ИСТИНА

Представленный проект относится к одной из наиболее актуальных и активно разрабатываемых проблем современной биологии развития и клеточной биологии – участия механических сил, генерируемых эмбриональными клетками, в регуляции клеточной физиологии, морфогенеза и дифференцировки. В работах нашей группы была показана чрезвычайно важная роль механических факторов не только в морфогенезе, но и в дифференцировке эмбриональных тканей (Kremnyov et al., 2012; Kornikova et al, 2010). Данных о механосенсорах в клетке и молекулярных механизмах передачи механического стимула в клетку и по ткани в настоящее время недостаточно для создания удовлетворительных моделей. Механозависимые ионные каналы могут участвовать в передаче механических стимулов в клетку в процессах раннего развития. Вследствие малой разработанности этой темы основная цель заявляемого проекта – исследование роли механозависимых ионных каналов в процессах морфогенеза, дифференцировки и коллективных клеточных движений. Основные задачи в рамках представленного проекта: выявление механозависимых ионных каналов, экспрессирующихся в раннем развитии Xenopus; количественное исследование временной динамики и пространственного распределения экспрессии механозависимых ионных каналов в ранних зародышах; функциональное исследование механозависимых морфогенетических процессов при модуляции экспрессии этих генов. В результате выполнения проекта будут установлены экспрессирующиеся в раннем развитии Xenopus каналы разных типов, механозависимость которых показана на других системах, изучены их пространственно-временные паттерны экспрессии, а также исследовано влияние модуляции экспрессии отдельных каналов на формообразование у зародышей.

На основе анализа современной литературы нами был составлен список ионных каналов, для которых имелись сведения о механозависимости. Мы провели анализ экспрессии механозависимых ионных каналов (МИК) методом ПЦР, совмещенной с обратной транскрипцией. На ранних стадиях развития Xenopus выявлена экспрессия генов следующих каналов: TRPV1, TRPV4, TRPM4, TRPM7, TRPC1, TRPC4, TRPC6, TRPA1, PKD1, PKD2, Piezo1, Piezo2, бета-, гамма- и дельта-субъединиц канала ENaC, SAKCa и CFTR. Простространственно-временной паттерн выявленных каналов исследован методом ПЦР в реальном времени. Методом гибридизации in situ исследована пространственная локализация транскриптов гена МИК Piezo1 в зародышах Xenopus tropicalis на последовательных стадиях развития, от стадии зиготы до стадии вылупления. Совместно с коллегами из университета Гёттингена (Германия) был исследован паттерн экспрессии мРНК механочувствительных каналов PKD1, PKD2 и PKD1l2 во время гаструляции и нейруляции у зародышей курицы методом гибридизации in situ. Клонированы полнодлинновые кодирующие последовательности следующих механозависимых каналов Xenopus: TRPC1, TRPC6, TRPV4. Проведены первые эксперименты по оверэкспрессии канала TRPV4. Полученные результаты свидетельствуют о том, что механозависимые каналы крайне важны для поддержания эпителиального фенотипа эмбриональных клеток. В настоящий момент уже синтезирована мРНК TRPC1 для проведения экспериментов влияния гиперэкспрессии канала TRPC1 на раннее развитие Xenopus. Cконструированы слитые белки TRPC1-GFP-N и TRPC1-GFP-C, для исследования локализации канала в эмбриональных клетках.