусный патогенез: роль вирусных и клеточных белковНИР

Viral pathogenesis: role of viral and cellular proteins

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Вирусный патогенез: роль вирусных и клеточных белков
Результаты этапа: РЕФЕРАТ Ключевые слова: вирусы растений, вирусы человека и животных, транспортные белки, белки оболочки, белки вируса гриппа, структура и функции, белок-белковые взаимодействия, диагностические антитела Ключевые слова по-английски: plant viruses, human viruses, movement proteins, coat proteins, proteins of influenza virus, structure and functions, protein-protein interaction, diagnostic antibodies Отчет включает Введение (2 стр.), Основную часть (11 стр.) и Заключение (2 стр.), приложения отсутствуют. Объектом исследования являются вирусы растений, принадлежащие к различным таксономическим группам, оболочечные вирусы человека и животных, вирусспецифические белки и клеточные белки, участвующие в различных этапах жизненного цикла вирусов. Цель работы: фундаментальные исследования взаимодействия вирусных и клеточных белков в процессе вирусной инфекции, структурная и функциональная характеристика вирусспецифических белков и отдельных пептидов, физико-химическая характеристика факторов, определяющих процессы агрегации и диссоциации белков на моделях термической аморфной агрегации белков оболочки вирусов растений. В результате проведенных исследований нами получены следующие результаты: - Разработаны экспериментальные подходы для изучения способности белков бинарного транспортного блока вируса зеленой пятнистости гибискуса изменять пропускную способность микроканалов плазмодесм, обеспечивающую межклеточный транспорт. - В целях идентификации антивирусных защитных генов, способных влиять на транспорт транспортных белков вируса табачной мозаики и вируса зеленой пятнистости гибискуса или регулировать функционирование ПД, отработаны методики и проводится количественная оценка накопления каллозы в ПД и динамики ее изменений. Отложение каллозы является одним из маркеров регуляции функций ПД. - На основании полученных результатов сделан вывод о важной роли мембран эндоплазматического ретикулума (ЭПР) в транспорте вируса от клетки к клетке, и подтверждена модель механизма транспорта, основанная на латеральном движении транспортного белка вдоль мембран ЭПР к плазмодесмам. - Выявлены прямые взаимодействия между ядерными белками растения, участвующими в вирусной инфекции, и белками гордеивируса штриховатой мозаики ячменя. - С использованием различных физико-химических методов изучены факторы, определяющие направление процессов агрегации и диссоциации белков на моделях термической аморфной агрегации белка оболочки нитевидного А вируса картофеля и вируса табачной мозаики. - Охарактеризованы термально обусловленные перестройки в структуре белка оболочки вируса табачной мозаики, что позволяет осуществлять дизайн биологически активных комплексов, основываясь на информации о составе поверхности и методах неспецифического биоконгъюгирования. - Разработан метод получения антител к необратимо денатурированным капсидным белкам для иммунодиагностики вирусов растений - С использованием метода обратной генетики проведен анализ морфологии рекомбинантных вирионов вируса гриппа. Показано, что вирусспецифический белок М1, который считается важнейшей детерминантой, влияющей на форму вирионов, проявляет себя по-разному при выращивании вируса в клетках разного типа. - Получены новые данные о влиянии CRAC-содержащих пептидов, соответствующих амфипатическим альфа-спиралям белка М1 вируса гриппа, на холестерин-зависимое взаимодействие макрофагов IC-21 с чужеродными частицами. Такие пептиды могут рассматриваться как потенциальные регуляторы активности иммунокомпетентных клеток и могут служить основой для разработки антивирусных и иммуномодулирующих препаратов. - Выполнен дизайн ряда новых пептидов на основе CRAC-мотивов, обнаруженных в составе амфипатических спиралей в белке NEP вируса гриппа. Проводимые в рамках государственного задания исследования осуществляются на разнообразных моделях, включающих вирусы растений из различных таксономических групп, вирусы человека и животных (оболочечные вирусы гриппа и вируса Ньюкастла), вирусспецифические белки и клеточные белки, взаимодействующие с вирусными белками в процессе инфекции. Исследуются различные этапы жизненного цикла вирусов, включая механизмы инфицирования клеток, транспорта вирусов в растениях, защитных реакций растения, функции клеточных белков, взаимодействующих с компонентами вирусов. Особое внимание уделено физико-химической характеристике факторов, определяющих процессы агрегации и диссоциации белков на моделях термической аморфной агрегации белков оболочки двух вирусов растений. Все полученные результаты являются новыми и оригинальными и соответствуют мировому уровню в данных областях исследований. ВВЕДЕНИЕ Вирусы растений кодируют транспортные белки (ТБ), необходимые для межклеточного и дальнего транспорта вирусного генома, что приводит к заражению всего растения. Функции ТБ заключаются как в доставке вирусного генома к плазмодесмам (ПД), так и в его транслокации через плазмодесмы в соседние клетки. Принято считать, что вирусные ТБ используют те же пути и механизмы транспорта между соседними клетками, что и собственные, эндогенные, белки растений. Более того, ТБ, кодируемые вирусами растений с РНК-геномами, функционально сходны с некоторыми белками растений, способными обеспечивать и собственный межклеточный транспорт, и транспорт мРНК данных белков. В силу этих причин вирусные ТБ часто используются в качестве моделей для исследования молекулярных механизмов межклеточного транспорта РНК и белков в растениях. ТБ, кодируемые эволюционно удаленными вирусами, весьма разнообразны с точки зрения структуры и биохимических свойств. Функция вирусного транспорта может выполняться одним ТБ, либо несколькими вирусными ТБ, кодируемыми вирусным геномом. Механизм регуляции пропускной способности ПД как в здоровом растении, так и в зараженном в настоящее время, по-прежнему, изучен крайне слабо и неполно. Изучение тонких механизмов транспорта вирусного генома в растениях является актуальной проблемой, активно изучаемой нами на различных моделях (вирусах, принадлежащих к различным таксономическим группам). Активное изучение роли ядра и субъядерных структур в вирусной инфекции началось около 15 лет тому назад. Исследования, проведенные на вирусах животных и человека, а затем и на вирусах растений показали, что не только вирусы, репликационный цикл которых проходит в ядре, но и все изученные, так называемые, цитоплазматические вирусы (репликационный цикл, которых проходит в цитоплазме клетки) активно взаимодействуют с ядром, его компартментами и отдельными ядерными белками, и это взаимодействие является необходимым этапом в цикле вирусной инфекции. Существенно, что белки ядра используются вирусом на различных (практически на всех) стадиях инфекционного цикла. Изучение участия клеточных белков в процессах распространения вирусной инфекции в растениях, в защитной реакции растения на вирусную инфекцию и в контрзащитной реакции вируса вносят вклад в новую быстро развивающуюся область исследований неканонических функций клеточных белков при вирусных инфекциях, и детализируют молекулярные механизмы взаимодействия вирус-клетка. На практическом уровне и в долгосрочной перспективе эта работа может привести к развитию новых подходов к контролю вирусных инфекций. Вирусы растений (немодифицированные и модифицированные) являются перспективной наноплатформой для разнообразных биомедицинских и биотехнологических приложений. Детальный физико-химический анализ структуры подобных наноразмерных объектов важен для их практического использования. Ранее была описана способность нативного вируса табачной мозаики (ВТМ) при термической обработке при 94°Ć образовывать сферические частицы, обладающие рядом уникальных свойств. Среди них - стабильность, уникальные адсорбционные свойства и иммуностимулирующий потенциал. Использование комплементарных физико-химических методов позволяет детализировать особенности структуры поверхности наночастиц, что существенно для дизайна биологически активных комплексов. Вирус гриппа – оболочечный вирус семейства Orthomyxoviridae. Вирус гриппа на сегодняшний день является наиболее изученным из вирусных патогенов человека. Тем не менее, накопленных в науке данных явно недостаточно как для полного представления о механизмах инфицирования организма, так и для обеспечения надежной защиты человеческой популяции от ежегодных вспышек заболевания, эпидемий и пандемий. Этот болезнетворный агент обладает большим потенциалом изменчивости, что серьезно затрудняет прогнозы по выбору актуального штамма для вакцинации населения. Фундаментальный анализ механизмов патогенеза вируса с целью прогнозирования новых антивирусных стратегий остается по-прежнему актуальным. Вирус гриппа попадает в клетку путем эндоцитоза. Слияние оболочки вириона и мембраны поздней клеточной эндосомы при низком рН приводит к выходу вирусного генома в цитоплазму. Этот процесс опосредует основной вирусный антиген - гемагглютинин (НА). Взаимодействуя с матриксным белком М1, образующим при нейтральном рН «каркас» под вирусной мембраной, НА также вовлечен в процессы сборки и почкования дочерних вирионов. В рамках выполнения госзадания 2019 г. продолжено изучение структурных факторов, обеспечивающих образование белок-белковых и белок-липидных комплексов, и определение функциональных и структурных детерминант взаимодействия указанных белков вируса гриппа и матриксного белка вируса Ньюкастла в процессе инфицирования клеток. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 1. Изучение способности белков бинарного транспортного блока вируса зеленой пятнистости гибискуса изменять пропускную способность микроканалов плазмодесм. Недавно нами открыт новый блок транспортных генов, кодируемый геномом вируса зеленой пятнистости гибискуса (ВЗПГ), названный бинарным транспортным блоком (БТБ), который существенно отличается от двух известных типов тройного блока генов (ТБГ) и может быть отнесен к третьему типу ТБГ (Lezzhov et al., 2017). Показано, что два белка, кодируемые открытыми рамками трасляции - ОРТ2 и ОРТ3 РНК2 ВЗПГ, являются необходимыми и достаточными для комплементации межклеточного транспорта мутантного Х-вируса картофеля. В клетках агроинфильтрированных листьев N. benthamiana первый белок, кодируемый этим блоком (БТБ1, вирусная хеликаза), распределен диффузно, тогда как в присутствие БТБ2 происходит перераспределение БТБ1 к клеточной периферии и внутрь плазмодесм (ПД) клеточной стенки. На данном этапе изучена способность белков бинарного транспортного блока вируса зеленой пятнистости гибискуса изменять пропускную способность микроканалов ПД. Применено два подхода, базирующихся на методе транзиентной агробактериальной трансформации. В первом случае анализировали способность мономерного зеленого флуоресцентного белка (GFP) или «тандемного» GFP (две молекулы GFP, объединенные в одну полипептидную цепь) диффундировать из первично трансформированных клеток в контрольных пробах и листьях, также экспрессирующих БТБ1 или БТБ2. Тандемный GFP был получен в ходе выполнения проекта дублированием гена GFP. Ген тандемного белка был перенесен в модифицированный бинарный вектор pLH9000, и полученной конструкцией трансформировали клетки Agrobacterium tumefaciens. Культуры агробактерий, несущих гены БТБ1, БТБ2, мономерного или тандемного GFP, инфильтрировали в различных комбинациях и условиях в листья Nicotiana benthamiana. БТБ-несущие агрокультуры в высокой концентрации клеток смешивали с GFP-несущими культурами в низкой концентрации, получая, таким образом, индивидуальные, далеко отстоящие друг от друга флуоресцирующие клетки в едином поле клеток, трансформированных БТБ белками. Далее оценивали диффузию GFP или 2хGFP в соседние клетки. В используемой нами экспериментальной системе «тандемный» GFP не был способен эффективно транспортироваться ни в присутствии БТБ1, ни в присутствии БТБ2. Мономерный GFР характеризовался низким уровнем экспрессии, не позволяя количественно и достоверно оценить межклеточный транспорт. Поэтому мы применили второй подход: для экспрессии мономерного GFP использовали вирусный вектор, дефицитный по функции транспорта, но с крайне высоким уровнем накопления свободного GFP белка в цитоплазме. Эксперименты проводили по описанной выше схеме и оценивали эффективность диффузии GFP в присутствии БТБ1 и БТБ2. Использованный подход является новым, адаптируя метод агробактериальной трансформации для решения задач, ранее решавшихся методом бомбардировки листьев микрочастицами металла, несущими плазмидную ДНК. 2. Разработка подходов к идентификации антивирусных защитных генов растения, способных влиять на межклеточный транспорт транспортных белков ВТМ и ВЗПГ или регулировать функционирование плазмодесм. Одной из целей проекта является идентификация антивирусных защитных генов, способных влиять на ТБ ВТМ или регулировать функционирование ПД. Одним из маркеров регуляции функций ПД является отложение каллозы. К настоящему моменту наработаны методики и проводится количественная оценка накопления каллозы в ПД и динамики ее изменений. Для этого используются трансгенные растения, конститутивно экспрессирующие TБ ВТМ, слитый с мономерным красным флуоресцентным белком (mRFP), растения дикого типа и зараженные ВТМ, а также мутанты, дефектные по защитным функциям. Исследование влияние экспрессии белков БТБ ВЗПГ на отложения каллозы в ПД планируется реализовать в ходе выполнения этапа работы 2020 г. Кроме того, отработана методика приготовления образцов растительных тканей для визуализации ПД с помощью серийной сканирующей электронной микроскопии (BFSEM). Проведено исследование суб-компартмента кортикального ЭПР, локализованном вблизи ПД и в котором происходит накопление ТБ ВЗПГ по пути к ПД. Для реализации этой части проекта нами были клонированы гены белков, определяющих функционирование и морфологию ЭПР: Vap27, SYTA, RTNLB13, а также Rhd3 и его доминантно-негативный мутант (Stefano et al., 2014; Wang et al., 2014). Полные кодирующие последовательности генов RTLN13 и Rhd3 были амплифицированы на матрице кДНК Arabidopsis thaliana с использованием специфических праймеров, несущих необходимые для последующего клонирования сайты рестрикции. Аналогичным образом, кодирующие последовательности Vap27 и SYTA были амплифицирована на матрице кДНК N. benthamiana. Полученные фрагменты ДНК после обработки соответствующими рестриктазами были клонированы в модифицированный бинарный вектор рLH9000 под контроль 35S промотера. Вирусспецифические вставки в полученных клонах были секвенированы, и были отобраны клоны с искомой последовательностью. Далее был получен набор белков Vap27, SYTA и Rhd3, слитных с флуоресцирующими белками GFP или mRFP. Полученными векторными конструкциями трансформировали клетки A. tumefaciens, которые в свою очередь использовали для инфильтрации листьев N.benthamiana. Внутриклеточную локализацию белков, экспрессированных индивидуально или в комбинации с БТБ белкам, изучали с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии на 2-ой или 3-ий дни после инфильтрации. На основании полученных результатов был сделан вывод о важной роли мембран ЭПР в транспорте вируса от клетки к клетке, и подтверждена модель механизма транспорта, основанная на латеральном движении ТБ вдоль мембран ЭПР к ПД. В ранее опубликованной нами работе мы показали, что БТБ2 может транспортироваться к клеточной периферии посредством актин-зависимой латеральной транслокации вдоль сети ЭПР (Lazareva et al., 2017). Транспорт вдоль мембран ЭПР в растительной клетке невозможно рассматривать в отрыве от функционирования актинового цитоскелета. Для детализации механизма этого процесса использовали доминантно-негативные мутанты миозинов (Myo) класса XI и VIII, которые позволяют разделить этап ингибиторного действия: транспорт по актиновому цитосклетеру вдоль ЭПР требует активности MyoXI, а транслокация от точек ЭПР вблизи ПД внутрь микроканалов ПД и далее в соседние клетки определяется миозинами класса VIII (Amari et al., 2014). На этом этапе работы использовали методы агробактериальной трансформации растений и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Был изучен механизм транспорта для белков БТБ в сравнении с ТБ ВТМ. По всей видимости, молекулярный механизм транслокации транспортных белков вирусов различных таксономических групп через ПД может разниться у различных вирусов. Отработан метод флуоресцентного индуктивно–резонансного переноса энергии (FLIM-FRET) и получены предварительные данные о взаимодействии GFP-БТБ1 и БТБ2-mRFP in vivo в периферических тельцах. Полученные данные являются первым экспериментальным подтверждением взаимодействия первого и второго транспортных белков БТБ in vivo и будут готовы к публикации после повторения этой серии экспериментов в расширенном варианте. Проводятся работы по характеризации интерактома ТБ ВТМ, локализованного в ПД. Используя трансгенные растения N.tabacum, конститутивно экспрессирующие ТБ ВТМ, слитый с RFP, тестировали различные протоколы выделения фракции, обогащенной клеточными стенками и ПД. Была проведена иммунопреципитация ТБ ВТМ слитого c RFP с помощью RFP-trap (Chromotek) для выделения ТБ ВТМ, слитого c RFP, совместно с взаимодействующими с ним белками. Далее проводили анализ полученного препарата белков с помощью масс-спектрометрии. Результаты требуют улучшения методики выделения фракции, обогащенной ПД. Эти исследования проводятся в настоящее время. 3. Выявление взаимодействий между белками растения, участвующими в вирусной инфекции, и вирусспецифическими белками гордеивируса штриховатой мозаики ячменя. Ранее нами было показано, что ядерные белки фибрилларин (белок ядрышка) и коилин (белок телец Кахаля) выполняют важную функциональную роль в процессе вирусной инфекции, ингибируя или напротив, стимулируя репликацию различных вирусов (Kim et al., 2007; Shaw et al., 2014; Love et al, 2017). Для понимания механизма, ответственного за эти процессы, важным этапом является выявление прямых белок-белковых взаимодействий между клеточными и вирусными белками методом дрожжевой двугибридной системы с помощью активатора транскрипции GAL4. Целью настоящей работы являлось выявление взаимодействия между отдельными ядерными белками - фибрилларином, коилином, поли(АДФ-рибоза) полимеразой (PARP), циклофилином и белком ELP, участвующим в транспорте липидов (последний использовали как отрицательный контроль), а также между ядерными белками и вирусспецифическими белками вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и Y вируса картофеля (YВК). Для проверки взаимодействия были созданы конструкции, несущие одну из половинок каждого белка. Полученными плазмидами с химерными белками, несущими активаторный или ДНК-связывающий домены, котрансформировали клетки Saccharomyces cerevisiae. В работе использовали специальные штаммы дрожжей, которые могут расти на средах без некоторых аминокислот (триптофан и лейцин). Несколько колоний пересевали на чашки Петри с селективной средой (без лейцина, триптофана, аденина и гистидина). При взаимодействии белков происходит активация генов биосинтеза аденина и гистидина, и рост колоний. С использованием дрожжевой двугибридной системы нам удалось установить следующие взаимодействия: (1) PARP – фибрилларин, коилин, циклофилин; (2) фибрилларин - PARP, коилин; (3) коилин-фибрилларин; (4) циклофилин – PARP. Существенно, что вышеуказанные взаимодействия белков носили «сильный» характер, поскольку они выявляются как на среде без 3-х аминокислот (триптофан, лейцин, гистидин в присутствии 3AT, 3-амино-1,2,4-триазола, конкурентного ингибитора продукта гена HIS3, который используется в дрожжевой двугибридной системе для выявления более стойкого взаимодействия белков), так и на среде без 3-х аминокислот (триптофан, лейцин, гистидин) и аденина. Слабое взаимодействие демонстрируют белки циклофилин – PARP (их взаимодействие отсутствует уже на среде без 3-х аминокислот). Таким образом, наиболее сильные взаимодействия характерны для следующих пар белков (1) PARP – фибрилларин, PARP – коилин; (2) фибрилларин - PARP, фибрилларин - коилин и (3) коилин - фибрилларин. В целом, полученные результаты позволяют предположить, что коилин/фибрилларин являются сенсорами, которые в ответ на вирусную инфекцию (прямое взаимодействие с вирусным белком) модулируют активность PARP и соответственно защитный ответ растения. Стимуляция дальнего транспорта гордеивируса ВШМЯ, которая наблюдается в трансгенных растениях с дефицитом коилина/фибрилларина или при отсутствии прямого взаимодействия транспортного белка ТБГ1 ВШМЯ и коилина, возможно, объясняется ослаблением защитного ответа растения. Изучение взаимодействия вирусспецифических белков ВШМЯ (белков ТБГ1 и белка γb) с ядерными белками фибрилларином, коилином, PARP и циклофилином показало сильное взаимодействие между вирусным белком γb и коилином. Этот факт не является удивительным, поскольку ранее мы наблюдали взаимодействие между коилином и белком γb, другого гордеивируса полулатентного вируса мятлика методом бимолекулярной флуоресцентной комплементации. Белок γb является супрессором сайленсинга, фактором дальнего транспорта и фактором патогенности. Локализация вирусного белка с подобными активностями в ядрышке соответствует современным представлениям о необходимости подобной локализации для успешного транспорта по проводящей системе растения и индукции патогенеза. Ответ растения на инфекцию потивирусом YВК, опосредованный коилином/фибрилларином, отличается от защитного механизма, вовлеченного в ответ на инфекцию гордеивирусом: дефицит коилина/фибрилларина в ТР заметно ингибирует накопление потивируса в инфицированных и системных листьях, но не влияет на системный транспорт YВК. Частичное выключение экспрессии гена поли(АДФ-рибоза)полимеразы и применение ингибитора активности фермента (3-аминобензамида) практически не влияли на инфекцию YВК. Анализ маркеров защитного ответа растения выявил заметное увеличение экспрессии гена, кодирующего белок PR-1b, связанный с патогенезом, и индукцию отложения каллозы, свидетельствуя о том, что фитогормон салициловая кислота, вероятно, вовлечена в защитный ответ растения на потивирусную инфекцию. На данном этапе не удалось показать взаимодействие вышеперечисленных ядерных белков и вирусспецифических белков YВК. 4. Изучение структурных аспектов перестроек вирионов и вирусоподобных частиц вируса табачной мозаики и потивируса А вируса картофеля физико-химическими методами. В соответствии с задачей, направленной на изучение структурных аспектов взаимодействия вирусоподобных частиц на основе потивирусов с иммуногенными пептидами для создания вакцин, изучали склонность белка оболочки к упорядоченной агрегации и самосборке до компактных вирусоподобных частиц. Проведен анализ структуры вирусоподобных частиц различными физико-химическими методами и определены их размеры, форма, стабильность и др. Для проведения конъюгирования на поверхности вирусоподобных частиц, полученных самосборкой белка оболочки А вируса картофеля, синтезирован модифицированный пептид антигена gp100:209-217 (IMDQVPFSV). Изучали факторы, определяющие направление процессов агрегации и диссоциации белков на моделях термической аморфной агрегации белка оболочки потивируса АВК и вируса табачной мозаики (ВТМ). В соответствии с задачей, направленной на изучение структурных аспектов перестроек вирионов и вирусоподобных частиц вируса табачной мозаики была проведена характеризация их в растворе методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Структурный анализ вирионов вируса табачной мозаики (ВТМ) и реполимеров белка в водно-солевом растворе (рН 8,0; 0,1М NaCl) был проведен по данным синхротронного малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) и с помощью просвечивающей электронной микроскопии с негативным контрастом. Такие частицы обладают уникальной стабильностью, но не имеют спиральной симметрии. Препарат реполимера белка содержал гетерогенные по длине поперечно исчерченные палочковидные «стопки дисков». Структурное моделирование этих частиц было выполнено с использованием элемента кристаллографической модели четырехслойного агрегата (1EI7.PDB). Получившиеся модели «стопок дисков» представляли собой полые цилиндры, и мы сравнили их расчетное рассеяние с экспериментальным. Показана лучшая корреляция данных МУРР с моделью из повторяющейся центральной пары дисков. Кривые МУРР практически совпадали для образцов «стопок дисков» ВТМ, полученных разными методами. Положения максимумов интенсивности на кривых рассеяния могут быть использованы как специфическая характеристика образцов и некоторые из них соотнесены с реальными элементами четвертичной структуры частиц (периодичность структуры реполимера, шаг спирали вириона). Впервые структуры с низким разрешением реполимеров белка ВТМ были определены в растворе, в условиях, близких к естественным. Возможные причины расхождения данных рассеяния модельных частиц и реполимеров в растворе обсуждены в работе. Анализ подобных наноразмерных объектов важен для их возможного биомедицинского и биотехнологического применения. Ранее была описана способность нативного вируса табачной мозаики (ВТМ) при термической обработке при 94°Ć образовывать сферические частицы, обладающие рядом уникальных свойств. Среди них - стабильность, уникальные адсорбционные свойства и иммуностимулирующий потенциал. Было проведено сравнительное исследование распределения трития по аминокислотным остаткам белка оболочки вируса табачной мозаики (ВТМ) при обработке атомарным тритием нативных вирионов и свободного белка в виде ди- и тримеров, существующих в растворе при комнатной температуре, а также более крупных частиц, образующихся при нагревании. Полученные результаты сравнивали с компьютерным моделированием процесса включения трития, развиваемого в ИХФ им. Н.Н. Семенова РАН. Обнаружено, что удельная радиоактивность аминокислотных остатков зависит как от степени агрегации белков, так и содержания воды в исследуемых объектах. В случае сферических частиц, полученных термообработкой вирионов, приемлемые величины удельной радиоактивности аминокислот достигались только для лиофилизованных препаратов. Результаты тритиевой планиграфии показали, что термальная трансформация приводит к значительному уменьшению включения тритиевой метки в N- и С-концевые области (аминокислотные остатки с 1-15 и с 142-158). Использование комплементарных физико-химических методов позволило прояснить особенности структуры поверхности наночастиц. Полученные данные позволили рассмотреть термально обусловленные белковые перестройки и открыли возможности дизайна биологически активных комплексов, основываясь на информации о составе поверхности и методах неспецифического биоконгъюгирования. 5. Получение антител к необратимо денатурированным капсидным белкам для иммунодиагностики вирусов растений на примере вируса желтухи свеклы. Многие вирусы растений, животных и человека труднодоступны потому, что они накапливаются в инфицированных тканях в низких титрах. В дополнении, патогенные вирусы представляют опасность в работе с ними. Полимеразная цепная реакция позволяет размножить и установить полинуклеотиды, кодирующие капсидные белки – основные антигены – вирусов. С помощью генетической инженерии эти последовательности могут быть клонированы и экспрессированы в виде белков в бактериях. Однако конформация белков (пространственная форма полипептидов) зависит от свойств окружающей среды, в выделенных белках она отличается от конформации белка в составе вириона. Именно поэтому в литературе упоминаются примеры неудачного применения антител к рекомбинантным капсидным белкам для иммунодиагностики вирусных инфекций. Осложняет проблему и стремление синтезируемых в бактериях вирусных белков к агрегации в нерастворимые «тельца включения». На примере труднодоступного вируса желтухи свёклы, инфекции которого экономически значимы, нами предложен подход для получения антител к полностью и необратимо денатурированному рекомбинантному мажорному белку оболочки р22 – основному антигену этого вируса. В этом подходе выделенный аффинной хроматографией рекомбинантный капсидный белок был кратковременно полностью денатурирован щелочью, а необратимая денатурация фиксирована формальдегидом с последующим восстановлением промежуточных соединений боргидридом натрия. Щелочь является не только наиболее сильным денатурантом, но и прекрасным растворителем белков. Идентичную процедуру необратимой денатурации белков проводили и для экстрактов листовой ткани зараженного и незараженного вирусом растения (отрицательный контроль). Полученные антитела с успехом были использованы для определения вируса желтухи свёклы в инфицированном растении вплоть до 3 нг/мл. 6. Анализ морфологии рекомбинантных вирионов вируса гриппа, получаемых методом обратной генетики. Вирионы вируса гриппа имеют полиморфную морфологию, что важно для репродуктивной активности вируса. Форма частиц (сферические диаметром 80-120 нм, вытянутые, филаментозные – с сечением около 80 нм и длиной до нескольких десятков микрон) зависит от разных факторов. С одной стороны, информация о морфологии вирионов закодирована в генах структурных белков вируса гриппа (главным образом, М-белков). С другой стороны, на форму вирионов могут влиять плохо изученные факторы клетки-хозяина. В 2019 г нами проведен цикл работ по анализу морфологии рекомбинантных вирионов, получаемых методом обратной (реверсной) генетики из восьми плазмид, содержащих вставки восьми ДНК-копий геномных РНК-сегментов штамма A/WSN/33 (H1N1). Согласно литературным данным штамм A/WSN/33 (H1N1) является «строго сферическим». Однако электронно-микроскопический анализ (негативный контраст) препаратов рекомбинантного вируса, накопленного в наших экспериментах в аллантоисной полости куриных эмбрионов, выявил вирионы различных форм, в том числе и филаментозные частицы длиной вплоть до нескольких микрон. Подготовку вирусных препаратов для электронно-микроскопического анализа проводили с использованием специально разработанных протоколов, чтобы минимизировать возможные артефакты, связанные с ультрацентрифугированием вирусной суспензии и/или поверхностным натяжением при высыхании вирусных частиц на сетке. Проведено также «глубокое секвенирование» (NGS-анализ) препаратов рекомбинантного вируса с целью поиска мутаций, которые могут быть причиной аномальной морфологии вирионов. Анализ результатов предсказал две возможные замены в белке М1 относительно последовательности из базы данных для М-гена штамма A/WSN/33 (H1N1), а именно, I219V и S126C. Эти аминокислотные замены были подтверждены масс-спектрометрическим анализом полосы белка в геле после электрофоретического разделения белков вирионов по Лэммли. Выдвинуто предположение, что частично филаментозный фенотип рекомбинантного вируса может быть результатом появления в последовательности белка М1 мутации I219V и/или (скорее) S126C, поскольку последняя мутация – крайне редкая в исчерпывающей выборке последовательностей М1-белка из базы данных. Для проверки данной гипотезы методом ПЦР-мутагенеза были введены обратные замены в белок М1: C126S, а также {C126S + V219I}, трансфекция и накопление вируса в куриных эмбрионах. Последующий электронно-микроскопический анализ, однако, снова выявил высокую гетерогенность вирусных препаратов по форме вирионов. Мутаций в других белках, которые можно было бы связать с морфологией вирионов, метод NGS-анализа не выявил. Также изучена морфология рекомбинантных вирионов, которые накапливаются в клетках линии MDCK. Достоверно установлено, что их морфология строго сферическая. Таким образом, белок М1, который считается важнейшей детерминантой, влияющей на форму вирионов, проявляет себя по-разному при выращивании вируса в клетках разного типа. 7. Исследования структуры, самосборки и взаимодействия с мембраной матриксного белка вируса Ньюкастла. Были продолжены исследования структуры, самосборки и взаимодействия с мембраной матриксного белка вируса Ньюкастла при нейтральном и кислом рН с целью выяснения пути вхождения вируса в клетку при инфицировании и выяснения механизма сборки вирусного белкового scaffold. Предложен новый метод выделения белка M вируса в физиологической ионной силе и использованы самые современные методы, такие как малоугловое рентгеновское рассеяние, атомная силовая микроскопия (АФМ), ab initio моделирование. Комплементарные структурные подходы, а также измерения взаимодействия мембран были использованы для характеризации поведения и структуры этих белков в растворе, а также их связывание с липидными мембранами при рН 4.0 и 7.0. Эта работа важна для понимания вирусного патогенеза, а также носит прикладной характер для возможного использования вируса в качестве адекватного шаблона (template) для создания в будущем лекарства или средства доставки вакцины. Доказано, что минимальной структурной единицей белка является димер, который спонтанно собирается в нейтральной среде в виде полых спиралеобразных олигомеров повторением белковых тетрамеров. В кислых условиях олигомеризация белка понижается до отдельных димеров, тетрамеров, и октамеров без изменения плотности белкового слоя и аффинитета к липидной мембране, указывая, таким образом, на то, что эндоцитозный путь, возможно, способствует входу вируса в инфицируемую клетку посредством усиления разрушения упаковки белка. 8. Изучение влияния CRAC-содержащих пептидов на холестерин зависимое взаимодействие макрофагов IC-21 с чужеродными частицами. Проведены систематические исследования действия синтетических пептидов с аминокислотными последовательностями, соответствующими CRAC-мотивам амфипатических альфа-спиралей белков М1 вируса гриппа на рафто-зависимые взаимодействия (фагоцитозную активность) культивируемых макрофагов IC-21 с неопсонизированными и опсонизированными частицами. Исследовано действие трех синтетических амфипатических пептидов, соответствующих трем α-спиралям вирусного белка M1 и содержащих холестерин-распознающие аминокислотные последовательности (CRAC): LEVLMEWLKTR (пептид №1; 11 а.о., мол.масса 1596); NNMDKAVKLYRKLKR (пептид №2; 15 а.о., мол.масса 2127); GLKNDLLENLQAYQKR (пептид №3; 16 а.о., мол.масса 2171). Получены новые данные о влиянии CRAC-содержащих пептидов на холестерин-зависимое взаимодействие макрофагов IC-21 с чужеродными частицами. Такие пептиды могут рассматриваться как потенциальные регуляторы активности иммунокомпетентных клеток. Кроме того, модуляция активности макрофагов амфипатическими CRAC-содержащими пептидами-фрагментами вирусного белка М1 указывает на то, что подобные модуляции могут иметь место и при взаимодействии вируса с клеткой, и поэтому такие пептиды могут быть полезны при исследовании этих взаимодействий. Как продолжение данного исследования, изучали изменение холестерин зависимой активности макрофагов IC-21 пептидом, содержащим два CRAC мотива из белка М1 вируса гриппа. С целью изучения функциональной роли и механизмов действия пептидов, содержащих CRAC-мотивы, был синтезирован пептид RTKLWEMLVELGNMDKAVKLWRKLKR-NH2 (пептид Р4) на основе комбинации двух пептидов, соответствующих амфипатическим CRAC-содержащим α-спиралям 3 и 6 белка М1. Показано, что пептид Р4 меняет холестерин зависимое взаимодействие культивируемых макрофагов IC-21 с 2-мкм латексными частицами, имитирующими бактерии. Эффект пептида Р4 был дозо-зависимым, имел двухфазный характер и был более выраженным, чем описанные ранее эффекты составляющих его пептидов. Новый пептид Р4 может быть полезен для исследований холестерин зависимых процессов в клетке, а также может служить основой для разработки антивирусных и иммуномодулирующих препаратов. Проведены также биологические исследования действия синтетического пептида с аминокислотной последовательностью белка М1 вируса гриппа, содержащей CRAC-мотив (остатки 228-243), на антиинфекционную активность. Вирус гриппа человека - А/Калифорния/7/09 (H1N1)pdm09, вирус гриппа птиц, выделенный от человека - A/Anhui/1/2013 (Н7N9) были предоставлены Государственной Коллекцией вирусов РФ при ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России. Вирусы культивировали в аллантоисной полости 9–10-ти дневных куриных эмбрионов (КЭ) в течение 48 ч при 36 С°. Клеточная культура MDCK (Madin-Darby Сanine Kidney) – почки собаки (Canis familiaris) породы кокер-спаниель, была предоставлена Всероссийской Коллекцией клеточных культур при ФГБУ «НИ осуществляли на среде DMEM (ИПВЭ РАМН, РФ) с двойным набором аминокислот, 5,0% фетальной телячьей сывороткой («HyClone», США) и антибиотиков. Противовирусную активность исследуемого пептида учитывали по снижению инфекционного титра вируса в культуре клеток МDСК и снижению уровня экспрессии вирусных антигенов с использованием твёрдофазного иммуноферментного анализа (ИФА), модифицированного для тестирования противовирусной активности веществ в культуре клеток. Проведен структурный анализ белка ядерного экспорта (NEP, 14,4 кДа). Структура полноразмерного NEP-С была анализирована совокупностью методов малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) и on line гель-эксклюзионной хроматографией. Предложена пространственная модель N-концевого домена белка, для которого отсутствуют данные РСА. Выполнен дизайн ряда новых пептидов на основе CRAC-мотивов, обнаруженных в составе амфипатических спиралей в белке NEP вируса гриппа. Проведен компьютерный анализ с целью выяснения амилоидогенных участков в вариантах белка NEP, NEP-C, NEP-N. Выявлена высокая склонность белка к агрегации в широком диапазоне условий и предложена рабочая схема процесса. Глубокий анализ литературы и собственные научные результаты последних лет позволили подготовить к публикации в журнале «Биоорганическая химия» обзор «Молекулярные механизмы формирования рафтов биологических мембран» (обзор принят к публикации). В обзоре излагаются экспериментальные и концептуальные достижения последних лет в изучении и осмыслении феномена формирования липидных рафтов в биомембранах и критически рассматриваются проблемы, возникающие в этой области мембранологии. Подробно рассматривается дискуссионный вопрос о роли специфических холестерин-распознающих аминокислотных консенсусных (CRAC) мотивов мембранных белков, а также роль на молекулярном уровне отдельных аминокислот в формировании рафтов и рафтовых биомембран в целом. Особое внимание уделяется структурной организации липидных мембран оболочечных вирусов с мембранами рафтовой природы как объектов, наглядно иллюстрирующих основные механизмы формирования и поддержания рафтов биологических мембран. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Предметом научно-исследовательной работы являются различные аспекты молекулярной вирусологии (на моделях вирусов растений из различных таксономических групп и оболочечных ортомиксовирусов человека и животных) и прикладные разработки. Проводимые исследования позволяют получить новые знания об участии вирусных и клеточных белков в процессах распространения вирусной инфекции в растениях, в защитной реакции растения, выявить на молекулярном и надмолекулярном уровне процессы взаимодействия основных белков вируса гриппа, участвующих в формировании специфического комплекса, в процессе инфицирования клетки. Начаты исследования способности белков бинарного транспортного блока вируса зеленой пятнистости гибискуса изменять пропускную способность микроканалов плазмодесм, важного этапа распространения вируса от клетки к клетке. Проводиться разработка подходов к идентификации антивирусных защитных генов растения, способных влиять на межклеточный транспорт транспортных белков ВТМ и ВЗПГ или регулировать функционирование плазмодесм. Выявлены взаимодействия между ядерными белками растения, участвующими в вирусной инфекции, в частности между белком ядрышка фибрилларином и белком телец Кахаля коилином и вирусспецифическим белком гордеивируса штриховатой мозаики ячменя с функцией супрессора сайленсинга и фактора патогенности. Проведен детальный физико-химический анализ взаимодействия вирусоподобных частиц на основе потивирусов с иммуногенными пептидами и изучены особенности структуры поверхности наночастиц, образующихся при термической обработке нативного вируса табачной мозаики. Структурная характеристика подобных наноразмерных объектов важна для их возможного биомедицинского и биотехнологического применения. В частности, для дизайна биологически активных комплексов за счет биоконгъюгирования . Изучение свойств оболочечных вирусов показано, что мембрано-ассоциированный белок М1 вируса гриппа, который является важнейшей детерминантой, влияющей на форму вирионов, проявляет себя по-разному при выращивании вируса в клетках разного типа. Исследования структуры, самосборки и взаимодействия с мембраной вируса Ньюкастла при различных рН позволило предположить, что эндоцитозный путь возможно способствует входу вируса в инфицируемую клетку посредством усиления разрушения упаковки белка. Проведены исследования влияния фрагментами вирусного белка М1 - амфипатическими CRAC-содержащими пептидами на взаимодействие и активность макрофагов. Так, модуляция активности макрофагов CRAC-содержащими пептидами указывает на то, что подобные процессы могут иметь место и при взаимодействии вируса с клеткой, и поэтому такие пептиды могут быть полезны при исследовании этих взаимодействий. Пептид Р4 на основе комбинации двух пептидов, соответствующих амфипатическим CRAC-содержащим α-спиралям 3 и 6 белка М1 меняет холестерин зависимое взаимодействие культивируемых макрофагов IC-21 с 2-мкм латексными частицами, имитирующими бактерии. Пептид Р4 может быть полезен для исследований холестерин зависимых процессов в клетке, а также может служить основой для разработки антивирусных и иммуномодулирующих препаратов Полученные данные позволят внести заметный вклад в понимание молекулярных механизмов взаимодействия вируса и клетки на различных этапах вирусной инфекции. На практическим уровне и в долгосрочной перспективе эти исследования могут привести к разработке новых подходов к контролю вирусных инфекций растения, а также быть использованными для целенаправленного поиска и разработки новых подходов и препаратов против вирусов человека и новых лекарственных иммуномодулирующих средств. Все полученные результаты являются новыми и оригинальными и соответствуют мировому уровню в соответствующих областях исследований. Полученные результаты опубликованы в российских и международных журналах или подготавливаются к печати, сделаны доклады на российских и международных конференциях.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Вирусный патогенез: роль вирусных и клеточных белков
Результаты этапа:
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Вирусный патогенез: роль вирусных и клеточных белков
Результаты этапа:
4 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Вирусный патогенез: роль вирусных и клеточных белков
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".