ИСТИНА

1. Разработать детальные схемы для всех запланированных экспериментов. 2. Создать все необходимые молекулярные конструкции для решения поставленных задач. 3. Синтезировать все линии дрозофилы, необходимые для проведения генетических и молекулярно-генетических экспериментов. 4. Количественно исследовать транскрипцию генов Grp и Iris на разных стадиях онтогенеза и в разных тканях линий D. melanogaster, различающихся по наличию/отсутствию мутации в гене flamenco и по наличию в тканях активного ретровируса gypsy. 5. Исследовать генетические эффекты стрессовых факторов, влияющих на транскрипцию генов Grp и Iris (тепловой и холодовой шок, воздействие индукторами окислительного стресса, бактериальная и вирусная инфекции). 6. Исследовать РНК-связывающую активность гена Grp, а также клонировать и изучить с точки зрения экспрессии ген env ретротранспозона gypsy. 7. Проанализировать биоинформатически 5’-нетранслируемые области ретротранспозонов на наличие возможных внутренних открытых рамок считывания, кодирующих фрагменты или отдельные полипептиды, регулирующие их транспозиционную активность. 8. Проанализировать количественно транскрипцию генов hp1a, hp1b, hp1c, hp1d, hp1e, кодирующих гетерохроматиновые белки семейства Hp1, в линиях D. melanogaster, мутантных по локусу flamenco. 9. Написать и направить в печать 2 статьи в рецензируемые журналы.

1. Исследование экспрессии генов Grp и Iris. Исследована экспрессия гена Grp, геномного гомолога гена ретровируса gypsy в геноме D.melanogaster, на уровне транскрипции на разных стадиях индивидуального развития. Для исследования взяты эмбрионы, личинки и взрослые мухи. В результате экспрессию гена Grp обнаружили у самцов и самок на стадии имаго, экспрессию гена Grp у эмбрионов и личинок третьего возраста обнаружить не удалось. Далее исследовали уровень транскрипции гена Grp в тканях кишечника, яичников, семенниках, головы и корпуса (ткани которые остаются после выделения органов), выделенных из взрослых самок D. melanogaster линии SS, характеризующейся мутацией в локусе flamenco, контролирующем транспозиции gypsy. В результате выявили, что у самок уровень экспрессии гена Grp в яичниках оказался примерно в 500 раз ниже, чем в остальных исследованных органах. У самцов также наблюдается сниженный уровень экспрессии гена Grp в гонадах по сравнению с остальными тканями – экспрессия гена Grp в семенниках ниже примерно в десять раз. Очевидно, что экспрессия максимальна в имагинальных тканях, тогда как в генеративных и эмбриональных, а также личиночных, она наблюдается на низком уровне или не обнаруживается вовсе. Низкий уровень экспрессии в яичниках по всей видимости связан с тем, что в яичниках мало соматических имагинальных тканей – основную массу яичников у дрозофилы составляют неоплодотворенные яйца. В семенниках доля соматических тканей более значительна, вероятно, из-за этого уровень экспрессии гена Grp в семенниках выше, чем в яичниках. Различия в экспрессии на разных стадиях развития и в разных органах предполагают наличие механизма регуляции экспрессии гена Grp. Тканеспецифическая регуляция экспрессии гена Grp у имаго дрозофилы, по-видимому, осуществляется на стадии транскрипции. Для поиска белковых продуктов генов Grp и Iris, гомологов генов gag и env ретровирусов дрозофилы, поставлена вестерн-гибридизация тотального экстракта белков, выделенных из взрослых особей D. melanogaster с сыворотками первичных антител к белкам Grp и Iris. В результате на иммуноблотах обнаружена единственная полоса. Полосы соответствуют размеру белка ~ 50 кДа, для Grp и ~55 кДа для Iris. Ранее для белков Grp и Iris была биоинформатически предсказана мембранная локализация. Для экспериментального подтверждения топологии белков проводили вестерн-блот гибридизацию с выделенными мембранной и цитоплазматической фракциями белковых экстрактов. Показано, что белки Grp и Iris обнаруживаются в мембранной фракции, сигнал от цитоплазматической фракции слабый (в иммуноблоте с антителами к Grp), либо отсутствует (в иммуноблоте с антителами к Iris). Это означает, что белок Iris (гомолог env) сохранил в процессе доместикации трансмембранный домен, а белок Grp (гомолог gag) - приобрел новую, не характерную для белка gag, трансмембранную локализацию. Ранее для белка Iris была предложена гипотеза его участия в защите от вирусной инфекции (Malik et al., 2005). Мы решили экспериментально проанализировать индукцию экспрессии генов Iris и Grp в ответ на присутствие активного ретровируса gypsy. Для исследования влияния ретровируса gypsy на экспрессию генов Grp и Iris использовали линию дикого типа D-32, линию SS, мутантную по локусу flamenco (flamenco контролирует транспозицию ретротранспозона gypsy), и MS - изогенную с SS линию, имеющую функциональную и активно перемещающуюся копию ретротранспозона gypsy. Результаты эксперимента показывают статистически значимые различия в уровне экспрессии Grp у самок линии MS относительно линий SS и D-32, для самцов значимых различий не обнаружено. Повышенный уровень экспрессии Grp у самок линии MS относительно других линий можно объяснить наличием активной копии ретротранспозона-ретровируса gypsy в геноме этих особей. Отсутствие статистически значимых различий у самцов исследуемых линий может быть связано с различиями в тканевом составе особей разного пола и различиями в регуляции экспрессии гена Grp в различных тканях. Можно предположить, что доля органов и тканей, в которых Grp выполняет свою специфическую функцию и отвечает повышением экспрессии (например, жировое тело), у самок выше.Статистически значимых отличий в уровне экспрессии Iris среди исследуемых линий не обнаружено. Таким образом, присутствие функциональной, активно перемещающейся копии ретротранспозона gypsy в геноме D.melanogaster влияет на экспрессию гена Grp, повышая ее уровень. Далее уровень экспрессии генов Iris, Grp и ретротранспозона-ретровируса gypsy исследовали в различных тканях (кишечник, корпус, яичники), выделенных из половозрелых самок линий SS и MS D.melanogaster. Обнаружено, что уровень экспрессии Grp в корпусе особей линии MS статистически отличается и приблизительно в 2 раза выше, чем в линии SS. Аналогичная тенденция обнаружена для тканей кишечника. В яичниках ген Grp экспрессируется на очень низком уровне. Во всех исследуемых органах уровень экспрессии gypsy приблизительно в 20 раз выше у особей линии MS. Уровень экспрессии гена Iris не отличается между линиями в корпусе и выше в яичниках линии MS. Обнаруженное различие отчасти можно объяснить тем, что Iris, по-видимому, экспрессируется в соматических тканях яичников, но не в генеративных, и поскольку линия MS характеризуется низкой фертильностью, доля соматических тканей в яичниках у самок этой линии, очевидно, выше. В кишечнике ген Iris экспрессируется на очень низком уровне. Таким образом, ген Grp отвечает повышением экспрессии в ответ на ретровирус gypsy в соматических тканях корпуса. Экспрессия гена Iris выше в яичниках линии MS, что может быть связано с особенностями тканевого состава яичников у этой линии. 2. Исследоватние генетических эффектов стрессовых факторов, влияющих на транскрипцию генов Grp и Iris. Проведено исследование уровня экспрессии генов Iris и Grp у самок линии дикого типа (D-32, возраст 7-8 сут.) в ответ на введение в организм грамположительных (Bacillus cereus) и грамотрицательных (Escherichia coli) бактерий. Также мы проанализировали экспрессию эффекторных генов иммунного ответа: Metchnikowin (Mtk) (отвечает на широкий спектр патогенов), Diptericin A (DptA) (эффектор Imd-сигнального пути), Defensin (Def) (главным образом, эффектор Toll-сигнального пути), Turandot A (TotA) (эффектор Jak-STAT-сигнального пути и MAPK- сигнального пути). Введение бактерий в организм производилось путѐм укола иглой, смоченной в концентрированной культуре. Обнаружено, что экспрессия гена Grp повышается только в ответ на индукцию иммунного ответа B.cereus. При этом B.cereus вызывает активацию генов всех исследуемых антимикробных пептидов и гена TotA (для всех генов обнаружены статистически значимые отличия по сравнению с контролем). Таким образом, инфекция B.cereus активирует сигнальные пути Imd, Toll и Jak-STAT. Инфекция E.coli повышает уровень экспрессии генов Mtk и DptA, а гены-эффекторы сигнальных путей Toll и Jak-STAT (Def и TotA соответственно) не отличаются по уровню экспрессии от контрольных образцов.В уровне экспрессии гена Iris значимых различий между контролем и опытом не было обнаружено. Ген Iris, по-видимому, не участвует в иммунном ответе и не индуцируется ни ретровирусной, ни бактериальной инфекцией. Мы предполагаем, что активация бактериями B.cereus гена Grp связана с активацией Jak-STAT сигнального пути. Однако это предположение требует дальнейшего подтверждения. Далее нами было исследовано воздействие на экспрессию генов Iris и Grp следующих стрессовых факторов: окислительного стресса, голодания, холодового и теплового шока. В качестве индуктора окислительного стресса был использован менадион – генератор супероксиданион- радикала. В отличие от других частоиспользуемых индукторов окислительного стресса, таких как паракват или перекись водорода, менадион не вызывает острого окислительного стресса и не приводит к значительной смертности при небольших концентрациях. Кроме этого, менадион обладает большей стабильностью и лучше подходит для приготовления питательных сред и последующей экспозиции. Уровень экспрессии генов Iris и Grp исследовали в ответ на индукцию окислительного стресса менадионом у самцов и самок линии D-32 (возраст 3 дня). Выявлено, что как у самок, так и у самцов, уровень экспрессии гена Iris снижается в результате воздействия менадионом. В уровне экспрессии гена Grp статистически значимых различий между образцами не выявлено. Далее проведено исследование влияния голодания на экспрессию генов Grp и Iris у имаго D.melanogaster. Уровень экспрессии генов Iris и Grp исследовали в ответ на голодание у самцов и самок линии D-32 (возраст 7 дней). Выявлено, что у самок экспрессия гена Grp повышается в отсутствие влаги и питательной среды при четырѐх- и восьмичасовом воздействии. Не исключено, что голодание может индуцировать иммунный ответ Jak-STAT-системы. По уровню экспрессии гена Iris статистически значимых различий между образцами не выявлено. Далее уровень экспрессии генов Iris и Grp исследовали в ответ на воздействие экстремальных температур у самцов и самок линии D-32 (возраст 7 дней). В результате эксперимента выявлено понижение уровня экспрессии гена Iris при воздействии теплового шока различной длительности. Статистически значимых различий в уровне экспрессии Grp не обнаружено. Таким образом, результаты проведенных экспериментов показывают некоторые особенности влияния различных стрессовых воздействий на экспрессию генов Grp и Iris у взрослых особей D.melanogaster, также выявлена мембранная локализация белковых продуктов этих генов. Затем проведен биоинформатический анализ функции Iris, основанный на данных экспериментально установленных физических взаимодействий: коаффинной очистке рекомбинантных белков и последующего масс- спектроскопического анализа. Наиболее значимые взаимодействия составляют восемь белков, которые также взаимодействуют друг с другом. Три белка (CG7766, CG8475 и PhKgamma) представляют собой кальмодулинзависимый комплекс киназ фосфорилаз, который участвует в гликогенолизе и активируется цАМФ при стрессовых условиях, например при голодании или в период диапаузы у насекомых. Распад гликогена у D.melanogaster может происходить как в жировом теле, так и в мышечной ткани, что соответствует паттернам экспрессии гена Iris. Белок CG11448 изучен плохо. Известно, что он участвует в морфогенезе нейронов. Гомолог этого белка у млекопитающих — Rilp играет роль в транспорте поздних эндосом и аутофагосом к дегенеративным отсекам, участвует в регуляции лизосомной морфологии и их распределения и может активироваться при голодании. Фосфатаза Alphabet является негативным регулятором путей стресс активируемых MAPK – SAPK (в том числе JNK и p38) и других киназ. Белок coro является структурным цитоплазматическим компонентом клетки и, предположительно, участвует в транспорте везикул. Faa – фумарилацетоацетаза, фермент катаболизма тирозина. Про функцию белка CG4617, содержащего HMG- домен ничего не известно. Таким образом, Iris взаимодействует с катаболическими ферментами (комплекс киназ фосфорилаз, Faa), со структурными белками, которые вероятно, участвуют в организации внутриклеточных мембранных компартментов (coro, CG11448), а также с фосфатазой Alphabet. Роль Iris (в соответствии со свойствами гомологов env) может заключаться в слиянии компонентов мембранных компартментов, таких как эндосомы, лизосомы или аутофагосомы, а также в привлечении ферментативных комплексов. При этом Alphabet может фосфорилировать мембранные белки, способствуя слиянию, как это показано для гомолога Alph у дрожжей. В наших экспериментах ген Iris отвечает понижением экспрессии на стрессы, для которых характерна активация SAPK (окислительный стресс, тепловой и септический шок), и исходя из описанных взаимодействий с негативным регулятором стрессового MAPK-сигналлинга Alph, возможно, является компонентом системы клетки, которая конкурирует с этими путями и также может ими подавляться. 3. Исследоватние РНК-связывающей активности гена Grp, а также клонирование гена env ретротранспозона gypsy. Проведено исследование РНК-связывающей активности рекомбинантного белка Grp in vitro. Для этого получен рекомбинантный белок Grp, который использован в экспериментах gelshift и EMSA с тотальной РНК, выделенной из линии дикого типа D-32. Для оптимальной визуализации результатов и сохранение целостности РНК время и условия проведения электрофореза модифицированы относительно стандартного протокола, а именно электрофорез проводили при напряжении 70 В( напряжение подбиралось экспериментально от 50 до 150 В) при +4 С в течении 30 минут( время подбиралось экспериментально от 20 минут до 1,5 часа). Общий объем пробы составлял 20 мкл, из которых 10 мкл составлял раствор исследуемого белка в буфере для диализа, 2 мкл тотальной РНК, и 8 мкл PBS или растворы двухвалентных ионов Mg, Zn, Mn в различных соотношениях или по каждому в отдельности. В модифицированном протоколе метода использовали не буфер для связывания (binding-buffer), а PBS для исключения возможности отрицательного влияния повышенной ионной силы буфера на возможное связывание белка с РНК. Проводили несколько вариантов связывания с варьированием времени связывания(20 минут,30 минут,1 час,1,5 часа,2 часа,16 часов) и температуры связывания( +4 С, комнатная температура). Основным вариантом было выбрано связывание 1 час при +4 С, исходя из оптимальной сохранности качества РНК, что было необходимо для оптимальной визуализации РНК в геле, целостности полос рибосомальных РНК, отсутствию шмеров. В качестве проб белка использовались следующие разведения: концентрированный раствор после диализа, 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000. Визуализация РНК в геле проводилась с помощью выдерживания геля в растворе бромистого этидия ( 10 мкл/100 мл деионизованной воды) в течение 3-5 минут, с последующей отмывкой геля в деионизованной воде в течении 5 минут. В настоящее время поставлены пилотные эксперименты, получены первые данные, показывающие наличие взаимодействия, и проводится дополнительная оптимизация условий реакции. Проведены эксперименты по клонированию в векторе pET30 и экспрессии в клетках E. coli гена env ретровируса дрозофилы gypsy. В настоящее время ведутся пилотные эксперименты по поиску белков-мишеней белка env у дрозофилы. 4. Биоинформатический анализ 5’-нетранслируемых областей ретротранспозонов на наличие возможных внутренних открытых рамок считывания, кодирующих фрагменты или отдельные полипептиды, регулирующие их транспозиционную активность. На основании ранее полученных данных было предположено, что важную роль в контроле транспозиции ДКП-ретроэлементов и ретровирусов могут и играть нетранслируемых областей этих элементов, которые могут использоваться для связывания гетерохроматиновыми белками семейства НР1. Последние могут играть роль негативных регуляторов (репрессоров) транспозиции. Известно, что белки НР1 связываются с тандемными повторами. Нами был проведен поиск тандемных повторов в 5’- нетранслируемых областях (5’- UTR ) ДКП-ретроэлементов группы gypsy. Установлено, что у ретроэлемента Springer тандемные повторы в нетранслируемой области отсутствуют, а элемент gypsy содержит наименьшее число повторов среди представленных элементов и наименьшую протяженность в нетранслируемой области. Наиболее интересные результаты были обнаружены при анализе последовательнотсей копий ретроэлемента Tirant (20 в секвенированном геноме). 5’- UTR этого элемента может содержать от двух до шести повторов размером 102 п.н. Среди проанализированных нами последовательностей Tirant были выявлены случаи, когда 102 п.н. повторы 5’-UTR одновременно входили в состав ОРС, найденных при помощи программы Open Reading Frame Finder. Например, в одной из копий Tirant транслированная длина ОРС составила 201 амк. При помощи инструмента tBLASTx мы сравнили эту последовательности с последовательностями в базе NCBI. В результате была обнаружена гомология с тетратрикопептидными белками микроорганизмов разных видов. Поскольку имеются доказательства молекулярного «захвата» функциональных ОРС МЭ D. melanogaster, мы не исключили вероятность того, что предполагаемая ОРС существует в виде индивидуального транскрипта, либо входит в состав других известных ОРС Tirant путем альтернативного сплайсинга с ними. Чтобы подтвердить наши предположения, мы выполнили Step-out RACE. Однако ожидаемого индивидуального транскрипта в составе 5’-UTR Tirant выявлено не было. Тем не менее, мы не исключаем того, что эта область может входить в состав более протяженного транскрипта, который выявить не удалось, либо повторы в 5’-UTR выполняют исключительно регуляторную функцию. 5. Количественный анализ транскрипции генов hp1a, hp1b, hp1c, hp1d, hp1e, кодирующих гетерохроматиновые белки семейства Hp1, в линиях D. melanogaster, мутантных по локусу flamenco. С целью выяснения роли генов, кодирующих белки семейства НР1 и белки системы РНК-интерференции, в формировании фенотипа flamenco проведен анализ их экспрессии на уровне транскрипции в линии SS, мутантной по локусу flamenco. Измеряли экспрессию генов РНК- интерференции aub, zuc и ago3 в линии SS, мутантной по локусу flamenco, и сравнили ее с экспрессией в линии дикого типа D-32. В результате проведенных исследований различий в экспрессии этих генов в линии дикого типа и SS обнаружено не было. Далее провели анализ экспрессии генов, кодирующих белки семейства НР1. Основные паралоги гена hp1 (hp1a, hp1b, hp1c) экспрессируются во всех тканях, поэтому анализ их экспрессии проводили на препаратах тотальной РНК. Гены hp1d и hp1e экспрессируются исключительно в герминальных тканях D. melanogaster, поэтому кДНК синтезировали на основе РНК, выделенной из яичников и семенников соответственно. По полученным данным уровень экспрессии генов hp1a, hp1b и hp1c в линии SS не отличается от уровня экспрессии дикого. Это свидетельствует о том, что фенотип flamenco в наших линиях не вызван нарушением экспрессии данных генов. Этого следовало ожидать, так как известно, что обычно мутации в этих генах летальны или вызывают грубые дефекты в развитии мух. Мутации в генах hp1d и hp1е не летальны, но могут вызывать стерильность у самок. Уровень экспрессии гена hp1d в линии SS оказался примерно в 2 раза ниже по сравнению с диким типом. Полученные данные позволяют предполагать, что низкая экспрессия hp1d может вносить вклад в формирование фенотипа flamenco- . Ген hp1e в линии SS экспрессируется, в основном, на уровне D32 и, таким образом, не участвует в формировании фенотипа flamenco. Исходя из имеющихся литературных данных, следует предполагать, что снижение уровня экспрессии hp1d в линии SS должно приводить к снижению продукции piРНК кластера №1, но не кластера flamenco. Однако полученные нами данные по изучению транскрипции в локусе flamenco и исследованию экспрессии генов семейства НР1 и генов системы РНК-интерференции показывают, что в линии SS в яичниках снижение в 2 раза уровня транскрипции локуса flamenco коррелирует исключительно со снижением в 2 раза уровня транскрипции гена hp1d. Если эти снижения взаимосвязаны, непонятно, приводит ли снижение экспрессии hp1d к снижению экспрессии flamenco. Если это так, это может означать, что НР1d регулирует транскрипцию локуса flamenco и, вероятно, каким-то образом задействован в процессинге первичных транскриптов. Следует отметить, что до сих пор неизвестно, каким образом осуществляется процессинг предшественников и образование piРНК . Предполагается, что в нем может быть задействован продукт гена zuc. Однако мы наблюдаем отсутствие процессинга первичного транскрипта при нормальной экспрессии гена zuc. Очевидно, что исследование этого вопроса может существенно расширить представления о механизмах подавления транспозиции МГЭ и процессах регуляции генной экспрессии в целом.6. По результатам опубликованы 2 научные статьи. 3.7. Степень новизны полученных результатов Все результаты являются оригинальными и получены впервые. Впервые проанализирована тканеспецифичная транскрипция генов D.melanogaster Iris и Grp, геномных гомологов ретровирусных генов env и gag соответственно, и показано, что белковые продукты генов D.melanogaster Iris и Grp локализованы в мембранных компартментах клетки. Таким образом, гомолог env сохранил в процессе доместикации трансмембранный домен, а гомолог gag приобрел трансмембранный домен. Впервые выявлено, что присутствие функционального ретровируса gypsy в организме D.melanogaster вызывает повышение уровня экспрессии гена Grp в соматических тканях каркаса и не оказывает влияния на уровень экспрессии гена Iris. Таким образом, ген Grp задействован в иммунном ответе на ретровирусную инфекцию. Впервые показано, что активация иммунного ответа у D.melanogaster грамположительными бактериями Bacillus cereus, активирующими путь иммунного ответа Jak-STAT, вызывает повышение уровня экспрессии гена Grp и не влияет на экспрессию гена Iris. Впервые исследовано влияние абиотических стрессовых факторов (окислительный стресс, голодание, тепловой и холодовой стресс) на экспрессию генов Iris и Grp было и обнаружено, что уровень экспрессии гена Grp повышается в ответ на голодание у самок D.melanogaster, а экспрессия гена Iris подавляется в ответ на тепловой шок, окислительный стресс и септическую травму. В совокупности, полученные данные позволяют заключить, что ген Grp задействован в иммунном ответе у D.melanogaster, ген Iris не участвует в иммунном ответе и, по-видимому, выполняет клеточную функцию, ингибируемую стрессовыми воздействиями. Анализ экспрессии генов, кодирующих белки семейства НР1, впервые показал различия в экспрессии одного из паралогов, гена hp1d, в линиях дрозофилы дикого типа и мутанта SS по локусу flamenco, контролирующего транспозиции ретротроэлемента-ретровируса gypsy. Показано, что низкая экспрессия hp1d в линии SS может вносить вклад в формирование фенотипа flamenco. 3.8. Сопоставление полученных результатов с мировым уровнем Проблема эволюции и генетического контроля активности ретротранспозонов и ретровирусов является одной из важнейших проблем современной биологии, имеющих не только фундаментальное, но и прикладное значение. В этой связи новым и перспективным направлением эволюционных исследований является исследование процесса доместикации генов ретровирусов и ретротранспозонов, процесса, в котором организм-хозяин адаптирует чужеродные последовательности для собственных нужд. Молекулярная доместикация генов ретроэлементов может играть значительную роль в макроэволюции и в приобретении организмом новых специфических функций. Среди доместицированных генов, гомологичных последовательностям ДКП-ретротранспозонов, наиболее изучены гены млекопитающих. Значительная часть из них принадлежит двум семействам генов: SIRH (гомологи gag и pol ретротранспозонов группы sushi-ichi) и PNMA (гомологи gag ретротранспозонов группы Ty3/Gypsy). Первая группа включает 12 генов, важнейшими из которых являются PEG10 и PEG11/RTl1. Они необходимы на ранних этапах формирования плаценты и еѐ развития. Гены ретротранспозонов sushi-ichi подвергались доместикации независимо и неоднократно, это повлияло на возникновение отличий в репродуктивной системе млекопитающих и на их макроэволюцию. Семейство PNMA включает гены, играющие важную роль в эмбриональном развитии организма, во внутриклеточной сигнализации апоптоза и в развитии нервной системы. Аналогично генам семейства SIRH приобретение генов группы PNMA происходило неоднократно в результате различных доместикационных процессов гена gag ретротранспозонов группы Ty3/Gypsy. Однако оба семейства все же включают гены, появившиеся в результате дупликации (Kaneko-Ishino, Ishino, 2012). Примером одной из наиболее успешных доместикаций последовательности ДКП-ретротранспозонов является семейство доменов SCAN. SCAN – это домен, который обнаруживается в N-концевой части белков одной из групп транскрипционных факторов млекопитающих. Эти домены всегда сопровождаются тандемами цинковых пальцев (ZF) и/или KRAB доменом. SCAN гомологичен С-концевой части белка капсида и происходит от ДКП-ретротранспозонов семейства Gmr1 класса Gypsy/Ty3. Геном мыши содержит около 40 таких генов, многие из которых являются транскрипционными факторами. Часть из них необходимы для дифференцировки и развития эмбриона (Kaneko-Ishino, Ishino, 2012). Известен пример в подавлении транскрипции экзогенного вируса лейкемии мыши (MLV) SCAN-содержащим белком ZFP809 (Wolf, Goff, 2009). Одна из важнейших ролей в подавлении транскрипции принадлежит домену KRAB. KRAB-опосредованная репрессия может влиять не только на геномные последовательности, но и на транскрипцию эписомных ретровирусных генов (Barde et al., 2009). Показано, что KRAB- мотив подавляет интеграцию HIV-1 (Allouch et al., 2011). Таким образом, конкретные доказательства специфического связывания ZF-белков с ретроэлементами или ретровирусами приводят к предположению о формировании в эволюции амниот механизма контроля над ними. Предполагается, что роль домена SCAN в этом механизме может заключаться во взаимодействии с белком капсида ретровирусов различных классов (Emerson, Thomas, 2011). Особый интерес представляет ген Fv1, который является фактором, ограничивающим экзогенный вирус лейкоза мыши (MLV). Fv1 произошел от гена gag эндогенного ретровируса MERV-L (Benit et al., 1997). Белок FV1 блокирует жизненный цикл ретровируса после стадии обратной транскрипции, препятствуя его интеграции в геном хозяина. Предполагается, что FV1 взаимодействует с белком капсида (CA) MLV. Эксперименты по связыванию различных аллельных вариантов белка FV1 и CA показывают сильную корреляцию между специфичностью связывания и ограничением жизненного цикла ретровирусов, при этом считается важным способность FV1 к мультимеризации для эффективного взаимодействия с белком капсида. Тем не менее, до сих пор неясно, является ли такое связывание достаточным для ограничения жизненного цикла ретровируса или же существуют вторичные механизмы (Hilditch et al., 2011).Наиболее изученное семейство генов, являющихся результатом доместикаций гена env, это семейство SYNCYTINs. SYNCYTINs – это группа генов, которые появились у плацентарных млекопитающих в результате независимых доместикаций (как минимум трѐх - у грызунов, приматов и зайцеобразных) env эндогенных ретровирусов. У приматов существует два таких гена SYNCYTIN1 и SYNCYTIN2, которые происходят от гена env разных эндогенных ретровирусов – HERV-W и HERV-FRD, интегрированных 25 и более 40 млн лет назад, соответственно. Геном мыши также содержит два гена этой группы – Syncytin A и Syncytin B, полученные от ретровирусов семейства HERVF/H примерно 20 млн лет назад (Benit et al., 2005). Продукт генов SYNCYTIN сохранил свойства трансмембранного белка ретровирусов, благодаря которым происходит слияние клеток и формирование синцитиотрофобласта плаценты. Мыши, нокаутные по этим генам, проявляют летальность на ранних эмбриональных стадиях вследствие серьезных структурных аномалий плаценты (Dupressoir et al., 2011). Показано, что SYNCYTIN2 и SYNCYTINB обладают иммуносупрессорными свойствами в отличие от SYNCYTIN1 и SYNCYTINA, которые скорее выполняют структурную функцию (Mangeney et al., 2007); однако недавно продемонстрирована роль SYNCYTIN1 в подавлении продукции некоторых важнейших провоспалительных цитокинов (Tolosa et al., 2012). Примечательно, что роль защиты плода от иммунитета матери, как предполагается, может выполнять и непосредственно TM белок (продукт гена env) эндогенного ретровируса. Например, выявлены иммуносупрессорные свойства TM белка HERV-K ретровируса мыши, который специфично экспрессируется в ворсинках цитотрофобласта плаценты (Kammerer et al., 2011). Помимо описанного выше Fv1, гомолога гена gag, геном мыши содержит противовирусные гены Fv4, Rmcf1 и Rmcf2, которые представляют собой полноразмерные интактные гены env. Fv4 является геном устойчивости мыши к вирусу MLV. Fv4 способен взаимодействовать с продуктом гена env вируса лейкемии мыши, формируя дефектные гетероолигомеры, включенные в вирион. Тем самым Fv-4 оказывает негативное доминирующее влияние на белок Env вируса MLV и обуславливает устойчивость мышей к инфекции вируса. Показано влияние Fv-4 на устойчивость не только к экотропному MLV (имеющему узкий специфический круг хозяев), но и к MLV с широким кругом хозяев (Takeda, Matano, 2007). Кроме Fv-4, у мышей обнаружены гены Rmcf1 и Rmcf2, которые обуславливают устойчивость к экзогенным политропным MLV (P-MLV). Механизмы противовирусной защиты, связанные с этими генами, изучены слабо, предполагается роль связывания продуктов этих генов с рецептором для вирусов P-MLV в защите от инфекции (Jung et al., 2002;). Эндогенные бета-ретровирусы (enJSRVs) овец являются еще одним ярким примером доместикации. Геном овец содержит около 20 копий enJSRVs. Эти вирусы родственны двум экзогенным онкогенным вирусам. Предполагают, что env гены enJSRVs являются полезными для хозяина: защищают матку от вирусной инфекции и действуют как регуляторы плацентарного морфогенеза. Этот пример отражает сравнительно недавние доместикационные события (Arnaud et al., 2007). В геноме дрозофилы известно 2 гена, доместицированные от генов gag и env ретровирусов - Grp и Iris(Malik, Henikoff, 2005; Nefedova, Kim, 2009). Обнаруженный нами ген Grp представляет собой геномный гомолог гена gag ретротранспозонов группы Gypsy. Этот ген также обнаруживается во всех секвенированных геномах видов рода Drosophila, обладает высокой консервативностью и является результатом давней доместикации. Функция Grp неизвестна. Исходя из приведенных примеров доместикации различных генов ДКП-ретротранспозонов можно заключить, что специфические функции доместицированных генов так или иначе связаны со свойствами их продуктов, сходными со свойствами гомологичных белков ретровирусов. Например, такие свойства, как способность к олигомеризации, белок-белковым взаимодействиям и способность связывать нуклеиновые кислоты или внедряться в мембрану могут быть консервативными. Помимо выполнения специфических функций доместицированные последовательности имеют тенденцию к противовирусным функциям, которая выглядит вполне закономерной. В совокупности, полученные нами данные позволяют заключить, что ген Grp задействован в иммунном ответе у D.melanogaster, ген Iris не участвует в иммунном ответе и, по-видимому, выполняет клеточную функцию, ингибируемую стрессовыми воздействиями. В настоящее время предполагается, что транспозиция ретроэлементов у D.melanogaster может подавляться, в основном, за счет активности генов семейства НР1 и генов РНК-интерференции. Обнаружено два крупных генерирующих piРНК кластера, локализованных во второй хромосоме (№1) и Х-хромосоме (№2, flamenco) (Brennecke et al., 2007). Эти кластеры представляют собой скопление дефектных копий МГЭ, причем в кластере №1 смысловые последовательности сконцентрированы в обеих цепях ДНК (dual-stand cluster), а в кластере №2, по неизвестным причинам, – преимущественно в одной цепи (single-strand cluster) (Brennecke et al., 2007). Считается, что кластер flamenco экспрессируется только в фолликулярных клетках яичников, и оба кластера экспрессируются в ооците и питающих его клетках (Castel and Martienssen, 2013). Белок HP1d способен физически связываться с обоими кластерами piРНК и активировать процесс РНК-интерференции МГЭ в тканях яичников (Klattenhoff et al., 2009; Castel and Martienssen, 2013). У мутантов по гену hp1d не образуются малые piРНК в кластере №1; при этом в кластере №2 (flamenco) piРНК образуются так же эффективно, как у дикого типа (Klattenhoff et al., 2009). Предполагается, что в случае с кластером №1 нарушается механизм образования piРНК «пинг-понг», который не используется для образования piРНК кластера flamenco (Brennecke et al., 2007). Из этого следует, что белок HP1d необходим для функционирования механизма «пинг-понг». Исходя из имеющихся литературных данных, следует предполагать, что снижение уровня экспрессии hp1d в линии SS должно приводить к снижению продукции piРНК кластера №1, но не кластера flamenco. Однако полученные нами данные по изучению транскрипции в локусе flamenco и исследованию экспрессии генов семейства НР1 и генов системы РНК-интерференции показывают, что в линии SS в яичниках снижение в 2 раза уровня транскрипции локуса flamenco коррелирует исключительно со снижением в 2 раза уровня транскрипции гена hp1d. Если эти снижения взаимосвязаны, непонятно, приводит ли снижение экспрессии hp1d к снижению экспрессии flamenco. Если это так, это может означать, что НР1d регулирует транскрипцию локуса flamenco и, вероятно, каким-то образом задействован в процессинге первичных транскриптов. Следует отметить, что до сих пор неизвестно, каким образом осуществляется процессинг предшественников и образование piРНК (Castel and Martienssen, 2013). Предполагается, что в нем может быть задействован продукт гена zuc (Nishimasu et al., 2012). Однако мы наблюдаем отсутствие процессинга первичного транскрипта при нормальной экспрессии гена zuc. Очевидно, что исследование этого вопроса может существенно расширить представления о механизмах подавления транспозиции МГЭ и процессах регуляции генной экспрессии в целом. У большинства мобильных элементов выбор сайтов-мишеней для интеграции происходит специфично. К примеру, установлено, что транспозиция ретротранспозона ZAM у D. melanogaster осуществляются преимущественно в районы гетерохроматина (Baldrich et al., 1997). Не исключено влияние на данный процесс 5’-UTR и других регуляторных последовательностей мобильных элементов. Для ретрэлемента ZAM показано прямое взаимодействие повторов в его 5’-UTR с гетерохроматиновым белком Hp1а (Minervini et al., 2007). Поскольку МГЭ Tirant наиболее близок к ZAM в филогенетическом отношении (из всех МГЭ группы gypsy), мы предположили, что регуляция его транспозиции может также осуществляться через взаимодействие с белком HP1а, и в настоящее время проводим исследования в этом направлении. На основании анализа современной научной литературы можно заключить, что полученные в ходе реализации проекта результаты приоритетны и полностью соответствуют мировому уровню. Все данные, полученные в результате исследований, являются оригинальными. Обнаруженные закономерности существенно расширяют представления о функциях генов генома дрозофилы, являющихся структурными аналогами генов ретротранспозонов, взаимоотношениях ретротранспозонов, ретровирусов и хозяйского генома, формируют представление о геноме как открытой системе, в которой могут распространяться гены и генетические элементы других биологических видов путем горизонтального и вертикального переноса. Литература: Allouch, A., Di Primio, C., Alpi, E., Lusic, M., Arosio, D., Giacca, M. and Cereseto, A.. The TRIM family protein KAP1 inhibits HIV-1 integration. Cell host & microbe 9, 2011, 484–95. Arnaud, F., Caporale, M., Varela, M., Biek, R., Chessa, B., Alberti, A., Golder, M., Mura, M., Zhang, Y.-P., Yu, L., et al.. A paradigm for virus-host coevolution: sequential counter-adaptations between endogenous and exogenous retroviruses. PLoS pathogens 3, 2007, e170. Baldrich E, Dimitri P, Desset S, Leblanc P, Codipietro D, Vaury C Genomic distribution of the retrovirus-like element ZAM in Drosophila. Genetica. 1997;100(1-3):131-40 Barde, I., Laurenti, E., Verp, S., Groner, A. C., Towne, C., Padrun, V., Aebischer, P., Trumpp, A. and Trono, D. Regulation of episomal gene expression by KRAB/KAP1-mediated histone modifications. Journal of virology 83, 2009, 5574–80. Benit, L., De Parseval, N., Casella, J. F., Callebaut, I., Cordonnier, a and Heidmann, T. Cloning of a new murine endogenous retrovirus, MuERV-L, with strong similarity to the human HERV-L element and with a gag coding sequence closely related to the Fv1 restriction gene. Journal of virology 71, 1997, 5652–7. Benit, L., Kanellopoulos, C., Sapin, V., Dupressoir, A., Marceau, G., Heidmann, T. Syncytin-A and syncytin-B, two fusogenic placenta-specific murine envelope genes of retroviral origin conserved in Muridae. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 2005, 725-30. Brennecke, J., A.A. Aravin, A. Stark, M. Dus, M. Kellis, R. Sachidanandam, and G.J. Hannon. 2007. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell. 128:1089–1103. doi:10.1016/j.cell.2007.01.043 Castel S.E., Martienssen R.A.RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 2013 Feb;14(2):100-12. doi: 10.1038/nrg3355. Dupressoir, A., Vernochet, C., Harper, F., Guegan, J., Dessen, P., Pierron, G. and Heidmann, T. A pair of co-opted retroviral envelope syncytin genes is required for formation of the two-layered murine placental syncytiotrophoblast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 2011, 1164–73. Emerson, R. O. and Thomas, J. H. Gypsy and the birth of the SCAN domain. Journal of virology 85, 2011, 12043–52. Hilditch, L., Matadeen, R., Goldstone, D. C., Rosenthal, P. B., Taylor, I. a and Stoye, J. P. Ordered assembly of murine leukemia virus capsid protein on lipid nanotubes directs specific binding by the restriction factor, Fv1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 2011, 5771–6. inervini, C., Marsano, R., Casieri, P., Fanti, L., Caizzi, R., Pimpinelli, S. et al. Heterochromatin protein 1 interacts with 5?UTR of transposable element ZAM in a sequence-specific fashion. Gene, 2007, 393: 1–10. Jung, Y. T., Lyu, M. S., Buckler-white, A. and Kozak, C. A. Characterization of a Polytropic Murine Leukemia Virus Proviral Sequence Associated with the Virus Resistance Gene Rmcf of DBA / 2 Mice. 76, 2002, 8218–8224. Kammerer, U., Germeyer, a, Stengel, S., Kapp, M. and Denner, J. Human endogenous retrovirus K (HERV-K) is expressed in villous and extravillous cytotrophoblast cells of the human placenta. Journal of reproductive immunology 91, 2011, 1–8. Kaneko-Ishino, T. and Ishino, F. The role of genes domesticated from LTR retrotransposons and retroviruses in mammals. Frontiers in microbiology 3, 2012, 262. Klattenhoff, C., Xi, H., Li, C., Lee, S.& Xu, J. The Drosophila HP1 homologue Rhino is the piRNA pathway. required for transposon silencing and piRNA production by dual strand clusters. Cell, 2009, In press.Kwon, S. H., & Workman, J. L. (2011a). HP1c casts light on dark matter. Cell Cycle, 10(4), 625–630. doi:10.4161/cc.10.4.14796. Lippman, Z., & Martienssen, R. (2004). The role of RNA interference in heterochromatic silencing. Nature, 431(7006), 364–70. Malik, H. S. and Henikoff, S. Positive selection of Iris, a retroviral envelopederived host gene in Drosophila melanogaster. PLoS genetics 1, 2005, e44. Mangeney, M., Renard, M., Schlecht-Louf, G., Bouallaga, I., Heidmann, O., Letzelter, C., Richaud, A., Ducos, B. and Heidmann, T. Placental syncytins: Genetic disjunction between the fusogenic and immunosuppressive activity of retroviral envelope proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 2007, 20534–9.Takeda, A. and Matano, T. Inhibition of infectious murine leukemia virus production by Fv-4 env gene products exerting dominant negative effect on viral envelope glycoprotein. Microbes and infection / Institut Pasteur 9, 2007, 1590–6.Moshkovich, N., & Lei, E. P. (2010). HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila. PLoS Genetics, 6(3) Nefedova, L.N. & Kim, A.I. Molecular Phylogeny and Systematics of Drosophila Retrotransposons and Retroviruses. Molecular Biology, 2009, 43: 747–756 Nishimasu H, Ishizu H, Saito K, Fukuhara S, Kamatani MK, Bonnefond L,Matsumoto N, Nishizawa T, Nakanaga K, Aoki J, et al. 2012. Structure and function of Zucchini endoribonuclease in piRNA biogenesis. Nature 491:284– 287. Tolosa, J. M., Schjenken, J. E., Clifton, V. L., Vargas, a, Barbeau, B., Lowry, P., Maiti, K. and Smith, R. The endogenous retroviral envelope protein syncytin-1 inhibits LPS/PHA-stimulated cytokine responses in human blood and is sorted into placental exosomes. Placenta 33, 2012, 933–41. Wolf, D. and Goff, S. P. Embryonic stem cells use ZFP809 to silence retroviral DNAs. Nature. 458, 2009, 1201–1204.