ИСТИНА

Значительный вклад в продукцию органического вещества в биосфере Земли вносят оксигенные фототрофные микроорганизмы (микроводоросли, МВ), обладающие разнообразными путями биосинтеза самых разных соединений, включая ценные для человека липиды, пигменты и белки. В последние годы активно исследуются возможности использования МВ в качестве источника молекул-предшественников для фармацевтической промышленности, тонкой химии, органического синтеза и нефтехимии, а также для снижения техногенных выбросов углекислого газа. Однако накопленных к настоящему времени знаний о метаболизме МВ и его регуляции зачастую оказывается недостаточно для того, чтобы полностью раскрыть их биосинтетический потенциал. В этой связи весьма актуально изучение толерантности фотоавтотрофов к высоким концентрациям CO2 в условиях, оптимальных для роста культуры, а также при стрессе, вызванном азотным голоданием и (или) светом высокой интенсивности. Особый интерес представляет исследование CO2-толерантности зеленых МВ (Chlorophyta) из местообитаний с экстремальными условиями инсоляции и температурного режима (Белое море), обладающих толерантностью к сверхвысоким концентрациям CO2 и выраженными ответами липидного метаболизма на действия стрессоров различной природы, таких как симбиотическая МВ Desmodesmus sp. 3Dp86E-1, изолированная из беломорского гидроида. Результаты проекта будут способствовать расшифровке механизмов регуляции центрального метаболизма, поступления углерода в клетку, распределения фотоассимилятов между биосинтезом различных классов структурных и запасных липидов, что имеет большое значение для биотехнологии микроводорослей -- продуцентов ценных для человека липидов.

A significant contribution to the production of organic matter in the terrestrial biosphere contribute oxygenic phototrophic microorganisms (microalgae, MA) with diverse pathways of biosynthesis of various compounds, including valuable lipids, pigments and proteins. In recent years, the possibility of using MA as the source precursor molecules for the pharmaceutical industry, fine chemicals, organic synthesis and petrochemistry, as well as to reduce man-made carbon dioxide emissions were actively investigated. However, current knowledge of the metabolism of MA and its regulation is often insufficient to fully reveal their biosynthetic potential. In this regard, it is very important to study the tolerance of photoautotrophs to high CO2 under conditions optimal for the growth of culture and under the stress caused by nitrogen starvation and (or) light of high intensity. Of particular interest is the study of the CO2-tolerance in green microalgae (Chlorophyta) from habitats with extreme conditions temperatures and solar irradiances (White Sea), with tolerance to ultra-high CO2 concentrations and acute responses of lipid metabolism to the action of stressors of different nature, such as symbiotic Desmodesmus sp. 3Dp86E-1, isolated from the White Sea hydroid. The results of the project will contribute to deciphering the mechanisms of regulation of central metabolism, carbon allocation in the cell, the distribution of photoassimilates between the biosynthesis of various classes of structural and spare lipids, which is of great importance for biotechnology of microalgae-producers of valuable human lipids.

Охарактеризовать кинетику роста минимум одного изолята МВ – симбионтов донных беспозвоночных животных в норме (на полной среде) и в отсутствие связанного азота в среде культивирования при различных уровнях CO2 в газо-воздушной среде. Изучить влияние азотного голодания и высоких концентраций CO2 (по отдельности и в сочетании) на жирнокислотный состав липидов клеток МВ. Изучить влияние тех же факторов на пигментный состав, а также состояние и функциональную активность фотосинтетического аппарата МВ. Выяснить наличие в геноме исследуемых МВ гомологов основных внеклеточных и внутриклеточных карбангидраз, описанных для других микроводорослей.

Авторами впервые была получена коллекция изолятов симбиотических микроводорослей (МВ) из донных беспозвоночных животных Белого моря с особыми ультраструктурными и физиолого-биохимическими характеристиками и высоким биотехнологическим потенциалом. Отдельные изоляты из этой коллекции будут исследованы в рамках предлагаемого проекта. Была установлена таксономическая принадлежность данных МВ на основе нуклеотидных последовательностей генов рибосомальной РНК и микроморфологии эпиструктур поверхности клеток. Также были охарактеризованы рост, динамика жирнокислотного и пигментного состава клеток отдельных изолятов, культивируемых при атмосферных уровнях CO2, получены оригинальные данные о потенциальной способности симбиотических МВ к индукции синтеза и накоплению липидов в условиях азотного голодания и высоких концентрациях CO2. Предварительными исследованиями установлена высокая CO2-толерантность намеченных к исследованию симбиотических МВ. Наряду с традиционными методами биохимического анализа, для мониторинга физиологического состояния культур МВ будут использоваться разработанные авторами проекта оригинальные методы, основанные на спектроскопии поглощения и отражения, а также на измерении переменной флуоресценции хлорофилла в клетках МВ.

Целью настоящего проекта было исследование механизмов толерантности симбиотических зеленых микроводороcлей к сверхвысоким уровням CO2. В качестве модельных организмов использовали оригинальный штамм Desmodesmus sp. IPPAS S-2014 (ранее 3Dp86E-1), высокотолерантный к CO2 (до 100 об.% в ГВС), ранее выделенный в нашей лаборатории из беломорского гидроида Dynamena pumila. В дополнение к нему использовали организмы с низкой CO2-толерантностью: родственный свободноживущий штамм Tetradesmus obliquus IPPAS S-2023 (46), а также каротиногенную микроводоросль Haematococcus pluvilais IPPAS H-2018 с особыми механизмами стресс-толерантности. Сравнивали влияние повышенных уровней CO2 и (или) азотного голодания на рост культуры, pH среды, состояние пигментного аппарата, ультраструктурную организацию клетки, индукцию фотозащитных механизмов (NPQ, циклический транспорт электронов вокруг ФС1) и модуляцию CO2-концентрирующих механизмов. В ходе работы по гранту был выполнен сравнительный анализ кинетики роста штаммов S-2014 и S-2023 на полной минеральной среде BG-11 и аналогичной среде, не содержащей связанного азота. Рост S-2014 на этих средах был охарактеризован при продувании культуры атмосферным воздухом и газо-воздушной смесью (ГВС), содержащей 20% CO2. Показано, что в отсутствие лимитирования азотом обогащение культуры 20% CO2 стимулирует рост S-2014, ускоряя накопление сухого веса приблизительно в два раза. При инкубации в среде, не содержащей азота, при продувании атмосферным воздухом наблюдали характерное для голодающих по азоту культур замедление роста. Продувание ГВС с 20% СO2 на фоне азотного голодания также приводило к замедлению роста культуры, однако темпы накопления биомассы были несколько выше, чем при продувании воздухом, за счет более интенсивного накопления запасных соединений. Существенно, что культуры толерантного штамма S-2014 обладали большей буферностью по сравнению менее толерантными S-2023 и H-2018. В целом, азотное голодание вызывает снижение ненасыщенности жирных кислот (ЖК) липидов клеток S-2014. Это происходит прежде всего, за счет повышения содержания насыщенных и мононенасыщенных ЖК по отношению к ди- и триненасыщенным ЖК. По всей видимости, этот процесс отражает накопление запасных нейтральных липидов и редукцию фотосинтетического аппарата (мембран тилакоидов хлоропластов). При продувании культуры ГВС с 20% CO2 эти эффекты были более выраженными по сравнению с культурами, продувавшимися атмосферным воздухом. Вероятные причины включают дополнительный стресс от снижения pH при растворении CO2 в среде культивирования и более интенсивное поступление в клетку неорганического углерода. У всех изученных штаммов стресс, вызванный азотным голоданием, приводил к редукции фотосинтетического аппарата. Этот процесс проявлялся как снижение содержания хлорофиллов и каротиноидов, а также как редукция гранально-ламеллярной системы тилакоидов. При этом наблюдали снижение квантовой эффективности работы фотосистемы II и рост способности клеток к индукции нефотохимического тушения (NPQ). Важно, что толерантный штамм 2014 обладал способностью к быстрой индукции NPQ до уровня 3.5–4, у нетолерантных штаммов эта реакция отсутствовала. В остальном все изменения, характерные для азотного голодания, данные эффекты были более выражены у культур, продувавшихся ГВС с 20% CO2. Анализ черновой сборки генома и транскриптома Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 выявил присутствие транскриптов двух генов, гомологичных известным генам, кодирующм соответственно, альфа- и бета-карбангидразы у микроводорослей. Также выявлен транскрипт, гомологичный транскрипту генов, кодирующих белок LCIB. Предполагется, что данный белок участвует в регуляции работы механизмов концентрирования неорганического углерода у фототрофных организмов. Обобщая результаты проекта, можно заключить, что чрезвычайно высокая CO2-толерантность у Desmodesmus sp. S-2014 является результатом слаженного функционирования целого комплекса механизмов. Данная черта, вероятно, возникла в ходе ко-эволюции с животным-хозяином, выделяющим CO2 при дыхании. Благодаря этому клетки данной микроводоросли, видимо, оказываются способны достаточно быстро (за характерные времена 10–50 мин.) восстанавливать и поддерживать физиологические значения pH внутри клетки и в хлоропластном компартменте, в частности. В свою очередь, это обеспечивает нормальное функционирование как световых, так и темновых реакций фотосинтеза. Дополнительным фактором толерантности является наличие гибких фотозащитных механизмов (NPQ), позволяющих быстро и безопасно конвертировать в тепло излишек поглощенной энергии света, возникающих в период первоначальной акклимации к действию стрессора. Можно также предположить, что неспособность большинства микроводорослей расти при высокой концентрации CO2 в ГВС обусловлена недостаточно эффективными механизмами поддержания гомеостаза pH внутриклеточных компартментов и нарушением функций фотосинтетического аппарата, опосредованным низким pH. По-видимому, энергозатраты на поддержание гомеостаза могут покрываться за счет дополнительной АТФ, генерируемой при циклическом транспорте электронов вокруг ФС I.