ИСТИНА

Данный проект направлен на установление молекулярных механизмов фотохимической окислительно-восстановительной конверсии и фотодеструкции флуоресцентных белков с помощью современных методов квантовой химии. В рамках проекта планируется дальнейшее развитие современных методов квантовой химии для эффективного построения и анализа многомерных поверхностей потенциальной энергии возбужденных электронных состояний фотоактивных флуоресцентных белков. Будут определены механизмы первичных и вторичных фотохимических реакций флуоресцентных белков, связанных с переносом электрона между хромофорными группами и их ближайшим белковым окружением. Совместные работы с экспериментальными группами в рамках комплексного проекта в области молекулярной биологии (ИБХ РАН) и биофотоники (ИХФ РАН) позволят сделать вывод о роли белкового окружения в механизмах фотоконверсии флуоресцентных белков и разработать модификации флуоресцентных белков с улучшенной фотостабильностью и оптимальными фотохимическими свойствами для фотоконверсии. Успешное выполнение проекта позволит существенно расширить границы применения направленной посттрансляционной фотохимической модификации хромофорных групп флуоресцентных белков в биоимиджинге, включая обратимое управление цветностью белков в живых клетках и использование флуоресцентных белков как индикаторов окислительно-восстановительных процессов in vivo.

The project aims at studying molecular mechanisms of redox photoconversion and photodestruction of fluorescent proteins by using state-of-the-art methods of quantum chemistry. Collaborations with the experimental groups in the field of molecular biology (RAS Institute of Bioorganic Chemistry) and biophotonics (RAS Institute of Chemical Physics) will allow us to elucidate the role played by the protein environment in the mechanisms of photoconversion of fluorescent proteins and to develop their new photostable modifications as well as proteins with optimal photoresponse. Ultimately, the results of the project will be used in developing new applications of posttranslational photochemical modifications of proteins in bioimaging.

1. Установление механизма восстановительной фотоконверсии хромофорных групп красных флуоресцентных белков, сопровождающейся образованием зеленой спектральной формы. 2. Установление механизма фотоактивируемой восстановительной конверсии зеленого флуоресцентного белка EGFP в бескислородных условиях с образованием красной флуоресцентной формы. 3. Установление роли многофотонных процессов в фотохимии флуоресцентных белков и определение механизмов многофотонной ионизации, идущей через высоковозбужденные электронные состояния хромофорных групп. 4. Определение механизма и эффективности 2D фотоконверсии флуоресцентных белков, таких как Dendra2, с образованием устойчивых долгоживущих красных форм, наблюдающейся при облучении одновременно в видимом и ИК диапазонах. Выявление природы интермедиатов, облучение которых в ИК диапазоне приводит к значительному повышению эффективности необратимой фотоконверсии. 5. Определение роли белкового окружения хромофорных групп флуоресцентных белков в первичных и вторичных радикальных фотохимических реакциях при фотоактивируемой окислительно-восстановительной фотоконверсии белков. 6. С помощью разрабатываемых в проекте методов молекулярного моделирования будут предложены модификации флуоресцентных белков с улучшенной фотостабильностью и большими квантовыми выходами фотоактивируемой окислительно-восстановительной конверсии.

Коллектив исполнителей имеет большой опыт решения электронной задачи с помощью неэмпирических методов квантовой химии высокого уровня точности. Руководитель проекта имеет большой опыт в разработке и программной реализации различных гибридных подходов метода квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ). Участниками коллектива разработаны оригинальные методы и программы расчета интенсивностей вибронных переходов в спектрах поглощения и испускания фотоактивных биомолекулярных систем, основанные как на прямом расчете факторов Франка-Кондона, так и на временном формализме.

В проекте сследован механизм фотоиндуцированного переноса электрона в модельных системах тирозин-содержащих хромофорных групп флуоресцентных и фотоактивных белков, находящихся в различном окружении, и исследована роль возбужденных электронных состояний хромофорных групп в механизме срыва электрона в изолированном состоянии и при переносе на растворитель в растворе и белковом окружении при многофотонном возбуждении. Установлено, что первый возбужденный резонанс формы играет ключевую роль в фотоиндуцированных окислительно-восстановительных процессах хромофорных групп в белковом окружении при многофотонном возбуждении в видимом диапазоне. В водном растворе, наряду с высоко возбужденным электронным состоянием, первое возбужденное состояние также играет важную роль в процессе фотопереноса электрона на растворитель. В совместной работе с научными группами из ИХФ РАН и ИБХ РАН с использованием метода время-коррелированного счета фотонов (TCSPC) исследована динамика релаксации первого электронно-возбужденного состояния зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в растворе в присутствии окислителей на наносекундных и субнаносекундных временах, предложена кинетическая модель тушения флуоресценции и впервые определена эффективная константа скорости фотоиндуцированного переноса электрона. Полученные нами результаты впервые свидетельствуют о переносе электрона на молекулы окислителя непосредственно из первого электронно-возбужденного состояния аниона хромофорной группы и образовании радикальной формы хромофора – первичного интермедиата при окислительно-восстановительной фотоконверсии EGFP. С использованием молекулярной динамики и комбинированного метода квантовой и молекулярной механики построены полные атомистические модели возможных продуктов и интермедиатов фотоконверсии. Показано, что поглощение радикальной формы лежит как в видимой, так и в ИК диапазонах. Высказано предположение о том, что эффективность фотоконверсии EGFP может быть улучшена при дополнительном облучении радикальной формы хромофора в ИК диапазоне. Получены новые данные о структуре и спектральных характеристиках интермедиатов и конечных фотопродуктов окислительно-восстановительной фотоконверсии зеленого флуоресцентного белка EGFP и необратимо фотоконвертируемого белка Dendra2. Установлено, что механизмы фотоконверсии этих белков являются принципиально различными: в случае EGFP впервые показано, что окислительно-восстановительная фотоконверсия идет по радикальному механизму, тогда как в случае 2D фотоконверсии белка Dendra2, наблюдающейся при облучении одновременно в видимом и ИК диапазонах, - по триплетному механизму с внутримолекулярным переносом электрона. В проекте также предложен и синтезирован новый класс модифицированных хромофоров зеленого флуоресцентного белка, которые являются конформационно жесткими только в электронно-возбужденном состоянии, в отличие от обычных хромофорных групп EGFP. Показано, что новые хромофорные группы обладают аномально большим стоксовым сдвигом, который достигает значения порядка 1 эВ. С помощью методов квантовой химии высокого уровня точности показано, что уникальные фотофизические свойства модифицированных хромофоров обусловлены их кардинально различными равновесными геометрическими параметрами в основном и первом возбужденном электронном состоянии. Рассчитанный стоксов сдвиг хорошо согласуется с найденным экспериментально значением. Дальнейшая модификация химической структуры хромофора путем добавления заместителей в бензольное кольцо приводит к увеличению степени переноса заряда в возбужденном состоянии. При этом квантовый выход флуоресценции становится зависимым от полярности растворителя. Таким образом, новые модифицированные хромофоры зеленого флуоресцентного белка могут быть использованы в качестве индикаторов полярности среды. Наличие большого стоксова сдвига обусловливает перспективность использования новых модифицированных хромофоров в биоимиджинге при двухфотонном возбуждении. Исследован механизм как окислительной, так и восстановительной фотоконверсии белка EGFP. С помощью молекулярно-динамического моделирования и комбинированного метода КМ/ММ в варианте PBE0/(aug)-cc-pVDZ//CHARMM созданы полные атомистические модели белка EGFP в водном растворе, отвечающие различным спектральным формам в равновесной геометрической конфигурации основного электронного состояния. Вертикальные энергии возбуждения рассчитывались с помощью многоконфигурационной квазивырожденной теории возмущений XMCQDPT2. На основе полученных результатов предложен общий механизм окислительно-восстановительной фотоконверсии белка EGFP, при котором во всех случаях первичным процессом является фотоокисление зеленой формы хромофорной группы белка с образованием радикала. Ключевым моментом в ходе дальнейших превращений является наличие или отсутствие молекулярного кислорода, легко проникающего внутрь белка и непосредственно контактирующего с хромофорной группой. При окислительной фотоконверсии образуются красные формы с хромофорными группами белков DsRed и asFP595. В бескислородных условиях образуется устойчивая хиноидная форма, характеризующаяся большим стоксовым сдвигом. Ее внутримолекулярная циклизация приводит к образованию оранжевой и другой красной формы. Предложенный механизм впервые объясняет различную природу конечных продуктов при фотоконверсии EGFP в различных условиях и открывает пути направленного синтеза различных спектральных форм in vivo.