Нейрогенная активность микроструктурированных пленок и трехмерных скаффолдов из рекомбинантного спидроина in vitro и in vivoНИР

In vitro and in vivo neurogenic activity of recombinant spidroin microstructured films and three-dimensional scaffolds

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 30 октября 2017 г.-26 октября 2018 г. Нейрогенная активность микроструктурированных пленок и трехмерных скаффолдов из рекомбинантного спидроина in vitro и in vivo
Результаты этапа: Целью первого этапа были подбор и модификация известных, а также разработка новых, экспериментальных модельных систем, направленных на решение задач проекта. Для проведения указанных работ в ФБГУ "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" были получены новые фотоотверждаемые метакрилированные производные нативного фиброина (FBMA) и матакрилированный вариант рекомбинантного белка 1F9 – аналога белка каркасной нити паутины пауков-кругопрядов. Важной особенностью для достижения целей проекта является то, что молекулы 1F9 содержат 18 повторов последовательности GRGGL, которая представляет собой лиганд для связывания с рецепторами нейронной клеточной адгезии и является сигнальной для развития нейрональных клеток. Переданные образцы были сформированы в виде структур разных форм, включая пленки, микропаттерны, маты и макропористые губки. Проведенные физико-химические и механические исследования показали, что полученные фотоотверждаемые структуры были выше по прочности, чем контрольные образцы, сформированные классическими методами, в 20 и более раз, в зависимости от типа скаффолда, а также обладали повышенной жесткостью. Методами атомно-силовой и световой микроскопии было продемонстрировано, что фотосшивка растворов FBMA и тонких пленок позволила получить двумерные и трехмерные скаффолды на основе 1F9 и FBMA с точно настраиваемой макро- и микромасштабной архитектурой. Таким образом можно получать скаффолды различных форм и характеристик, которые могут быть использованы для регенерации различных типов тканей. Поверхности всех полученных фотоотверждаемых конструкций поддерживают адгезию и пролиферацию клеток, способствуя сохранению их высокой жизнеспособности, что было продемонстрировано в экспериментах на мышиных фибробластах 3T3, кератиноцитах HaCaT, мышиных эмбриональных фибробластах, а также на других иммортализованных клеточных линиях и первичных культурах. При исследовании нейрогенной активности пленок повышенной жесткости наибольшее количество данных получено и включено в данный отчет для двумерных структур из FBMA. Так была исследована дифференцировка клеток нейробластомы линии SH-SY5Y. Применение современных методов световой микроскопии показало, что на субстратах из метакрилированного фиброина происходило увеличение длины нейритов клеток и повышение экспрессии маркеров нейрональной дифференцировки: MAP2, NeuN, NCAM и тубулина βIII. Представленные нами данные, а также результаты, полученные в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, свидетельствуют о том, что метакрилированный фиброин – биосовместимый и простой в технологическом отношении материал с усовершенствованными характеристиками, который может применяться для трансплантации нейральных клеток. Также были проведены исследования, направленные на изучение взаимодействия SH-SY5Y с биоискусственными поверхностями 1F9. Результаты этих исследований анализируются и будут подготовлены к публикации в 2019 году. За отчетный период были изучены краткосрочные и долговременные эффекты трансплантации фиброинсодержащих микрочастиц на последствия травматического повреждения головного мозга. Такое исследование проводилось для отработки модельных систем, необходимых для успешного выполнения запланированных на поздних этапах реализации проекта работ по изучению влияния разрабатываемых фототоверждаемых конструкций на восстановление повреждения сенсомоторной коры головного мозга крысы. Из полученных результатов также следует, что нативный фиброин оказывает плейотропное защитное действие, способствуя усилению регенерации нервной ткани, что приводит к функциональному восстановлению мозга. Все полученные на 1 этапе данные будут использованы для реализации следующего этапа научного проекта и выполнения комплексного проекта в целом.
2 6 декабря 2018 г.-3 декабря 2019 г. Нейрогенная активность микроструктурированных пленок и трехмерных скаффолдов из рекомбинантного спидроина in vitro и in vivo
Результаты этапа: В ходе выполнения работ второго этапа исследований в ФБГУ "ГосНИИГенетика" в рамках проекта «Микроструктурированные пленки и трехмерные скаффолды на основе рекомбинантных спидроинов для изучения дифференцировки, клеточного цикла и межклеточных взаимодействий нейрональных клеток» были получены фотоотверждаемые метакрилированные производные рекомбинантных аналогов белков каркасной нити паутины пауков-кругопрядов, в том числе 1F9 (rS1/9); 2Е12 (rS2/12) без регуляторных последовательностей; 2Е12-RGDS (rS2/12-RGDS) с последовательностью RGDS на C-конце; 2Е12-linker-RGDS (rS2/12-linker-RGDS) с последовательностью RGDS С-конце линкер SGGSGGSGGSGG. Ключевой особенностью для достижения целей проекта является присутствие в производных Е12 последовательности RGDS, взаимодействующей с интегринами, а в молекуле 1F9 наличие 18 повторов GRGGL, являющейся лигандом для NCAM. Из этих производных были получены 2D-пленки и 3D-скаффолды и микропаттерны. Для осуществления исследований на клеточных культурах были получены стекла, покрытые слоем метакрилированного фотоотвержденного белка. При этом структура покрытия обладала тем же микрорельефом и, в целом, повторяла структуру пленок. Показано, что исследуемые белки спонтанно формируют характерные пористые структуры нанометрового размера. Наличие такой наноструктуры должно способствовать газообмену, обмену продуктами метаболизма, влиять на механические свойства и рельеф поверхности и в комплексе улучшать показатели биосовместимости in vivo и in vitro. Были исследованы механические свойства полученных структур, их биодеградация. Полученные конструкции были переданы для дальнейших исследований в рамках проекта «Нейрогенная активность микроструктурированных пленок и трехмерных скаффолдов из рекомбинантного спидроина in vitro и in vivo», в рамках которого было исследовано взаимодействие конструкций с клетками разных типов, в том числе с первичными культурами нейронов гиппокампа и коры мозга мыши, а также с нейрогенными клетками крысы. Было показано, что поверхности всех полученных фотоотверждаемых конструкций обладают прекрасными показателями цитосовместимости, превосходящими аналогичные показатели метакрилированного фиброина. Это было продемонстрировано в экспериментах на мышиных фибробластах 3T3, мышиных эмбриональных фибробластах, клетках нейробластомы линии SH-SY5Y и на первичных нейрональных клетках различного происхождения. Особый интерес представляют результаты взаимодействия первичных нейронов коры мозга мыши с исследуемыми субстратами. Субстраты на основе фиброина и его метакрилированных производных, поддерживающих рост и дифференцировку нейрогенных иммортализированных клеток SH-SY5Y, не обеспечивали высоких показателей роста первичных нейронов. Однако, все производные спидроинов, а в особенности 1F9 и 2Е12-linker-RGDS и их метакрилаты, обладали нейростимулирующей активностью, что проявлялось в увеличении длины нейритов и повышении экспрессии маркеров нейрональной дифференцировки: MAP2, NeuN, NCAM и β3-tubulin [Moysenovich A.M. et al. Akt and Src Mediate the Photocrosslinked Fibroin Induced Neural Differentiation" // NeuroReport (сдана в редакцию)]. Также высокая биосовместимость и регенеративная активность разработанных конструкций была продемонстрирована при оценке влияния полученных пленок на регенерацию кожи. Исследования in vivo были проведены в модели полнослойной раны кожи мыши. Использование пленок Ф-МЖ в качестве раневых покрытий способствовало ускорению заживления раны и более полному восстановлению структуры кожи по сравнению с контролем (применение марли). У животных в экспериментальной группе наблюдалось формирование волосяных фолликулов и сокращение площади рубца на 28 сутки [Котлярова М.С. и др., Фотоотверждаемые пленки на основе фиброина и желатина для регенерации кожных покровов // Вестник московского университета (сдана в редакцию)]. В сотрудничестве с исследователями из ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н.Блохина» Минздрава России в рамках проекта «Молекулярные механизмы индукции нейродифференцировки на микроструктурированных пленках и трехмерных скаффолдах из рекомбинантного спидроина» были получены данные о влиянии стрессовых факторов на показатели роста фибробластов мыши, культивируемых на субстратах из 1F9 и фиброина. Показано, что такие пленки способствуют активной клеточной пролиферации, а при наличии стрессовых факторов защищают от проявления признаков клеточного старения, таких как: увеличение площади клеток и их ядер, снижение показателей пролиферации, усиление апоптоза, снижение синтеза коллагена. Наиболее выраженный эффект поддержания параметров роста клеточной культуры как при высокой, так и при низкой концентрации глюкозы, предположительно, был обеспечен за счет физико-химических структурных и биологических особенностей поверхности пленок из белка спидроина. Кроме того, были получены данные о регенеративной активности спидроиновых частиц на генетически модифицированной репортерной линии мышей, у которых стволовые клетки и их потомство характеризуются экспрессией зеленого флуоресцентного белка (GFP), находящегося под промотором нестина. Анализ срезов через 7 суток после моделирования фокальной ишемии выявил большее количество нестин-положительных клеток в области зубчатой фасции в группе животных, получивших инъекцию спидроина, по сравнению с группой, получавшей инъекции физиологического раствора. Анализ срезов головного мозга, приготовленных через 4 недели после индукции ишемии, выявил также большее количество нестин-положительных клеток в зубчатой фасции гиппокампа в группе животных, получивших спидроин.
3 3 марта 2020 г.-28 февраля 2021 г. Нейрогенная активность микроструктурированных пленок и трехмерных скаффолдов из рекомбинантного спидроина in vitro и in vivo
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".