Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системыНИР

Search of regulators of biological processes that affect proteins, enzymes, multienzyme complexes and receptor systems

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: В отчетном году были получены важные результаты по изучению путей регуляции биологических систем разного уровня организации: белков, ферментов, полиферментных комплексов и рецепторных систем, план работы по теме за 2019 год выполнен. Изучено влияние глицеральдегид-3-фосфата на гликирующую активность фермента, показано, что длительная инкубация приводит к инактивации, что связано не с прямым гликированием фермента, а с воздействием активных форм кислорода, окисляющих сульфгидрильные группы ГАФД. Предложены возможные механизмы действия гликирующих альдегидов на энергетическое обеспечение клеток. Исследовано влияние дендримеров на амилоидную трансформацию овечьего прионного белка, продемонстрировано эффективное антиагрегационное действие катионых пиридилфениленовых дендримеров, отобраны соединения, которые могут быть использованы для предотвращения нежелательной патологической агрегации амилоидогенных белков – прионного белка и альфа-синуклеина. Выяснены особенности возникновения неэквивалентности активных центров транскетолазы, определены факторы, определяющие субстратную специфичность пенициллинацилазы и карбоксипептидазы Т, установлено, что субстратная специфичность пенициллинацилазы к ацильной части субстрата шире, чем представлялось ранее, и фермент способен превращать производные галоген-замещенных уксусных кислот, хотя эта реакция и сопровождается инактивацией фермента. Установлено, что на каталитическую активность карбоксипептидазы Т определяющее влияние оказывают небольшие изменения в ориентации боковой цепи отщепляемого аминокислотного остатка по отношению к иону цинка и остатку Glu270 в активном центре фермента. В сотрудничестве с зарубежными партнерами усовершенствована методология молекулярного моделирования ферментативных реакций с использованием метадинамики, разработана методология изучения функциональной роли дисульфидных связей в семействах белков с использованием подходов биоинформатики и молекулярного моделирования: создана программа и общедоступный веб-сервер https://biokinet.belozersky.msu.ru/yosshi. Обнаружены новые низкомолекулярные регуляторы лактатдегидрогеназы А (ЛДГ-А) и транскетолазы микобактерий, охарактеризованы природные ингибиторы тирозил-ДНК фосфодиэстеразы 1 человека. Получены высокоочищенные препараты транскетолазы и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы микобактерий для экспериментального изучения ингибиторов этих ферментов, отобранных в результате молекулярного моделирования и компьютерного скрининга. Создана экспериментальная модель для исследования влияния бактерий Salmonella typhimurium на апоптоз нейтрофилов, исследована возможность использования синтетического CpG-олигонуклеотида как модулятора апоптоза нейтрофилов при их взаимодействии с бактериями Salmonella typhimurium. Проведено сравнение регуляции пролиферации нормального эпителия и эпителия рака легких при действии кофермента 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса (ОГДК) тиаминдифосфата (ТДФ). Показано, что высокие концентрации ТДФ в среде значительно снижают восстановительный потенциал раковых (А549), но не нормальных (Веро) клеток, что указывает на пониженную пролиферацию раковых клеток в среде с высоким содержанием ТДФ. Проведен анализ кинетики синтеза цитокинов TNF и ИЛ10 при действии агонистов толл-подобных рецепторов TLR4 и TLR3, сравнение параметров действия агонистов на различные типы клеток мозга - астроциты и нейроны. Составлен и верифицирован список генов, участвующих в синтезе оксилипинов астроцитами. Предложена схема возможного перекреста путей метаболизма оксилипинов по циклооксигеназному пути и сигнального пути активации врожденного иммунитета через TLR4 рецепторы плазматической мембраны. Проведена оценка роли оксилипинов в регуляции положительных и отрицательных обратных связей при модуляции клеточных сигнальных путей, сравнение сигналов оксилипинов через G-белок связывающие рецепторы, через фактор транскрипции PPAR, через обратный захват в фосфолипиды мембран оксилипинов, участников окислительного стресса. Оценена роль низкомолекулярных ингибиторов различных фосфолипаз на профили оксилипинов. Собрана коллекция транскриптомов, характеризующих изменения различных клеток (преимущественно макрофаги крови и других органов) при их поляризации под действием интерлейкина 4 (ИЛ4) и LPS, агониста TLR4 рецепторов. По результатам исследований в 2019 году опубликовано 19 статей, 2 статьи приняты в печать, получен патент (см. ссылку 11 в списке литературы), защищена кандидатская диссертация (Вирясова Г.М., Роль ремоделирующего хроматин комплекса PBAF в процессе миелоидной дифференцировки клеток крови человека, кандидатская диссертация по специальностям 02.00.10 - Биоорганическая химия, 03.01.03 - Молекулярная биология (хим. науки), МГУ.), сделано 8 докладов на международных конференциях. Список публикаций 1. Poursoleiman A., Karimi-Jafari MH, Zolmajd-Haghighi Z., Bagheri M., Haertlé T., Behbehani GR, Ghasemi A., Stroylova YY, Muronetz VI, Saboury AA. Polymyxinsinteraction to the human serum albumin: A thermodynamic and computational study. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, Pergamon Press Ltd. (United Kingdom), 2019, 217, 155-163. 2. Sorokina Svetlana A., Stroylova Yulia Yu, Tishina Sofia A., Shifrina Zinaida B., Muronetz Vladimir I. Promising anti-amyloid behavior of cationic pyridylphenylene dendrimers: role of structural features and mechanism of action. European Polymer Journal, Pergamon Press Ltd. (United Kingdom), 2019, 116, 20-29. 3. Stanishneva-Konovalova T.B., Pichkur E.B., Semenyuk P.I., Kurochkina L.P., Sokolova O.S. ATP-bound Conformation of OBP Chaperonin. Microscopy and Microanalysis, Cambridge University Press (United Kingdom), 2019, 25 (S2), 1334-1335. 4. Anashkin V.A., Orlov V.N., Lahti R., Baykov A.A. An arginine residue involved in allosteric regulation of cystathionine β-synthase (CBS) domain-containing pyrophosphatase.Archives of Biochemistry and Biophysics, Academic Press (United States), 2019, 662 (1), 40-48. 5. Anisimov A.A., Visochinskaya Yu S., Buzin M.I., Vasil’ev V.G., Nikiforova G.G., Peregudov A.S., Dubovik A.S., Orlov V.N., Shchegolikhina O.I., Muzafarov A.M. New polydimethylsiloxanes with bulky end groups: synthesis and properties. Russian Chemical Bulletin, Springer-Verlag GmbH (Heidelberg, Germany), 2019, 68 (6), 1275-1281. 6. Vysochinskaya Yulia S., Anisimov Anton A., Peregudov Alexander S., Dubovik Alexander S., Orlov Victor N., Malakhova Yulia N., Stupnikov Alexey A., Buzin Mikhail I., Nikiforova Galina G., Vasil’ev Victor G., Shchegolikhina Olga I., Muzafarov Aziz M. Star-shapped siloxane polymers with various cyclic cores: synthesis and properties. Journal of Polymer Science, Part A: Polymer Chemistry, издательство John Wiley & Sons Inc. (United States), 2019, 57 (11), 1233-1246. 7. Solovjeva Olga N., Selivanov Vitaly A., Orlov Victor N., Kochetov German A. Stages of the formation of nonequivalence of active centers of transketolase from baker’s yeast. MOLECULAR CATALYSIS, 2019, 466, 122-129. 8. Панин Н.В., Никулин М.В., Тюрин Е.С., Дробот В.В., Морозова И.А., Швядас В.К., Изучение возможностей использования 2-галоген-замещенных ацетамидов в качестве ацильных доноров в реакциях, катализируемых пенициллинацилазами, Acta Naturae (русскоязычная версия), 2019, 11, № 2, 77-81. 9. V.Kh. Akparov, V.I. Timofeev, G.E. Konstantinova, I.G. Khaliullin, I.P. Kuranova, T.V. Rakitina, V. Švedas, The nature of the ligand’s side chain interacting with the S1'-subsite of metallocarboxypeptidase T from Thermoactinomyces vulgaris determines the geometry of the tetrahedral transition complex? PloS One, 2020 (PONE-D-19-27311). 10. M. Bonomi, G. Bussi, C. Camilloni, Tribello G.A., P. Banáš, A. Barducci, M. Bernetti, Bolhuis P.G., S. Bottaro, D. Branduardi, R. Capelli, P. Carloni, M. Ceriotti, A. Cesari, H. Chen, W. Chen, F. Colizzi, S. De, M. De La Pierre, D. Donadio, V. Drobot, B. Ensing, Ferguson A.L., M. Filizola, Fraser J.S., H. Fu, P. Gasparotto, F.L. Gervasio, F. Giberti, A. Gil-Ley, T. Giorgino, Heller G.T., Hocky G.M., M. Iannuzzi, M. Invernizzi, Jelfs K.E., A. Jussupow, E. Kirilin, A. Laio, V. Limongelli, K. Lindorff-Larsen, T. Löhr, F. Marinelli, L. Martin-Samos, M. Masetti, R.Meyer, A. Michaelides, C. Molteni, T. Morishita, M. Nava, C. Paissoni, E. Papaleo, M. Parrinello, J. Pfaendtner, P. Piaggi, G.M. Piccini, A. Pietropaolo, F. Pietrucci, S. Pipolo, D. Provasi, D. Quigley, P. Raiteri, S. Raniolo, J. Rydzewski, M. Salvalaglio, G.C. Sosso, V. Spiwok, J. Šponer, Swenson D.W.H, P. Tiwary, O. Valsson, M. Vendruscolo, Voth G.A., A. White, Promoting transparency and reproducibility in enhanced molecular simulations, Nature Methods, 2019, 16, № 8, 670-673. 11. Нилов Д.К., Гущина И.В., Щербакова Т.А., Балдин С.М., Швядас В.К., Применение фурансульфонатов для ингибирования транскетолазы патогена Mycobacterium tuberculosis, «Изобретения. Полезные модели» Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности (Роспатент), 2019 г., № 29, патент RU 2703465. Текст: https://www1.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet?DB=RUPAT&DocNumber=2703465&TypeFile=html 12. Dyrkheeva N., Luzina O., Filimonov A., Zakharova O., Ilina E., Zakharenko A., Kuprushkin M., Nilov D., Gushchina I., Švedas V., Salakhutdinov N., Lavrik O., Inhibitory Effect of New Semisynthetic Usnic Acid Derivatives on Human Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 1, Planta Medica, 2019, 85, № 2, 103-111. 13. Schmalhausen EV, Shumkov MS, Muronetz VI, Svedas VK, Expression of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from M. tuberculosis in E. coli. Purification and characteristics of the untagged recombinant enzyme, Protein Expression and Purification, 2019, 157, 28-35. 14. Golenkina EA, Viryasova GM, Galkina SI, Arifulin EA, Gaponova TV, Romanova YM, Sud'ina GF. (2019) Synthetic CpG oligonucleotides as potential modulators of neutrophil survival in PAMP-associated inhibition of apoptosis. J Leukoc Biol. 106(1):45-55. doi: 10.1002/JLB.3MIA1118-435R. 15. Viryasova GM, Golenkina EA, Tatarskii VV Jr, Galkin II, Sud'ina GF, Soshnikova NV. (2019) An optimized permeabilization step for flow cytometry analysis of nuclear proteins in myeloid differentiation of blood cells into neutrophils. MethodsX. 6:360-367. doi: 10.1016/j.mex.2019.02.011. eCollection 2019. 16. Viryasova GM, Tatarskiy VV Jr, Sheynov AA, Tatarskiy EV, Sud'ina GF, Georgieva SG, Soshnikova NV. (2019) PBAF lacking PHD domains maintains transcription in human neutrophils. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866(12):118525. doi: 10.1016/j.bbamcr.2019.118525. 17. Aleshin, V. A., G. V. Mkrtchyan and V. I. Bunik (2019). "Mechanisms of Non-coenzyme Action of Thiamine: Protein Targets and Medical Significance." Biochemistry (Moscow) 84(8): 829-850. 18. Itkis, Y., T. Krylova, N. L. Pechatnikova, A. De Grassi, V. Y. Tabakov, C. L. Pierri, V. Aleshin, A. Boyko, V. I. Bunik and E. Y. Zakharova (2019). "A novel variant m.641A>T in the mitochondrial MT-TF gene is associated with epileptic encephalopathy in adolescent." Mitochondrion 47: 10-17. 19. Wagner, T., A. Boyko, P. M. Alzari, V. I. Bunik and M. Bellinzoni (2019). "Conformational transitions in the active site of mycobacterial 2-oxoglutarate dehydrogenase upon binding phosphonate analogues of 2-oxoglutarate: From a Michaelis-like complex to ThDP adducts." J Struct Biol 208(2): 182-190. 20. Бойко А.И. (2019) "Травмы мозга и механизмы нейропротекторного действия тиамина." Россия и Германия. Научный гумбольдтовский журнал, ISSN 2227-6807, №1-2 (13-14):109-118 21. Крюков Д.В. (2019) "Терапия эпилепсий: роль диагностики дисфункций витамин-зависимых ферментов." Россия и Германия. Научный гумбольдтовский журнал, ISSN 2227-6807, №1-2 (13-14):100-108 22 Aleshin V., Kaehne T., Mkrtchyan G., Artiukhov A., Graf A., Maslova M., Bunik V. (2019) «P.252 Regulation of glutamate dehydrogenase in the brain by acetylation and thiamine». European Neuropsychopharmacology. ISSN 0924977X, 29, S191-S192, doi: 10.1016/j.euroneuro.2019.09.291.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа: ОТЧЕТ ПО БЮДЖЕТНОЙ ТЕМЕ: В последние годы бурное развитие методов геномики, протеомики, метаболомики и транскриптомики привело к увеличению объемов доступных данных о структуре и функции ферментов. Первичные базы данных, собирающие информацию об аминокислотных последовательностях и структурах белков, растут в геометрической прогрессии. Активно развиваются вторичные базы данных, обобщающие структурную и функциональную информацию, классифицирующие белки/ферменты с разным строением, свойствами и происхождением. Анализ этой информации открывает новые возможности для понимания структурно-функциональных взаимосвязей в белках, однако требует новых методов анализа. Для больших суперсемейств белков (таких как α/β-гидролазы, PLP-зависимые ферменты различных типов) характерна сложная иерархия функциональных свойств и различий. Т.е. представители (конкретные ферменты), принадлежащие к одному суперсемейству, различаются по типу катализируемой реакции/реакционной специфичности, субстратной специфичности, зависимости активности и стабильности от pH, температуры, среды протекания реакции, и т.д. Эти свойства могут регулироваться разными механизмами и структурными факторами. Можно ожидать, что функциональная кластеризация родственных белков, т.е. распределение представителей суперсемейства по функциональным группам, будет зависеть от конкретного свойства/функции, при этом число таких функциональных кластеризаций белков одного суперсемейства будет не единственным и отражать сложную иерархию структурно-функциональных особенностей эволюционно удаленных, но родственных белков. Сложившиеся методы функциональной классификации ферментов обладают следующими фундаментальными недостатками: (1) они рассматривают функцию фермента как единое понятие, отражающее способность катализировать определенное химическое превращение (при этом не учитываются появляющиеся в последнее время сведения о способности многих ферментов катализировать разные химические превращения); (2) для каждого набора родственных ферментов предполагается возможной единственная кластеризация по функции; (3) большинство методов основывают кластеризации на поиске глобальных сходств и отличий последовательностей и структур разных белков, не принимая во внимание тот факт, что даже точечные замены в структуре белка могут привести к принципиальному изменению его свойств, например, типу катализируемой реакции (см, например, случай оксинитрилазы из Sorghum bicolor и ее сходства с гомологичным ферментом карбоксипептидазой: Gruber K., Kratky C. (2004) Biopolymers for biocatalysis: Structure and catalytic mechanism of hydroxynitrile lyases. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 42(3), 479-486). Таким образом, существующие методы функциональной классификации не только ферментов, но и белков в целом, не учитывают тот факт, что в рамках структуры одного белка возможна реализация нескольких функциональных свойств, и для изучения структурно-функциональных взаимосвязей в больших суперсемействах белков необходимы новые подходы. В отчетном году работа была направлена в сторону сравнительного анализа и функциональной классификации белков на уровне 3D-структур. С биологической точки зрения, анализ трехмерных структур представляется более точным и информативным в сравнении с анализом только аминокислотных последовательностей. Особо критичными эти преимущества становятся при сравнении и тонкой классификации эволюционно удаленных гомологов, которые приобрели функциональное разнообразие в результате накопления изменений и мутаций, когда аминокислотные последовательности сильно различаются и их анализ не может быть проведен без учета 3D-информации. Исследования были сосредоточены на функциональной классификации суперсемейств белков с использованием «3D-мотивов» – координатных реплик ключевых остатков в структуре сайтов связывания белков, обуславливающих выполнение ими конкретных функций. Биоинформатический анализ белков на уровне локальной организации фрагментов 3D-структуры («3D-мотивов») был впервые предложен 20-30 лет назад, но не получил широкого применения из-за ограниченной доступности 3D-данных. В последнее время использование «3D-мотивов» в биоинформатике становится возможным по мере накопления все большего количество доступных PDB структур. Появились различные программные решения для изучения белков на уровне «3D-мотивов», однако в большинстве случаев они представлены в виде узкоспециализированных веб-серверов, что позволяет использовать их только для решения ограниченного типа задач, при этом масштаб работы ограничен вычислительными возможностями сторонних веб-серверов по объему входных данных. В этой связи была начата разработка универсального подхода для сравнительного анализа и функциональной классификации белков на уровне 3D-мотивов и создана первая версия программного обеспечения для функциональной классификации и сравнительного анализа белков на основе изучения особенностей организации локальной 3D-структуры («3D-мотивов»). Для этого, в том числе, было использовано как ранее разработанное стороннее программное обеспечение, так и оригинальные программы лаборатории - Mustguseal (для поиска структур родственных белков в банке данных PDB) и parMATT (для выравнивания структур). Для построения и сравнения «3D-мотивов» используются две метрики: универсальная метрика на основе RMSD и специализированная на основе простых и дигедральных углов. Для кластеризации/классификации мотивов (и соответствующих белков) использовались методы машинного обучения. В первой версии разрабатываемого программного обеспечения реализованы три широко используемых метода кластерного анализа: HDBSCAN, OPTICS и DBSCAN для решения разных задач. HDBSCAN и OPTICS - полностью автоматические методы: HDBSCAN позволяет сохранить максимум данных для дальнейшего экспертного анализа, создавая «более толстые» кластеры и минимизируя количество выбросов (то есть уникальных/редких ориентаций), OPTICS, напротив, обычно производит пространственно более компактные и «более тонкие» кластеры, отклоняя большее количество конформаций как выбросы. DBSCAN - курируемый метод, результаты которого определяются входным параметром «eps», калибруемым вручную в соответствии с выбранной целью исследования. Полученный опыт и программное обеспечение для построения и анализа 3D-мотивов использованы для построения трехмерных слепков функционально важных аминокислот в центрах связывания и аннотации новых центров в ферментах. Для этого с использованием методов parMATT и Mustguseal были собраны неизбыточные выборки и построены множественные структурные выравнивания следующих суперсемейств – α/β-гидролаз, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ, Ntn-гидролаз, сериновых β-лактамаз. Проведен первичный анализ полученных структурных выравниваний, установлены первичные наборы характеристических признаков (3D-мотивов), проведено их сравнение. Разработан план дальнейшего развития подхода к построению и анализу 3D-мотивов в структурах белков для их сравнительного анализа и функциональной классификации. Разрабатываемый подход и соответствующее программное обеспечение будут в дальнейшем использованы для изучения взаимосвязи между структурой и функцией белков/ферментов, а также при решении практически важных задач получения препаратов белков с измененными функциональными свойствами и дизайна их модуляторов. С целью изучения механизма действия ферментов, путей регуляции их функциональных свойств и поиска ингибиторов активно использовались и разрабатывались методы молекулярного моделирования. Для эффективного компьютерного скрининга библиотек химических соединений и новых ингибиторов ферментов был разработан веб-сервер структурной фильтрации vsFilt, доступный по адресу https://biokinet.belozersky.msu.ru/vsfilt. vsFilt позволяет учитывать роль наиболее важных взаимодействий между тестируемой молекулой ингибитора/лиганда и белком-мишенью в образующемся комплексе (водородные связи, галогенные связи, ионные взаимодействия, гидрофобные контакты, пи-стэкинг, катион-пи взаимодействия) и отбирать лекарствоподобные соединения. Разработанный подход реализован при поиске ингибиторов и ранее неизвестных субстратов ряда ферментов (поли(ADP-рибозо)полимеразы, пенициллинацилазы, бета-лактамазы). Поли(ADP-рибозо)полимераза 1 (ПАРП-1) является ключевым ферментом репарации ДНК и важной мишенью для терапии онкологических заболеваний. Сложное строение субстратов ПАРП-1 ограничивает возможности экспериментального изучения механизма реакции, однако необходимые данные могут быть получены путем молекулярного моделирования. В отчетном году впервые была получена молекулярно-динамическая модель фермент-субстратного комплекса ПАРП-1, содержащего молекулу NAD+ и конец цепи поли(ADP-рибозы). Охарактеризованы взаимодействия с остатками активного центра, а также предложен SN1-подобный механизм для катализируемой реакции ADP-рибозилирования, что имеет важное значение для рационального дизайна конкурентных ингибиторов ПАРП-1. Был детально исследован молекулярный механизм действия природного ингибитора ПАРП-1, 7-метилгуанина, охарактеризованы взаимодействия между ингибитором, ферментом и нуклеосомной ДНК. Показано, что 7-метилгуанин конкурирует с субстратом NAD+ за связывание в активном центре, образуя взаимодействия с остатками Gly863, Ala898, Ser904, and Tyr907, подавляет ДНК-зависимую ферментативную активность и приводит к образованию непродуктивных комплексов ПАРП-1 с нуклеосомой. Молекулярно-динамическое моделирование позволило изучить взаимодействие протеазы ZMPSTE24 с пептидным субстратом (SPRTQSPQNCSIM), установить участие остатков Leu283, Val332, Leu438 активного центра фермента в полости Р3 в образовании контактной поверхности с гидрофобной боковой группой изолейцина преламина А. Наряду с этим, неполярные остатки полости P1 Ile351, Leu407, Leu410, Phe414 способны формировать интерфейс с фарнезильной группой модифицированного остатка цистеина С-конца преламина А. Предположено, что связывание С-конца преламина в полостях P1 и P3 определяет путь протеолиза и приводит к образованию продуктивного фермент-субстратного комплекса с необходимой ориентацией карбонильной группы расщепляемой пептидной связи по отношению к каталитическому иону цинка в активном центре. При помощи метадинамики изучен механизм взаимодействия ZMPSTE24 с экспериментально обнаруженным ингибитором лапиновиром. Обнаружено, что доставка ингибитора во внутреннюю полость происходит через сквозной канал в структуре белка, который, предположительно, обеспечивает удаление продукта ферментативной реакции (олигопептида с модифицированной фарнезильной группой аминокислотного остатка цистеина). Структурная организация сквозного канала и химическая природа образующих его аминокислотных остатков являются важнейшими факторами, определяющими взаимодействие фермента с уходящей группой субстрата. Изучение функционирования внутренней полости фермента показало, что внутренняя полость через этот канал способна также активно обмениваться молекулами воды с окружающим раствором. Блокирование канала приводит к подавлению активности фермента. В результате компьютерного скрининга библиотеки из 3-х тысяч низкомолекулярных соединений, отобранных для подавления активности широкого класса матриксных металлопротеиназ MMpI, были выявлены соединения, способные наиболее эффективно связываться в активном центре ZMPSTE24 и взаимодействовать с ионом цинка. При дальнейшем изучении с использованием метадинамики были отобраны четыре потенциальных ингибитора для дальнейшего экспериментального изучения. Изучена специфичность гомологичного ряда фосфоновых аналовов 2-оксоглутарата в отношении ингибирования пусковых изоферментов полиферментных комплексов животных тканей: 2-оксоглутаратдегидрогеназы и 2-оксоадипатдегидрогеназы, кодируемых генами ogdhl и dhtkd1, соответственно. Полученные результаты показали достаточно высокую специфичность действия сукцинилфосфоната на 2-оксоглутаратдегидрогеназу и адипоилфосфоната на 2-оксоадипатдегидрогеназу, в то время как аналог с промежуточной длиной углеродной цепи, глутарилфосфонат, был сравнимым по силе ингибитором обоих изоферментов. С использованием специфического действия аналогов 2-оксокислот на их ферменты-мишени in vivo показаны специфические физиологические эффекты направленной регуляции дегидрогеназ 2-оксокислот мозга в животных моделях интраназального введения аналогов. Продолжено исследование витамина В1 (тиамина) и его производных в качестве метаболических регуляторов животных клеток с нормальным метаболизмом и после злокачественного перерождения. Показана роль тиамина в ацетилировании, регулирующем связывание аллостерических эффекторов ключевого фермента метаболизма глутамата в мозге – глутаматдегидрогеназы – и зависимость такой регуляции от времени суток. С помощью аффинной хроматографии на тиамин-содержащем носителе выделены изоформы глутамат- и малатдегидрогеназ мозга животных с высокой степенью активации тиамином и/или тиаминдифосфатом. На основе ранее полученных данных об антираковом действии тиамина и тиаминдифосата в клетках аденокарциномы легочного эпителия и связи такого действия с р53-зависимой регуляцией проведен биоинформатический поиск потенциальных сайтов связывания р53 с участками старта транскрипции генов, кодирующих тиамин-зависимые ферменты. Предсказанные сайты сопоставлены с опубликованными данными о р53-зависимой регуляции данных ферментов. Экспериментально показано, что факторы, приводящие к изменению экспрессии р53 в клетках аденокарциномы легочного эпителия, меняют активности ферментов, регулируемых тиамином по коферментному и некоферментному механизмам. С целью дальнейшей характеристики взаимной регуляции метаболизма витаминов В1 (тиамина) и В6 (пиридоксаля) у животных проведено изучение мутаций ферментов метаболизма пиридоксаля, а также их энзимологических и физиологических последствий. Были продолжены исследования взаимодействий между различными биомолекулами и белками-мишенями, в том числе ферментами энергетического обмена, с целью средств лечения и профилактики заболеваний, связанных с индукцией апоптоза (преимущественно в нервных тканях). Так были подробно изучены механизмы одно-субстратной реакции, катализируемой транскетолазой, участвующей в пентнозофосфатном пути и играющей важную роль в обеспечении клеток различными сахарами и кофакторами. Были установлены неизвестные ранее особенности катализа этим ферментом одно-субстратной реакции и разработаны методы кинетического анализа этого процесса. Кроме того, были подробно изучены каталитические свойства комплекса транскетолазы с РНК, обнаруженного ранее в пекарских дрожжах. Было обнаружено, что РНК, входящая в этот комплекс, представляет собой рибозим, который катализирует взаимное превращение глицеральдегид-3-фосфата (G3P) и дигидроксиацетон-3-фосфата (DHAP), т.е. действует как триозофосфат-изомераза (TPI). Он также катализирует необычную реакцию разложения рибозо-5-фосфата (R5P) до G3P и эритрозы. TPI-рибозим был обнаружен в пекарских дрожжах не только в комплексе с транскетолазой, но и в свободной форме. Комплекс транскетолаза-РНК легко выделялся на иммуноаффинной колонке с антителами к транскетолазе. TPI-рибозим состоит из 87 нуклеотидов и имеет молекулярную массу 26,6 кДа. Оптимум pH-активности составляет 7,5 для DHAP, 6,7 для R5P и 9,0 для G3P. Km и Vmax составляют соответственно 0,29 мМ и 2,6 Ед / мг для DHAP, 22 мМ и 0,65 Ед / мг для R5P, 0,05 мМ и 4,3 Ед / мг при pH 7,6 и 0,11 мМ и 16 Ед / мг при pH 9,0 для G3P. Эти кинетические характеристики одинаковы для свободной РНК и в комплексе с транскетолазой. Ki для связывания РНК с транскетолазой составлял 1,0 мкМ. Соответственно, TPI-рибозим выполняет двойную функцию - с одной стороны он проявляет активность TPI, а с другой - блокирует работу транскетолазы, тем самым переключая метаболический процесс на гликолиз. Определяется местоположение гена рибозима TPI. Блокирование активности транскетолазы рибозимом может иметь практическое значение в медицине, в частности, в терапии рака. Было продолжено изучение взаимодействия природных и синтетических производных коричной кислоты с амилоидогенными белками. Было установлено, что некоторые вещества из этой группы эффективно предотвращают патологическую трансформацию альфа-синуклеина, являющегося одним из основных участников возникновения различных синуклеинопатий, в том числе и болезни Паркинсона. Для дальнейшего изучения влияния этих соединений на трансформацию альфа-синуклеина в условиях, близких к естественным, была получена модельная система на основе клеток нейробластомы SH-SY5Y, стабильно продуцирующих альфа-синуклеин дикого типа, а также его мутантные формы. С целью изучения роли шаперонинов в развитии нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы были выделены и охарактеризованы различные фаговые шаперонины и сформулированы гипотезы об их роли в патологической трансформации амилоидогенных белков. Были также проведены исследования влияния дендримеров на амилоидную трансформацию некоторых белков и рассмотрены возможности использования различных соединений, в том числе биодеградируемых термочувствительных олигохитозановых наночастиц, для доставки биологически активных соединений. В экспериментальной модели взаимодействия нейтрофилов с бактериями Salmonella typhimurium проведена работа по селекции синтетических фрагментов ДНК с наибольшим потенциалом активации/ингибирования фагоцитоза и синтеза лейкотриенов в нейтрофилах. При исследовании функциональных ответов нейтрофилов человека были охарактеризованы структуры по принципу баланса между максимальным подавлением антиапоптотического действия бактерий и минимальными побочными эффектами в виде неспецифической активации продукции активных форм кислорода/азота нейтрофилами. Было проведено исследование фагоцитоза и стимулированного фагоцитозом синтеза лейкотриенов в экспериментальной модели взаимодействия нейтрофилов с бактериями Salmonella typhimurium, при добавлении олигонуклеотидов различной структуры. Используя анализ ВЭЖХ, проточную цитометрию и другие биохимические методы изучено влияние синтетических олигодезоксирибонуклеотидов (ODN), способных сворачиваться в G-квадруплексные структуры, на синтез лейкотриенов в нейтрофилах. ODN содержали теломерные TTAGGG-повторы (G4), в том числе с фосфоротиоатными олигогуанозинами, присоединенными к концу (-ам) ядра G-квадруплекса. Исследование структуры методами КД и УФ-спектроскопии показало, что присутствие олигогуанозинов, фланкирующих последовательность G4, приводит к кардинальным изменения топологии G-квадруплекса. В то время как G4 складывается в единую антипараллельную структуру, в модифицированных ODN выявлены антипараллельная и параллельная структуры. Показано, как модификации базовой теломерной структуры влияют на фагоцитарную активность нейтрофилов и синтез лейкотриенов. Добавление бактерий к нейтрофилам резко снижало апоптоз нейтрофилов. Из-за своего клинического значения S. typhimurium широко используется как модельный организм для изучения взаимодействий между клетками хозяина и патогеном. Для обращения эффекта бактерий на апоптоз важнейшую роль играет способность олигонуклеотидов (ODN) индуцировать продукцию ROS. Если в действии теломерных последовательностей на синтез лейкотриенов в фагоцитирующих нейтрофилах решающим фактором была их способность формировать устойчивые G–квадруплексы), то при активации апоптоза нейтрофилов максимальную эффективность проявили ODN смешанного состава - с фосфоротиоатными олигогуанозинами по концам ядра G-квадруплекса. Для разделения апоптотических и некротических клеток использовалось одновременное окрашивание меченным AlexaFluor 488-аннексином V, что позволяет оценить выраженность экстернализации фосфатидилсерина (зеленая флуоресценция), и йодистым пропидием (PI), маркером целостности наружных мембран (красная флуоресценция). Образование ROS/RNS под действием (TTAGGG)-ODN и их модифицированных аналогов позволило отобрать структуры по принципу баланса между максимальным подавлением антиапоптотического действия бактерий и минимальными побочными эффектами в виде неспецифической активации продукции ROS/RNS нейтрофилами. Проведен дальнейший анализ изменений транскриптомов клеток с различной поляризацией и поведения генов каскадов синтеза оксилипинов. Для выявления списков маркеров поляризации проведено сопоставление данных (транскриптомов), полученных на астроцитах, макрофагах и других типах клеток, обработанных интерлейкинами (IL-4, IL-10) или липополисахаридом (LPS). Анализировали данные РНК-секвенирования клеточных экспериментов поляризации астроцитов и макрофагов людей и животных (крыса, мышь). Результаты анализа представлены в открытом доступе в базах данных GEO (NCBI) и ENA (EMBL-EBI). Была разработана методика поиска транскриптомных датасетов в открытых базах данных. Первичную обработку данных проводили инструментом Salmon (v1.3.0), затем суммировали данные экспрессии на уровне генов с помощью пакета R tximport (v1.16.1). Также был выполнен анализ дифференциальной экспрессии генов (DESeq2). Выявленные релевантные маркеры были разделены на провоспалительные (классическая поляризация) и противовоспалительные (альтернативная поляризация). В клеточных экспериментах была проведена предварительная оценка действия лигандов ядерных рецепторов PPAR (агонистов и антагонистов) на клеточную поляризацию. Получены метаболомные данные и проведен их анализ, Для разработки к анализа метаболомных данных проведено сравнение липидомных профилей в различных жидкостях в моделях воспаления глаз на кроликах. Проведен анализ оксилипиновых профилей, полученных в различных условиях, с целью оценки возможности использования оксилипинов как диагностических маркеров воспалительных процессов и нарушений протекания ответов врожденного иммунитета. Полученные результаты позволяют предполагать возможность такого использования. Для усиления высказанного предположения проведено сравнение оксилипиновых профилей при действии ингибиторов митогенактивируемых протеинкиназ, ингибиторов митохондриального метаболизма на астроцитах и макрофагах. Начата подготовка данных анализа к теоретическому обобщению. По результатам исследований в 2020 году опубликованы 32 статьи, сделано 9 докладов на российских и международных конференциях, защищено 5 дипломных и 6 курсовых работ. Список опубликованных статей. 1. Gushchina I.V., Polenova A.M., Suplatov D.A., Švedas V.K., Nilov D.K. vsFilt: A tool to improve virtual screening by structural filtration of docking poses. (2020) J. Chem. Inf. Model., 60, 3692-3696. 2.Nilov D., Maluchenko N., Kurgina T., Pushkarev S., Lys A., Kutuzov M., Gerasimova N., Feofanov A., Švedas V., Lavrik O., Studitsky V.M. Molecular mechanisms of PARP-1 inhibitor 7-methylguanine. (2020) Int. J. Mol. Sci., 21, 2159. 3.Zamaraev A.V., Volik P.I., Nilov D.K., Turkina M.V., Egorshina A.Y., Gorbunova A.S., Iarovenko S.I., Zhivotovsky B., Kopeina G.S. Requirement for serine-384 in caspase-2 processing and activity. (2020) Cell Death Dis., 11, 825. 4.Нилов Д.К., Пушкарев С.В., Гущина И.В., Манасарян Г.А., Кирсанов К.И., Швядас В.К. Моделирование фермент-субстратных комплексов поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 человека. (2020) Биохимия, 85, 116-125. 5.Suplatov D., Sharapova Y., Švedas V. easyAmber: A comprehensive toolbox to automate the molecular dynamics simulation of proteins. Journal of Bioinformatics and Computational Biology, 2020, 18(3), 2040011. 6.Кирилин Е.М., Швядас В.К. Анализ траектории образования промежуточного гликозилфермента в механизме действия нейраминидазы вируса гриппа А методами молекулярного моделирования. Биохимия, 2020, 85(4), 567-577. 7.Подшивалов Д.Д., Кирилин Е.М., Коннов С.И., Швядас В.К. Структурная организация и динамические характеристики участка связывания ингибиторов конформационной перестройки гемагглютинина вируса гриппа H3N2 и H7N9. Биохимия, 85(4), 578-586. 8.Aleshin V.A., Mkrtchyan G.V., Kaehne T., Graf A.V., Maslova M.V., Bunik V.I. (2020) Diurnal regulation of the function of the rat brain glutamate dehydrogenase by acetylation and its dependence on thiamine administration. Journal of Neurochemistry, 153: 80-102, doi.org/10.1111/jnc.14951. 9.Boyko AI, Artiukhov AV, Kaehne T, di Salvo ML, Bonaccorsi di Patti MC, Contestabile R, Tramonti A, Bunik VI. (2020) Isoforms of the DHTKD1-Encoded 2-Oxoadipate Dehydrogenase, Identified in Animal Tissues, Are not Observed upon the Human DHTKD1 Expression in Bacterial or Yeast Systems. Biochemistry Moscow, 85::920-929, doi: 10.1134/S0006297920080076. 10.Song JY, Fan B, Che L, Pan YR, Zhang SM, Wang Y, Bunik V, Li GY. (2020) Suppressing endoplasmic reticulum stress-related autophagy attenuates retinal light injury. Aging 12:16579-16596, doi: 10.18632/aging.103846. 11.Barile A, Nogués I, di Salvo ML, Bunik V, Contestabile R, Tramonti A. (2020) Molecular characterization of pyridoxine 5'-phosphate oxidase and its pathogenic forms associated with neonatal epileptic encephalopathy. Sci Rep 10:13621, doi: 10.1038/s41598-020-70598-7. 12.Contestabile R, di Salvo ML, Bunik V, Tramonti A, Vernì F. (2020) The multifaceted role of vitamin B 6 in cancer: Drosophila as a model system to investigate DNA damage. Open Biol 10:200034, doi: 10.1098/rsob.200034. 13.Artiukhov AV, Pometun AA, Zubanova SA, Tishkov VI, Bunik VI (2020) Advantages of formate dehydrogenase reaction for efficient NAD(+) quantification in biological samples. Analytical Biochemistry, 603: 113797, Doi: 10.1016/j.ab.2020.113797. 14.Bunik VI, Aleshin VA, Zhou X, Krishnan S, Karlsson A. (2020 г.) Regulation of Thiamine (Vitamin B1)-Dependent Metabolism in Mammals by p53. Biochemistry Moscow, 8: 801-807. Doi: 10.1134/S0006297920070081. 15.Bunik V.I., Aleshin V.A., Zhou X., Tabakov V. Yu, Karlsson A. (2020) Activation of Mitochondrial 2-Oxoglutarate Dehydrogenase by Cocarboxylase in Human Lung Adenocarcinoma Cells A549 Is p53/p21-Dependent and Impairs Cellular Redox State, Mimicking the Cisplatin Action. Int. J. Molec. Sci. 21: 3759, doi: 10.3390/ijms21113759. 16.Graf A., Trofimova L., Ksenofontov A., Baratova L., Bunik V. (2020) Hypoxic Adaptation of Mitochondrial Metabolism in Rat Cerebellum Decreases in Pregnancy. Cells 9: 139. doi: 10.3390/cells9010139. 17.Artiukhov A.V., Grabarska A., Gumbarewicz E., Aleshin V.A., Kähne T,. Obata T., Kazantsev A.V., Lukashev N.V., Stepulak A., Fernie A.R., Bunik V.I. (2020) Synthetic analogues of 2-oxo acids discriminate metabolic contribution of the 2-oxoglutarate and 2-oxoadipate dehydrogenases in mammalian cells and tissues. Sci Rep. 10: 1886. doi: 10.1038/s41598-020-58701-4. 18.Mezhenska O. A., Aleshin V. A., Kaehne T., Artiukhov A. V., Bunik V. I. (2020), Regulation of Malate Dehydrogenases and Glutamate Dehydrogenase of Mammalian Brain by Thiamine in vitro and in vivo. Biochemistry Moscow 85: 27-39. doi:10.1134/S0006297920010034 (English translation). 19.Aleshin V.A., Artiukhov A. V., Mezhenska O. A., Parkhomenko J.M., Kaehne T., Bunik V. I. (2020) Phosphatases of thiamine mono- and diphosphate in bovine brain synaptosomes. Biochemistry Moscow, 85: 378-386 doi: 10.1134/S000629792003013X (English translation). 20.Solovjeva O.N. The mechanism of a one-substrate transketolase reaction. Part II. Anal Biochem. 2021, 613:114022. 21. Solovjeva O.N., Kovina M.V., Zavialova M.G., Zgoda V.G., Shcherbinin D.S., Kochetov G.A. The mechanism of a one-substrate transketolase reaction. Biosci Rep. 2020, 28;40(8):BSR20180246. 22. Solovjeva O.N. Triosephosphate isomerase from baker’s yeast – ribozyme versus protein. Open journal of analytical and bioanalytical chemistry. 2020, 4 (1): 020-028. 23. Medvedeva M., Barinova K., Melnikova A., Semenyuk P., Kolmogorov V., Gorelkin P., Erofeev A., Muronetz V. Naturally occurring cinnamic acid derivatives prevent amyloid transformation of alpha-synuclein. Biochimie, 2020, 170: 128-139. 24. Melnikova A., Pozdyshev D., Barinova K., Kudryavtseva S., Muronetz V.I. Alpha-synuclein overexpression in SH-SY5Y human neuroblastoma cells leads to the accumulation of thioflavin S-positive aggregates and impairment of glycolysis. Biochemistry (Moscow, перевод), 2020, 85 (5): 604-613. 25. Semenyuk P.I., Moiseenko A.V., Sokolova O.S., Muronetz V.I., Kurochkina L.P. Structural and functional diversity of novel and known bacteriophage-encoded chaperonins. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 157: 544-552. 26. Sorokina S., Stroylova Y., Muronetz V., Shifrina Z. Role of structural features of dendrimers in the anti-amyloidogenic properties. ИНЭОС OPEN, 2020, 3 (2): 1-9. 27. Burova T.V., Grinberg V.Y., Grinberg N.V., Dubovik A.S., Tikhonov V.E., Orlov V.N., Plashchina I.G., Alvarez-Lorenzo C., Khokhlov A. R. Biodegradable thermoresponsive oligochitosan nanoparticles: Mechanisms of phase transition and drug binding-release. International Journal of Biological Macromolecules, 2020,164:1451-1460. 28. Akatyev Nikolay V., Yl’in Mikhail M., Yl’in Mikhail M., Peregudova Svetlana M., Peregudov Alexander S., Buyanovskaya Anastasiya G., Kudryavtsev Kirill R., Dubovik Alexander S., Grinberg Valeriy Ya, Orlov Victor N., Ilya Volkov, Pavlov Alexander A., Novikov Valentin V., Belokon Yuri N. Chan-Evans-Lam C-N Coupling Promoted by a Dinuclear Cu(II) Complex. Catalytic Performance and Some Evidence for the Mechanism of CEL Reaction Obviating Cu(III)/Cu(I) Cycle. ChemCatChem, 2020:10158-0012. 29.Golenkina EA, Viryasova GM, Dolinnaya NG, Bannikova VA, Gaponova TV, Romanova YM, Sud'ina GF. The Potential of Telomeric G-quadruplexes Containing Modified Oligoguanosine Overhangs in Activation of Bacterial Phagocytosis and Leukotriene Synthesis in Human Neutrophils. Biomolecules. 2020; 10(2):249. doi: 10.3390/biom10020249. 30.Sud’ina Galina F., Viryasova Galina M., Golenkina Ekaterina A., Galkina Svetlana I., Romanova Yulia M., Dolinnaya Nina G. Synthetic Oligodeoxynucleotides in the Regulation of Leukotriene Synthesis in Human Neutrophils. FASEB Journal, Volume34, Issue S1, № S1, с.1; doi: 10.1096/fasebj.2020.34.s1.00635. 31.Chistyakov D.V., Gancharova O.S., Baksheeva V.E., Tiulina V.V., Goriainov S.V., Azbukina N.V., Tsarkova M.S., Zamyatnin A.A., Philippov P.P., Sergeeva M.G., Senin I.I., Zernii E.Yu. Inflammation in Dry Eye Syndrome: Identification and Targeting of Oxylipin-Mediated Mechanisms. BIOMEDICINES, 2020, 8(9), 344. 32.Chistyakov D.V., Azbukina N.V., Astakhova A.A., Goriainov S.V., Chistyakov V.V., Tiulina V.V., Baksheeva V.E., Kotelin V.I., Fedoseeva E.V., Zamyatnin A.A., Philippov P.P., Kiseleva O.A., Bessmertny A.M., Senin I.I., Iomdina E.N., Sergeeva M.G., Zernii E.Yu. Comparative lipidomic analysis of inflammatory mediators in the aqueous humor and tear fluid of humans and rabbits. Metabolomics, 2020, 16(2), 27.
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа:
4 1 января 2022 г.-1 января 2022 г. Поиск регуляторов биологических процессов, воздействующих на белки, ферменты, полиферментные комплексы и рецепторные системы
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".