Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистемНИР

Physical

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
7 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистем
Результаты этапа:
8 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистем
Результаты этапа: На основе представлений об автоволновой самоорганизации в активных средах разработаны новые обобщенные подходы к описанию механизмов формирования разномасштабных вихревых структур на термодинамически неравновесной границе океан-атмосфера. Предложена и исследована пространственно-временная модель природно-антропогенных экосистем, представленных в качестве иерархий активных сред с автоволновой самоорганизацией, учитывающая неоднородности антропогенных и природных взаимодействий. В качестве функции интенсивности активатора рассмотрены антропогенные процессы, а в качестве функции интенсивности ингибитора - природные процессы. Выявлено наличие резких внутренних переходных слоев в пространстве, то есть таких пространственных областей, в которых происходит резкое изменение функций интенсивности активатора и ингибитора. Эти области можно интерпретировать как окраины «спальных районов» в городах или граничные области между мегаполисами и соседними «городами-спутниками». Получены новые данные о влиянии способов введения препарата «Оксаком» (динитрозильных комплексов железа с глутатионом) на распределение этого препарата по органам и тканям и оказываемый гипотензивный эффект. Продолжена разработка методов энтропийного и фрактального анализа стохастических характеристик сложных динамических систем. Начата разработка модели динамики ансамбля ионных каналов в мембранах и коллективного поведения миксамеб на основе подвижных конечных автоматов. Методом «Тромбодинамика» подтверждена связь повышения свертывания крови в ходе индукции суперовуляции гонадотропинами и в 30% случаев обнаружена спонтанная гиперкоагуляция в день пункции яйцеклеток. Во всех случаях был проведен перенос эмбриона в крио-цикле. Показана низкая эффективность антикоагуляционной терапии, выполняемой только на основании результатов тромбоэластографии. На основе полученных данных предложена схема эффективного контроля антикоагуляционной терапии. Модификация криопротектора суспензией желтка куриного яйца в концентрациях 2,8 мг/мл и 5,6 мг/мл позволила увеличить долю жизнеспособных сперматозоидов на 20%. Морфологическая оценка клеток показала, что такая модификация криопротектора уменьшает все повреждения клеток при криоконсервации в среднем на 15%. Исследованы особенности холодовых приспособлений шестилучевых губок, получены новые данные о вертикальном распространении представителей этого таксона. Описан новый тип глубоководного рифа, построенного из шестилучевых губок Sarostegia oculata. Анализ 2Н-ЯМР-спектров от различных отделов тела крыс при естественном содержании дейтерия в организме и после двухнедельного употребления 1%-ого раствора D2O показал, что у тех крыс, которые пили тяжелую воду, дейтерий распределяется, в основном, в одинаковой концентрации в верхнегрудном, нижнегрудном и поясничном отделах крысы, то есть главным образом в области органов жизнеобеспечения, в отличие от крыс с естественным содержанием дейтерия, где в области нижнегрудного отдела наблюдался менее интенсивный 2Н-ЯМР-сигнал в области печени и селезенки. Впервые получены и исследованы ленгмюровские монослои, образованные рН-чувствительным амфифильным липидоподобным соединением транс-4,5-дидодецилоксикарбонил-2-морфолиноциклогексанолом. Обнаружен эффект рН-индуцированного изменения изотермы сжатия ленгмюровского монослоя транс-4,5-дидодецилоксикарбонил-2-морфолиноциклогексанола и структуры соответствующих пленок Ленгмюра-Блоджетт. Изучены особенности процессов формирования поликомплексов функциональными компонентами водной фазы (полиэлектролиты, в том числе ДНК, коллоидные безлигандные магнитные наночастицы магнетита, наночастицы золота) при их связывании с ленгмюровским монослоем транс-4,5-дидодецилоксикарбонил-2-морфолиноциклогексанола и фосфатидилхолина. Методом АСМ исследована структура полученных нанопленок Ленгмюра-Блоджетт.
9 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистем
Результаты этапа: Построены двумерная математическая и компьютерная модели динамики формирования урбоэкосистем и характеристик формирования переходного слоя между урбоэкосистемами в условиях образования автоволнового фронта. Начат анализ устойчивости моделей. Получены 2Н-ЯМР-спектры путем усреднения по трем животным как для процессов насыщения при употреблении 10%-ого раствора D2O, так и выведения дейтерия при употреблении вновь обычной воды. В результате анализа спектров удалось оценить кинетику дейтерия для каждого отдела (голова, грудь, таз) как в водной фазе, так и в биополимерах. Скорость обмена дейтерия в водной фазе головы выше таковой для груди и таза. Проведено сравнительное исследование биофизических показателей фотосинтетического аппарата хлоропластов Tradescantia fluminensis (тенелюбивый вид) Tradescantia sillamontana (световыносливый вид). Показано, что растения этих видов, выращенные при различной интенсивности света (сильный свет – 1000 мкЭ м-2 с-1 – и слабый свет – 100 мкЭ м-2 с-1), различаются по чувствительности к интенсивности действующего света. Растения, выращенные на сильном свету, приобретают способность индуцировать более сильное нефотохимическое тушение флуоресценции хлорофилла а по сравнению с растниями, выращенными на слабом свету. Показано, что это различие может иметь непосредственное отношение к защите растений от светового стресса и может быть обусловлено более интенсивной экспрессией регуляторного белка PsbS у растений, выращенных на сильном свету Проведено экспериментальное исследование методом TUNEL влияние различных температурных режимов, в том числе, криоконсервации на структуру организации ДНК гамет. Показано, что оптимальная температура для хранения образцов до 24 ч является +4 градуса (степень фрагментации ДНК 68%, в то время, как для температуры +23 градуса - 80,5%. Криоконсервация в присутствии криопротектора лучше сохраняет целостность ДНК клеток, однако в первые 4 часа хранения фрагментация ДНК в таких образцах увеличивается в 3 раза. С использованием моделей конечных автоматов проведено исследование процессов самоорганизации в популяции миксамеб на стадии агрегации. Показано, что существенную роль при этом играет кинетика процессов адгезии клеток. Показано, что стандартные подходы фрактального и энтропийного анализа стохастических характеристик сложных систем неэффективны из-за катастрофы размерности. Систематизировны сведения о распространении, распределении по глубине и по условиям обитания шестилучевых губок (Hexactinellida), отмечена связь с гидротермами, а также влияние шестилучевых губок на окружающую среду. Проанализирована связь строения скелета этих организмов с условиями обитания. Собраны сведения оформировании рельефа дна с участем шестилучевых губок: спикульных матах, мелководных гексактинеллидных рифах. Выполнен обзор работ по культивации шестилучевых губок в условиях низких температур и их биосилификации в этих условиях. Получены профили распределения дейтерия по глубине в воде озера Трехцветное ( вблизи Ругозерской губы, Кандалакшский р-он, Мурманская обл.). Зарегистрировано монотонное уменьшение содержания дейтерия с глубиной и значительная вариация изотопного состава в тонком слое (1,5–2 м) существования окрашенных микроорганизмов. Обнаруженная зависимость качественно сохраняется в пробах, отобранных в марте и августе. Показано защитное действие полифенольных соединений (кверцетина, кофейной кислоты и куркумина) на процесс свободно-радикального окисления мембран клеток сердечной мышцы. Проведено сравнительное исследование системы гемостаза при индукции суперовуляции. Методом Тромбодинамика зарегистирована гиперкоагуляция у 70% пациенток на фоне гормонотерапии в цикле ЭКО (с максимумом в момент пункции фолликулов); наличие гиперкоагуляции в начале цикла ЭКО достоверно и резко уменьшает вероятность наступления беременности (p<0,05).
10 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистем
Результаты этапа: Созданы двумерная пространственно-временная математическая и компьютерная модели городов с населением до 50 тыс. (урбоэкосистем) как иерархий сопряженных активных сред и условий формирования переходного слоя между ними. Проведен математический анализ динамики развития городов Подмосковья (урбоэкосистем ) с учетом воздействия антропогенных и природных факторов. Проведено исследование обратимого дейтерирования здоровых мышей и мышей с привитыми опухолями при употреблении 10%-ого раствора D2O. Оценена скорость прямого и обратного дейтерообмена в различных тканях мышей и зарегистрирована значительная задержка дейтерирования биополимеров. Усовершенствована методика измерения содержания дейтерия в природных водах методом ЯМР с использованием сдвигающего реагента трифторметансульфоната европия. Зарегистрированы профили вертикального распределения дейтерия в образцах воды озер Трехцветное и Кисло-сладкое (Кандалакшский р-он, Мурманская обл.), полученных в апреле 2017 г. Продолжено сравнительное исследование физико-химических механизмов акклимации фотосинтетического аппарата листьев высших растений к изменяющимся условиям освещения на примере растений Tradescantia fluminensis (тенелюбивый вид) Tradescantia sillamontana (световыносливый вид). Проведены измерения биофизических показателей листьев растений (спектры ЭПР и флуоресценции хлорофилла а), выращенных при различной интенсивности света (сильный свет – 1000 мкЭ м-2 с-1, и слабый свет – 100 мкЭ м-2 с-1), различаются по чувствительности к интенсивности действующего света. Показано, что световыносливый вид Tradescantia sillamontana сохраняет флуоресцентные показатели фотосинтетической активности (отношение Fv/Fm и коэффициент нефотохимического тушения NPQ) при варьировании интенсивности света в широких пределах. У тенелюбивого вида Tradescantia fluminensis те же показатели оказывается весьма чувствительными к флуктуациям интенсивности света. При увеличении интенсивностях света фотосинтетический показатель Fv/Fm у листьев Tradescantia fluminensis значительно уменьшаются, что свидетельствует о деструктивных нарушениях их фотосинтетического аппарата (световой стресс). С другой стороны, в условиях светового стресса у растений обеих видов усиливается генерация нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла а, что свидетельствует об усилении защитных механизмов от светового стресса. С помощью компьютерного моделирования исследованы режимы адгезии сферической деформируемой клетки (лимфоцита диаметром 12 микрон) к микро0рельефной поверхности. Показано, что в зависимости от геометрии микрорельефа могут реализовываться 3 различных режима адгезии: 1). слабая адгезия без деформации мембраны, 2). сильная адгезия с деформацией мембраны клетки, 3). сильная адгезия с разрушением мембраны клетки. На основе численных данных сформулированы рекомендации по созданию искусственных антибактериальных покрытий. Изучено взаимодействие ряда природных флавоноидов и других полифенольных соединений с митохондриями, выделенными из сердец крыс. Показано, что изученные полифенолы с различной химической структурой эффективно перехватывают супероксидные анион-радикалы, проявляя антиоксидантный эффект в физиологически значимом интервале температур при разных парциальных давлениях кислорода, включая условия глубокой гипоксии, характерные для случая обострения ишемической болезни сердечной мышцы. Показано, что модификация криопротектанта фосфатидилхолином из сои в концентрации 1,5 мг/мл существенно улучшает сохранность клеток при криоконсервации, но уступает в эффективности криопротектанту с добавленной эмульсией яичного желтка. При использовании последнего доля клеток с нормальными формами подвижности выше, чем в коммерчески доступных зарубежных препаратах. Статистический анализ клинических данных показал, что достоверных различий между долями выживших донорских клеток пациентов после использования методов криоконсервации с добавлением трегалозы или сахарозы нет, однако оплодотворяющая способность донорских ооцитов выше после криоконсервации в присутствии трегалозы. Разработан протокол для криоконсервации до 10мкл суспензий клеток в криосоломинах. Показана цитотоксичность криопротектора Quinns Advantage™ Sperm Freezing Medium и разработан новый протокол подготовки к культивации образцов после разморозки, позволяющий снизить его цитотоксический эффект в два раза. Проведено сравнение питания, размерной структуры и поведения некоторых видов, обитающих как в море, так и в отделяющихся от него (меромиктических) водоемах. Найдено различие в размерном составе Рeringia ulvae (Gastropoda), оценены изменения смешанного сообщества вниз по течению ручья в зависимости от уровня приливов, проведено исследование питания обычной для литорали и для отделяющихся озер трехиглой и девятииглой колюшки, показано большее разнообразие питания в озерах.
11 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистем
Результаты этапа: Выполнено дальнейшее теоретическое обоснование новой биофизической теории о чередовании знака хиральности в иерархически стратифицированных молекулярно-биологических системах белков и нуклеиновых кислот. Создан банк данных по формированию иерархических хиральных структур биомиметиками. По результатам анализа банков данных и литературных источников получены данные о связи функций белковых молекул и особенностями внутримолекулярных хиральных структур в белках. Проведено теоретическое описание и получены термодинамические критерии образования внутримолекулярных знакопеременных хиральных иерархий в белках. Развиты новые представления о роли хиральности в процессах фолдинга и в работе молекулярных биологических машин. Создан и протестирован программный пакет для моделирования адгезии тромбоцитов к месту повреждения кровеносного сосуда (ранение). Многомасштабная трехмерная компьютерная модель явно описывает динамику клеток – тромбоцитов и эритроцитов, - а также явно учитывает возникновение адгезионных связей между мембраной тромбоцита и ранением. Впервые в модели явно учитывается изменение конформации фактора фон Виллебранда под действием гидродинамических сил. Параметры модели подобраны из сравнения результатов расчетов с имеющимися в литературе экспериментальными данными по изменению жесткости и среднего времени жизни адгезионных связей. Найдены значения оптимальной длины мультимеров фактора фон Виллебранда. Эти значения качественно согласуются с экспериментальными (клиническими) данными о распределении длин фактора фон Виллебранда в плазме крови в норме. Компьютерное моделирование показало, что сплющенная (эллипсоидальная) форма тромбоцита также дает преимущества при адгезии к месту повреждения по сравнению со сферической формой. Описана внутриклеточная сигнализация при активации тромбоцита через рецепторы PAR1 и PAR4, приводящая к развитию стохастических спайков концентрации кальция в цитоплазме тромбоцита. Теоретически показано, что интенсивность активации тромбоцита тромбином кодируется частотой осцилляций концентрации ионов кальция в цитозоле тромбоцита, при этом существует как минимум две белковые системы, способные интегрировать сигнал кальция – это система белков UNI/NCLX и система белков CDG-1/RASA-3. Экспериментально подтверждено как кодирование концентрации активатора частотой осцилляций, так и достоверное декодирование сигнала белковыми системами UNI/NCLX и CDG-1/RASA-3. Описана внутриклеточная сигнализация при активации тромбоцита через рецепторы PAR1 и PAR4, приводящая к развитию стохастических спайков концентрации кальция в цитоплазме тромбоцита. Теоретически показано, что интенсивность активации тромбоцита тромбином кодируется частотой осцилляций концентрации ионов кальция в цитозоле тромбоцита, при этом существует как минимум две белковые системы, способные интегрировать сигнал кальция – это система белков UNI/NCLX и система белков CDG-1/RASA-3. Экспериментально подтверждено как кодирование концентрации активатора частотой осцилляций, так и достоверное декодирование сигнала белковыми системами UNI/NCLX и CDG-1/RASA-3. Разработан новый метод количественной оценки хиральности уровней в иерархиях белковых структур. Получены карты хиральности для вторичной и третичной структур белков. Достоверность карт подтверждается анализом реальных структур. Разработаны подходы к построению непрерывной меры симметрии и сходства биомолекул. Показано, что псевдоскалярная мера хиральности, построенная на основе тензора поляризуемости, непригодна для количественной оценки хиральности даже небольших белков из-за чувствительной зависимости от координат атомов. Измерены диэлектрические характеристики последовательных сотенных разведений диклофенака в диапазоне 20 Гц – 10 МГц с помощью прецизионного анализатора импеданса WK 65120 BD1. Обнаружено резкое увеличение проводимости и диэлектрической проницаемости на низких частотах в образце с концентрацией 3,7 10-17 М. Повторное измерение этих же растворов после двух месяцев хранения показало высокую корреляцию между «старыми» и «новыми» измерениями при значительном увеличении проводимости образцов со временем. При этом диэлектрическая проницаемость на высоких частотах меняется незначительно. Отсутствие релаксационных процессов и инкремента диэлектрической проницаемости на высоких частотах свидетельствует об отсутствии сегнетоэлектрических свойств у возможных мезоструктур в разбавленных растворах диклофенака. Для экспериментального анализа динамики тромбообразования при сужении просвета сосуда был разработан новый подход, основанный на применении микрофлюидных технологий. В экспериментах использовались рельефы специальной геометрии – с сильным сужением, которое имитирует стеноз сосуда. При помощи этой технологии было продемонстрировано формирование окклюзивного (то есть приводящего к остановке потока крови) тромба при прокачивании цельной крови здоровых доноров через проточную систему. В таких экспериментах тромбы формируются на вертикальных стенках силиконовой камеры, значительно упрощая исследование их структуры и динамики при помощи флуоресцентной микроскопии. Разработаны методы синтеза и синтезированы новые гидрофобизованные наночастицы магнетита и золота диаметром 2-5 нм на основе комплексов со стеариновой кислотой и октадецилтиолом, способные растворяться в неполярных растворах липидов в хлороформе. Наночастицы охарактеризованы методами просвечивающей электронной микроскопии, ИК-спектроскопии, электронографии. Экспериментально измерены зависимости параметров динамической нестабильности микротрубочек и ее взаимодействия с белком EB1 в присутствии различных концентраций фосфата в растворе. Построена теоретическая модель взаимодействия микротрубочек и фосфата с учетом промежуточной стадии «ГДФ-фосфат» в цикле гидролиза ГТФ в кармане тубулина. Экспериментально и теоретически исследованы особенности релаксации тубулиновых протофиламентов при быстром замораживании в процессе подготовки криоэлектронных образцов. Показано, что при высокой скорости заморозки и относительно небольшой жесткости протофиламентов, возможно возникновение градиента кривизны при замораживании, что требует введения поправки в измеренные коэффициенты изгибной жесткости ГТФ- и ГДФ-тубулиновых протофиламентов на концах микротрубочек. Получены новые данные о механизмах антиоксидантного действия коэнзима Q (водорастворимой формы убихинола-10), динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) и фенольных соединений (куркумина и др.), хелатирующих ионы железа. Изучены влияние ферритина на образование супероксида в митохондриях сердечной мышцы и роль ферритина в образовании физиологически значимых метаболитов оксида азота.
12 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистем
Результаты этапа: Проведен анализ хиральных соответствий в системе «лекарство– макромолекула-мишень». Обработаны сборы стеклянных губок (класс Hexactinellida) из Пертского каньона в восточной части Индийского океана. Описаны новые таксоны, в частности, 11 новых для этого региона видов, пять из которых являются новыми для науки. Кроме того, было найдено два новых вида для Австралии, Pheronema raphanus и Monorhaphis chuni, и один -- для Индийского океана, Walteria flemmingi. Второй вид рода Calyptorete описан через 90 лет после первого описания рода. Была отмечена значительная разница между состоянием губок, собранных на судне. «Фалькор», где использовался необитаемый подводный аппарат, и во время более ранней экспедиции на судне «South surveyor», которая использовала драги и тралы. Собранные подводным необитаемым аппаратом образцы были в отличном состоянии, в то время как из драг и тралов они были, как правило, поврежденными или фрагментированными. Ответом организма на патологический стресс, нарушение равновесия между прооксидантными и антиоксидантными процессами в клетках и гомеостаза железа может быть образование в клетках сердечно-сосудистой системы активных форм кислорода и физиологически значимых метаболитов оксида азота (NO), таких как динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с разными лигандами. Изучено формирование и стабильность ДНКЖ, содержащих амфифильные лиганды − N-ацетил-L-цистеин. Такие ДНКЖ способны проникать через кожный покров и накапливаться в различных тканях организма экспериментальных животных, в частности, в лёгких и печени. Несмотря на существенное увеличение общего уровня NO в ткани лёгких и печени в результате чрезкожного введения ДНКЖ-Ацц, в крови не удалось регистрировать связанных с белками ДНКЖ, а также комплексов NO с гемоглобином. Проведены эксперименты по активации окислительного стресса в сперматозоидах перекисью водорода с целью изучения окислительных процессов в гаметах. Показано, что добавление мелатонина в культуральную среду повышает долю жизнеспособных клеток при активации окислительного стресса на 15%, что позволяет рекомендовать его для дальнейшего исследования в качестве потенциального антиоксиданта. Проведены контрольные эксперименты по добавлению холестерина в культуральную среду для гамет. Показано, что растворы холестерина в декане и до-декане крайне токсичны для клеток, доля выживших клеток в растворе холестерина в н-октане составила 63%. Добавление комплексов циклодекстрин-холестерин и липосом показало полное отсутствие их токсичности для клеток (доля выживших клеток составила 96% что полностью совпало с контрольным образцом). Проведено исследование механизмов акклимации фотосинтетического аппарата листьев традесканции к изменяющимся условиям освещения растений. Методом электронного парамагнитного резонанса показаны различия в кинетике фотосинтетического транспорта электронов, также выявлены различия флуоресцентных показателей, определяющих кинетику быстрой и медленной индукции флуоресценции хлорофилла а в листьях двух контрастных видов растений одного рода Tradescantia (T. fluminensis – тенелюбивый вид, T. sillamontana – светолюбивый вид). Показано, что перемещение хлоропластов внутри клеток растений в ответ на действие интенсивного актиничного света, наряду с нефотохимическим тушением возбуждения хлорофилла, является одним из ключевых факторов защиты растений от светового стресса. Показано, что полисахариды из природных источников могут оказывать благотворное действие на процессы ранозаживления, например, экстрагированные полисахариды из Radix Hedysari могут запускать процессы регенерации в периферических нейронах крыс, полисахариды, выделенные из фруктов, оказывают гастропротективное и ранозаживляющее действие, а полисахариды из Helianthus tuberosus L. – колониестимулирующее, радиопротекторное и иммуномодулирующее действие. Выделены фракции олигосахаридов из коркового слоя Helianthus tuberosus L. с использованием тангенциального фильтрования, гельпроникающей хроматографии и диализных систем. Показано, что эти фракции существенно ускоряют прорастание семян различных растений, рост корней и формирование лиственной системы. Предложена математическая модель агрегации миксамеб Dictyostelium discoideum, построенная на основе уравнений динамики и описывающая начальные стадии агрегации миксамеб. Методом ЯМР в воде озера Могильное (о. Кильдин Мурманской обл.) обнаружен локальный минимум концентрации дейтерия на глубине около 8,5 м в отличие от озера Трехцветное, где изотопная аномалия наблюдается на глубине около 2 м в области хемоклина. Разработана двумерная пространственно-временная компьютерная модель с антропогенными и природными барьерами и создан адекватный прогноз развития динамики развития Шанхая до 2030 г.
13 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистем
Результаты этапа: Выявлены закономерности механизмов самоорганизации в процессе видообразования. Создана биофизическая модель эволюции биосферы как иерархии сопряженных активных сред в процессе видообразования. Выявлены закономерности самоорганизации в процессе фиксации мутаций на популяционном уровне. Построены математические модели отбора и фиксации мутаций при условии сопряжения детерминированных и случайных факторов в пространстве перколяционной решетки отбора. Проведена сортировка и предварительная разборка представителей шестилучевых губок из материалов, собранных в районе Императорского хребта (северная часть Тихого океана) в рейсе ИО РАН 2019 года с помощью необитаемого подводного аппарата. Собранный материал позволил уточнить сведения о морфологии собранных представителей Hexactinellida, переописать род, известный ранее только по фрагментам. Измерены характерные времена разворачивания домена А2 фактора фон Виллебранда в зависимости от внешней силы при деформации растяжения. Уточнены потенциалы взаимодействия и коэффициенты гидродинамической подвижности для каждого блока исследуемого биополимера. Изучены особенности динамики домена A2 фактора фон Виллебранда в сдвиговом потоке вязкой жидкости в зависимости от скорости сдвига. Измерено характерное время анфолдинга домена А2 фактора фон Виллебранда в зависимости от скорости сдвига в жидкости. Показано, что высокоочищенные полисахариды растительного происхождения с большой молекулярной массой обладают набором биологических активностей, в том числе противовирусной и противовоспалительной. В частности, полисахариды из картофеля и топинамбура оказывают влияние на течение COVID-19, облегчая течение заболевания и сокращая сроки выздоровления. Изучено взаимодействие активных форм кислорода, оксида азота и динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) в клетках сердечной мышцы в условиях воздействия природных и экзогенных антиоксидантов. Показано, что в основе антирадикального действия ДНКЖ с тиольными лигандами лежит кооперативное действие их компонентов, т.е. оксида азота, тиолов и ионов железа. В рамках этапа 2020 года изучены физико-химические характеристики и стабильности природных форм депонирования оксида азота с лигандами с разной липофильностью. Проведен анализ действия этих соединений как доноров NO, источников двухвалентного железа и антиоксидантов в организме. Методом адиабатической калориметрии получены термодинамические характеристики водного раствора глицерина с сахарозой 0,5М, водного раствора глицерина с сахарозой 0,5М и альбумином 3,9 мг/мл; определены температуры фазового перехода и изменений агрегатных состояний изучаемых растворов. Было отмечено, что при добавлении человеческого белка альбумина и сахарозы температурный промежуток между температурой плавления (фазового перехода первого рода) и температурой стеклования сужается, то есть гетерогенная фаза (от 177,7 К до 236,9 К) уменьшается, что может способствовать повышению выживаемости клеток. Также видно, что изменения энтальпии и энтропии, при добавлении отдельных компонент в изучаемую среду, увеличиваются. Это может свидетельствовать о том, что при замерзании такие растворы формируют не крупные кристаллы малой численностью, а много мелких кристаллов. Данные факты требуют дальнейшего изучения другими физическими методами. Разработана методика получения сперматозоидов из семенников мыши; проведены контрольные измерения осцилляции кальция в них. Экспериментально показано, что мышиные сперматозоиды активируются прогестероном в концентрации 50 μM с характерным временем активации и ответа 80 секунд. Показано, что при активации BSA и HCO3– сперматозоиды отвечают либо одиночным пиком с задержкой в ~500c и шириной ~90 с, либо кальциевыми осцилляциями. Построенная трехмерная модель для описания кальциевой сигнализации в сперматозоидах мыши способна предсказать ширину пика и частоту осцилляций при коэффициенте диффузии кальция, меньшем 100 μm2/s. Ширина одиночного пика, описываемая трехмерной моделью, составила 110 с, что согласуется с экспериментальными данными. Методом Vital screen была проведена оценка целостности мембраны сперматозоидов при заморозке (более 50 образцов). Показано, что при хранении культуры клеток более 1 года сохраняется только 65% сперматозоидов с положительными типами подвижности, а доля неподвижных клеток увеличивается на 20%. Определены основные виды морфологических дефектов, возникающих в клетках при длительном хранении (дефекты в области шеи - 30% и хвостового отдела - 60% от всех дефектов). Предложены 3 метода для определения концентрации холестерина в мембране сперматозоидов: ферментативный метод; метод инфракрасной спектроскопии и метод Абеля-Кендалла. Все методы были отработаны на клетках, лучший результат показал метод Абеля-Кендалла, однако из-за его высокой токсичности к дальнейшей работе был выбран ферментативный метод. Были сформированы комплексы β-метил-циклодекстрины - холестерин, которые были проверены на цитотоксичность и предложены для доставки холестерина в мембрану клеток. Создана автоволновая математическая модель усложнения генома в процессе биологической эволюции основных таксономических групп организмов (прокариот, одноклеточных и многоклеточных эукариот) с позиций теорий самоорганизованной критичности и активной среды. На основе теории подвижных клеточных автоматов построена модель агрегации миксамёб в популяции Dictyostelium discoideum, позволяющая описать все её стадии вплоть до образования макроскопического слизня. Показано, что в этой модели стадии формирования слизня предшествует стадия формирования кластеров клеток, которые затем сливаются, образуя слизень. Проведен литературный анализ физико-химических характеристик и биоразнообразия соленых озер Хакасии и меромиктических озер Заполярья, являющихся естественными эволюционными лабораториями и могущих служить моделью развития экосистемы Черного моря.
14 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистем
Результаты этапа: Создана математическая модель отбора и фиксации мутаций при условии сопряжения детерминированных и случайных факторов в пространстве перколяционной решетки отбора для полового и бесполого размножения. Исследована кинетика медленной индукции флуоресценции в листьях контрастных видов растений рода Tradescantia (T. sillamotana и T.fluminensis), выращенных при высокой (1000 мкЭ/м2с1) и низкой (50-100 мкЭ/м2с1) интенсивностях света освещения. На основании этих исследований выявлены факторы, определяющие эффективность акклимации растений к условиям их произрастания при высокой и низкой интенсивностях света. С помощью созданных за отчетный период компьютерных моделей рассчитаны траектории движения тромбоцитов вблизи стенки микрососуда в потоке цельной крови в различных гидродинамических условиях. Численно охарактеризована динамика адгезии тромбоцитов к иммобилизированному фактору Виллебранда в микрососуде при различных числах Рейнольдса. Рассчитаны силы адгезии и механические напряжения, действующие на тромбоцит со стороны эритроцитов, плазмы крови и фактора Виллебранда. На основе теории клеточных автоматов получены оценки параметров модели, определяющих сигнализацию в популяции Dictyostelium discoideum при агрегации до стадии холмоподобной структуры, которые соответствуют реальному времени формирования и размерам слизня. Методом рентгеноструктурного анализа исследовано влияние глицерина, сахарозы и альбумина на формирование кристаллов в водном растворе объемом 10 мкл при витрификации. Показано, что дифракционная картина для водного раствора глицерина (50%) соответствует стеклоподобному состоянию. Разработан новый метод анализа дифракционных картин для криопротекторных сред, позволяющий численно оценивать размеры кристаллов, формирующихся в растворах. Показано, что добавление сахарозы (0,5 М) уменьшает размеры кристаллов, образующихся при заморозке водно-глицеринового раствора (12%), что согласуется с результатами, полученными ранее методом адиабатической калориметрии. Добавление в криопротекторную среду альбумина в концентрации 4 мг/мл не оказывает значимого влияния на размеры кристаллов. Методом рентгеноструктурного анализа впервые оценены размеры кристаллов для всех исследуемых растворов при замораживании в больших объемах (1,7 мл) методом медленной заморозки. Показано, что средний размер кристаллов в растворе со всеми компонентами составляет 8±1 мкм, как и в коммерческой криопротекторной среде SpermFreeze. Обнаружено неравномерное распределение кристаллов внутри одной пробирки при вертикальном ее размещении. Разброс размера кристаллов может составлять более 10 мкм в верхней и нижней частях пробирки. Разработан горизонтальный метод размещения криопробирок в Дьюаре, эффективность которого требует дальнейшего исследования. Работа проводилась в сотрудничестве с Международным Центром DESY на PetraIII синхротроне. Было проведено 4 эксперимента, длительностью от 12 до 36 ч непрерывных измерений. Разработана методика экзогенной индукции окислительного стресса сперматозоидов. Эндогенный окислительный стресс формировался путем инкубации очищенных клеток в течение 14 суток. Показано, что мелатонин в концентрации 0,5 мМ не цитотоксичен, является эффективным антиоксидантом, повышает долю жизнеспособных клеток на 20 %. Показано, что добавление глутатиона значимо не увеличивает долю жизнеспособных клеток. Показано, что при длительной инкубации в отсутствии мелатонина на 6-й день в контрольном образце остается только 50% жизнеспособных клеток, в то время, как в образцах с мелатонином 90%. Исследование степени фрагментации ДНК сперматозоидов методом TUNEL через 48 ч показало, что в клетках, инкубированных без антиоксидантов, количество фрагментированных сперматозоидов увеличилась в среднем на 6%; добавление мелатонина замедляло развитие выработки АФК и соответственно фрагментацию ДНК в 2 раза (рост фрагментированных сперматозоидов около 3%). Разработан протокол модификации базовой криопротекторной среды полисахаридами следующих молекулярных масс: 1–5кДА, 70 кДА, 1,2 МДа. Обнаружено, что полисахариды с молекулярной массой 1–5 кДа снижают индекс подвижности сперматозоидов и проявляют цитотоксичность, поэтому их нельзя использовать для криоконсервации. Однако полисахарид молекулярной массой 1,2 МДа не влияет на жизнеспособность сперматозоидов; его добавление в криопротекторную среду снимает эффект криотолерантности и в среднем повышает выживаемость клеток. Холестерин в комплексе с циклодекстринами не проявляет цитотоксичности, при этом концентрация холестерина в мембране клеток может увеличиваться в несколько раз. Показано, что расстояние Фреше малочувствительно к изменениям характеристик собственных шумов бислойных липидных мембран, модифицированных ионными каналами, поэтому его использование для анализа состояния таких систем представляется нецелесообразным. Проведен литературный анализ методов и возможностей оптического зондирования для обнаружения массивов водных микроорганизмов. Сконструирован оптический зонд для спектральных измерений на глубине до 10 м. Описан новый вид рода Docosaccus (Euplectellidae – Euplectellinae) из абиссали Берингова моря – единственный представитель этого подсемейства в Беринговом море. Переописан род монотипический род Ijimaiella, известный ранее только по фрагментам. Подтверждена его принадлежность к подсемейству Corbitellinae.
15 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистем
Результаты этапа: Исследована кинетика медленной индукции флуоресценции в листьях контрастных видов растений рода Tradescantia (T. sillamotana и T.fluminensis), выращенных при высокой (1 мЭм–2с–1) и низкой (50–100 мкЭм–2с–1) интенсивностях света освещения. На основании этих исследований выявлены факторы, определяющие эффективность акклимации растений к условиям их произрастания при высокой и низкой интенсивностях света. За отчетный период усовершенствована континуальная математическая модель тромбоза в аневризмах и застойных зонах. Модель учитывает гидродинамические и реологические особенности цельной крови, транспорт эритроцитов и тромбоцитов, многостадийность активации тромбоцитов, а также биохимические каскады реакций свертывания плазмы крови. Получены численные результаты, выявлена взаимосвязь между размером тромба, гемодинамическими характеристиками и геометрией аневризмы. Предложена модель активации тромбоцитов при агрегации на основе теории клеточных автоматов. Предварительные результаты показывают, что на агрегацию и активацию тромбоцитов, помимо биохимических факторов, оказывают влияние гидродинамические и реологические характеристики потока крови. В отчетном периоде с помощью крупно-зернистой модели фактора Виллебранда проведено исследование молекулярных механизмов активации белков плазмы крови при внешних механических и гидродинамических воздействиях. Модель продемонстрировала конкуренцию между процессами активации домена А1 и анфолдинга домена A2 механическими силами, действующими на прикрепленный к стенке линейный мультимер фактора Виллебранда в сдвиговом потоке вязкой жидкости. Выполнены измерения спектров пропускания света на разных горизонтах в четырех отделяющихся водоемах, на двух участках морской акватории без стратификации и в двух пресных озерах с помощью спектрометра «Ocean Optics USB 4000» с погружаемым волоконно-оптическим зондом. Согласно полученным данным определяющую роль в формировании световых ниш с разными спектральными диапазонами играют растворенные в воде гуминовые вещества. Их концентрация возрастает по мере усиления изоляции водоема от моря, из-за чего фотическая зона сужается, хемоклин оказывается все ближе к поверхности. Обнаружен закономерный сдвиг спектрального состава проходящего света в более длинноволновую сторону. В морской стратифицированной бухте до хемоклина доходит в основном, желто- зеленая часть спектра (520–600 нм), в морских лагунах преобладает желтая (510–670 нм), в водоемах с пресным поверхностным слоем воды – желто-оранжево-красная (520–720 нм). В связи с пандемией COVID-19 более подробно рассмотрены особенности возбудителя этого заболевания – вируса SARS-CoV-2, его взаимодействий с клеточными рецепторами, молекулярные механизмы последствий заболевания и возможного лекарственного действия полисахаридов при этом заболевании. Природные полисахариды в перспективе могут оказаться эффективными средствами терапии при различных вирусных заболеваниях, возможно, более эффективными и не имеющими побочных эффектов по сравнению с традиционными противовирусными препаратами. Рассмотрен ряд механизмов, связывающих повреждающие факторы COVID-19 с ацидозом, показано существование положительных обратных связей между развитием гипоксии и ацидоза. На ранних этапах болезни воспаление, затруднение газообмена, тромбоз и другие поражения организма приближают возникновение ацидоза. В соответствии с эффектом Вериго-Бора снижение pH крови приводит к падению сатурации, что способствует дальнейшему развитию ацидоза и приводит к ухудшению состояния пациента. Снижение pH может также вызывать конформационные изменения в S-белке вируса и вести к снижению аффинности и авидности антител. Показана возможность заражения иммунных клеток вирусом SARS-CoV-2. Проведены обработка и анализ экспериментальных данных, полученных ранее в сотрудничестве с Международным Центром DESY на синхротроне PetraIII. Разработан и напечатан на 3D-принтере автоматизированный держатель для пробирок (лифт), позволяющий опускать их в сосуд Дьюара для криоконсервации клеток по заданному алгоритму с выбранным скоростным режимом. В ходе работы было исследовано более 400 растворов и более 30 видов альтернативных заморозок. По результатам замораживания криопротекторных сред были выбраны два основных метода заморозки как наиболее эффективные: классическая трехуровневая заморозка, а также равномерное автоматическое опускание образца в азот в течение 40 мин. со скоростью вращения барабана 1 оборот/мин. Показано, что средние размеры кристаллов льда, образующихся в криопротекторных средах при автоматической заморозке, схожи с размерами кристаллов при классической трехуровневой заморозке (6±1 мкм). Это говорит о том, что разработанный метод с постоянной скоростью опускания может быть рассмотрен в качестве альтернативы используемого метода, так как он позволит снизить нагрузку на персонал лаборатории и исключить влияние человеческого фактора на процесс заморозки. Показано, что в водных растворах сахарозы разной концентрации (0,04 М и 0,5 М) без дополнительных компонент происходит образование крупных кристаллов льда (32±2 мкм) и (20±2 мкм) соответственно, как при горизонтальной, так и при вертикальной заморозке, а добавление глицерина (12%) уменьшает размер кристаллов до 9±1 мкм. Проведены предварительные эксперименты по криоконсервации культур клеток двумя выбранными методами заморозки. В настоящее время статистически значимого различия не обнаружено, однако сильный разброс данных указывает на большое различие клеток (индивидуальные особенности доноров) и недостаточно большой выборки. Проведено сравнение 4-х экспериментальных методов определения концентрации холестерина в мембранах сперматозоидов: ферментативный метод, модифицированный метод Абеля-Кендалла, инфракрасная спектроскопия и ВЭЖХ. Методами ферментативного анализа, ИК-спектроскопии, Абеля-Кендалла и ВЭЖХ определена концентрация холестерина в сперматозоидах человека, которая составила 1,2±0,3 нмоль/млн клеток, что соответствует литературным данным. В качестве рутинного метода определения концентрации холестерина рекомендуется метод ферментативного анализа. Для работы с методом ферментативного анализа, который обычно применяют для определения холестерина в плазме крови, был разработан протокол, позволяющий определить концентрацию холестерина в мембранах сперматозоидов. Данный метод характеризуется тем, что холестерин определяется косвенно по содержанию пероксида водорода, который с аналитической точки зрения является более простым соединением, чем холестерин. Также, преимуществом данного метода является то, что он не требует применения агрессивных реагентов, что позволяет использовать его непосредственно в местах работы с культурами клеток. Показано, что концентрация холестерина в мембране сперматозоидов пациентов, с диагнозом олигоастенозооспермия превышает нормальные показатели в 3–5 раз и составляет 5,5±1,9 нмоль/млн клеток, что может являться причиной нарушения фертильности и приводить к снижению криотолерантности. Влияние повышенного содержания холестерина в мембранах клеток на степень криотолерантности требует дальнейшего исследования. Разработан протокол экспериментов исследования влияния концентрации бикарбонатов на активацию сперматозоидов и кальциевую регуляцию. В дальнейшем планируется проведение серии соответствующих экспериментов. Исследовано влияние высокомолекулярных полисахаридов (ПС) на результаты криоконсервации клеток. Показано, что добавление ПС с молекулярной массой 1–1,5 МДа к культуре клеток не оказывает цитотоксического действия. Методом рентгеноструктурного анализа показано, что в присутствии ПС молекулярной массой порядка 70 кДа в растворе при замораживании формируются крупные кристаллы среднего размера 46±5 мкм, в то время как в присутствии ПС с молекулярной массой 1,2 МДа размер кристаллов составляет 8±1 мкм. В ходе исследования окислительного стресса в сперматозоидах в присутствии различных антиоксидантов показано, что добавление мелатонина значимо уменьшает степень фрагментации ДНК (методом TUNEL) при индукции окислительного стресса (инкубация клеток при температуре Т = 38 °С в течение 60 мин. в присутствии пероксида водорода в концентрации С = 0,5 мкМ), в среднем в 1,3 раза. Обработаны коллекции шестилучевых губок, собранных с помощью необитаемого подводного аппарата в районе Императорского хребта (северная Центральная часть Тихого океана) в ходе экспедиций ИО РАН в 2019 и 2018 гг. на кораблях «Академик Мстислав Келдыш» и «Академик М.А. Лаврентьев». Проведено описание представителей рода Ijimaiella (Porifera; Hexactinellida; Euplectellidae) из района вулкана Пипа (Берингово море). Описание представителей рода Docossacus семейства Euplactellidae из Берингова моря. Обнаружены целые экземпляры губки Ijimaiella, описанной ранее по фрагментам. Уточнен диагноз рода и подтверждена принадлежность к подсемейству Corbitellinae семейства Euplectellidae. Описан новый вид шестилучевых губок семейства Euplectellidae из Берингова моря с телом в виде стакана и добавочных микросклер с сигмоидными и онизоидными вторичными лучами. Пересмотрен родовой диагноз рода Docossacus.
16 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистем
Результаты этапа: В соответствии с планом исследований, на основании собственных и литературных данных проведено исследование механизмов и основ биологической активности природных полисахаридов в различных моделях. Рассмотрены особенности вируса SARS-CoV-2, его взаимодействий с клеточными рецепторами, молекулярные механизмы последствий заболевания и возможного лекарственного действия полисахаридов при этом заболевании. Показано, что природные полисахариды могут оказаться эффективными средствами терапии при различных вирусных заболеваниях, не имеющими побочных эффектов по сравнению с традиционными препаратами. Показана возможность заражения иммунных клеток вирусом SARS-CoV-2. По результатам этой части работы опубликованы две статьи в журналах из ядра РИНЦ. Природные полисахариды в перспективе могут оказаться эффективными средствами терапии при различных вирусных заболеваниях, возможно, более эффективными и не имеющими побочных эффектов по сравнению с традиционными противовирусными препаратами. Полисахарид STP был выделен из водного экстракта Solanum tuberosum L. и очищен с помощью ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Его молекулярную массу определяли с помощью гельпроникающей хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии, а его моносахаридный состав анализировали методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора и капиллярной колонки. Было показано, что полисахарид STP состоял из галактозы, арабинозы, уроновых кислот, глюкозы и белков. Молекулярная масса STP составляла 70 кДа, митогенная активность экстрагированного полисахарида сравнима с активностью липополисахарида. Для анализа данных использовался новый подход – анализ временных рядов, апробированный при анализе собственной проводимости липидных мембран. Измерены спектры пропускания солнечного света на разной глубине в четырех меромиктических озерах и на двух участках морской акватории без стратификации с помощью спектрометра «Ocean Optics USB 4000» с погружаемым волоконно-оптическим зондом. Определяющую роль в поглощении коротковолнового светового диапазона играют растворенные в воде гуминовые вещества. Их концентрация возрастает по мере усиления изоляции водоема от моря, фотическая зона сужается, а хемоклин оказывается все ближе к поверхности. Параллельно был исследован состав микроорганизмов, обитающих на соответствующих глубинах. Спектральный диапазон может служить селективным фактором, под давлением которого, в хемоклине формируются сообщества фототрофов со структурно различными антеннами, но схожими спектрами поглощения света. Проведено сравнительного исследования фотосинтетических показателей листьев (индукция флуоресценции хлорофилла и кинетики редокс-превращений реакционного центра Р700) фотосинтетического аппарата двух контрастных видов рода традесканции: Tradescantia sillamontana (световыносливый вид) и Tradescantia fluminensis (тенелюбивый вид), в зависимости от условий акклимации растений (в течение несколько месяцев) к свету высокой и низкой интенсивности и выяснены механизмы адаптации фотосинтетического аппарата к условиям освещения и защиты растений от светового стресса. Проведено полноатомное компьютерное моделирование динамики процессов адгезии и деагрегации доменов D4 фактора Виллебранда с помощью программы GROMACS и силового поля CHARMM36 при различных состояниях протонирования гистидинов, соответствующих pH 6 и 7. Расчитаны потенциалы средней силы с помощью метода зонтичной выборки для деагрегации доменов D4 фактора Виллебранда. Далее с помощью крупно-зернистой компьютерной модели целого мультимера фактора Виллебранда, прикепленного за один из концов к твердой стенке в сдвиговом потоке вязкой жидкости, оценены напряжения сдвига, при которых происходят конформационные изменения этого белка и механичческая активация его адгезионный свойств. Была произведена модификация имеющейся у научного коллектива крупно-зернистой компьютерной модели фактора Виллебранда с неявным растворителем. Выявлена взаимосвязь между структурой белка и механическими характеристиками димера белка фактора Виллебранда. Показано, что удлинение мультимера фактора Виллебранда и раскрытие доменов A2 происходят в соответствии с экспериментальными данными. Однако раскрытие и активация доменов А1 начинается при меньших напряжениях сдвига, чем предполагалось ранее. Для более детального понимания механизмов проникновения криопротекторной среды в сперматозоиды человека была построена модель проникновения водного раствора глицерина 12 % об. через акваглицеропорины AQP7 и AQP3. В качестве базовой была взята модель Кедем-Качальского. На основании экспериментальных данных была проведена валидация модели. С помощью построенной модели проведено исследование влияния концентрации глицерина на изменения осмотического давления и объема клетки. В исследовании был взят состав современной криопротекторной среды с учетом клинических условий криоконсервации (объемов образцов, характерных времен и скоростей криоконсервации). В результате исследования модели были получены зависимости изменения относительного объема клетки при добавлении глицерина в концентрациях 1М, 1,5М, 1,6М, 1,8М, 2М, а также в присутствии сахарозы в концентрации 0,04М, что соответствует составу коммерческих криопротекторных сред. Рассчитано характерное время установления равновесия между изучаемой криопротекторной средой (глицерин 12%, сахароза 0,04М) и клетками, что составило t = 80 с. Проведены контрольные эксперименты, показывающие отсутствие статистически значимого различия между клетками, находившимися в криопро- текторной среде 2 минут и 10 минут до криоконсервации. На основании данных, полученных из модели и проверенных в эксперименте, можно предположить что время инкубации сперматозоидов в криопротекторной среде перед криоконсервацией может быть сокращено до 2 минут. На модельной системе (липосомы) проведено исследование изменений свойств мембран в зависимости от концентрации холестерина. Липосомы с основным компонентом дипальмитоилфосфатидилхолин размером 100 нм и различным соотношением фосфолипид/холестерин (4:1; 2:1; 1:1, без холестерина) исследовались с помощью метода ЭПР. Было показано, что при стандартных условиях при увеличении концентрации холестерина, ширина между крайними пиками на графиках поглощения магнитного поля увеличивается, что свидетельствует о увеличении жесткости и вязкости мембраны. Определенный методом ЭПР параметр упорядоченности для липосомы с соотношением фосфолипид/холестерин 1:1 совпал с параметром, определенным для мембраны сперматозоида, и составил 0.66 ± 0.03. Ранее было показано, что концентрация холестерина в мембране сперматозоидов пациентов, с диагнозом олигоастенозооспермия превышает нормальные показатели в 3 - 5 раз. В ходе выполнения работы определено. что концентрация холестерина в клетках данных пациентов может находиться в пределах от 3.6 ± 0.1 нмоль/млн клеток до 9.4 ± 0.2 нмоль/млн клеток, а также подтверждено, что клетки данных пациентов на 100% погибают при криоконсервации (крионетолерантны). Однако также подтверждено, что добавление холестерина к клеткам здоровых доноров улучшает их выживаемость при криоконсервации. Для модификации мембраны клеток холестерином были предложены комплексы бета-метил-циклодекстрин-холестерин. Был разработан протокол и проведена серия регистрации осцилляций концентрации кальция в сперматозоидах при взаимодействии как с «пустыми» бета-циклодекстринами (MBCD), так и с комплексами циклодекстрин-холестерин (MBCD-Ch). При добавление "пустых" MВCD нарушается целостность мембраны сперматозоидов, что приводит к значительной активации клетки, что регистрируется в виде "кальциевого ответа", характеризующегося увеличением концентрации кальция в клетке (в виде осцилляций, отдельных пиков, увеличения концентрации). Установлено, что при добавлении MBCD 2 мг/мл первый "кальциевый" ответ возникает через 2 - 2,5 минуты. В случае возникновения осцилляций, их период в среднем составляет 150 с, амплитуда около 300-500 нМ. После добавления комплексов MBCD-Ch амплитуду колебаний концентрации кальция уменьшается до базового уровня за счет доставки и встраивания молекул холестерина. В экспериментальной работе используется метод флуоресцентной микроскопии, сперматозоиды помечены красителем Fura Red. Данные исследования планируется продолжить. Освоен новый метод оценки целостности ДНК (Halosperm), позволяющий проводить исследования с применением светлопольного микроскопа. С помощью данного метода была оценена степень фрагментации ДНК сперматозоидов после инициации экзогенного окислительного стресса добавлением H2O2 0,5 мкМ. Было показано, что через 48 ч после эксперимента количество клеток с фрагментированной ДНК увеличивалось на 8% по сравнению с контрольной группой. Эти данные коррелируют с определенной ранее степенью фрагментации ДНК методом TUNEL. Так как метод Halosperm значительно проще для использования в условиях лаборатории, он может быть рекомендован в качестве основного метода. На основании полученных ранее данных X-ray, обнаружено неравномерное распределение кристаллов внутри одной пробирки при вертикальном ее размещении. Разброс размера кристаллов может составлять более 10 мкм в верхней и нижней частях пробирки. Так, для водного раствора глицерина 12% размер кристаллов в верхней части пробирки составил 15 ± 2 мкм, в то время, как на дне составлял 8 ± 1 мкм. Были предложены порядка 20 различных протоколов заморозки, включая автоматическую с помощью напечатанного на 3D принтере "лифта", позволяющего равномерно опускать образцы в дьюар. А также проведено сравнение вертикального и горизонтального размещения образцов. Показано, что при горизонтальном размещении статистически значимо образование кристаллов происходит более однородно с минимальным разбросом по сравнению с вертикальным размещением. Так, для коммерческой криопротекторной среды SpermFreeze средний размер кристаллов составил 9 ± 1 мкм. На основании обработки этих данных был отлажен протокол расчета размеров кристаллов для сред, содержащий β-метил-циклодекстрины. Рентгеноструктурный анализ растворов, содержащих как пустые циклодекстрины, так и их комплексы с холестерином, не выявил различий в средних размерах кристаллов, образующихся при криоконсервации, по сравнению с контролем. Средний размер кристаллов составлял 11± 2 мкм. Проведенные тесты на цитотоксичность показали, что полисахариды (ПС) высокой молекулярной массы 1,2 МДа является нетоксичным для клеток, в то время как добавление ПС с низкой молекулярной массой 1–5 кДа приводит к резкому снижению индекса подвижности и, возможно, к гибели клеток. Проведен анализ механизмов взаимодействия ПС низкой молекулярной массы с рецепторами мембраны сперматозоидов. Выявлено наличие у сперматозоидов толл-подобных рецепторов 2 и 4 типов (TLR2, TLR4), активация которых снижает подвижность сперматозоидов, вызывает их апоптоз и значительно снижает возможность оплодотворения. Первые контрольные исследования влияния ПС молекулярной массой 200-300 кДа на выживаемость сперматозоидов продемонстрировали, что добавление ПС молекулярной массы 200-300 кДа приводят к агглютинации сперматозоидов. Обработана коллекция шестилучевых губок, собранных в районе Императорского хребта (северная Центральная часть Тихого окена) в рейсе ИО РАН 2019 г. и в 2018 (род Farrea). Пересмотрены диагнозы некоторых видов губок Hexactinellida из материала, собранного в Беринговом море с помощью бентосных тралов, подводных обитаемых и необитаемых аппаратов.
17 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистем
Результаты этапа: В связи с насущной потребностью биомедицинского сообщества в новых методах и средствах терапии и профилактики различных заболеваний (включая корь, COVID-19, неопластические трансформации и другие) более подробно рассмотрены особенности действия полисахаридов на биологические системы. Из водного экстракта проростков картофеля был выделен и очищен с помощью ионообменной хроматографии и гель-фильтрации полисахарид с молекулярной массой около 70 кДа. Молекулярную массу определяли с помощью гельпроникающей хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии, а его моносахаридный состав анализировали методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора и капиллярной колонки. Было показано, что полисахарид состоит из галактозы и арабинозы в количествах 38% и 24% соответственно, а также уроновых кислот (10%), остатков моносахарида глюкозы (15%) и белков (не менее 9%). Показано, что митогенная активность полученного полисахарида сравнима с активностью бактериального липополисахарида. Полисахариды могут быть одним из перспективных типов молекул с большим разнообразием биологической активности, в частности – противовирусной. Согласно эксперименту, внутрибрюшинное введение STP по схеме лечения в различных дозах было эффективным, достоверно подавляя репликацию вируса в легких, предотвращало потерю веса у животных. Во всех случаях лечение стимулировало образование вируснейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2, что позволяет предположить наличие у препарата адъювантных свойств. У животных с язвенным дефектом частота патологических состояний значительно снизилась при введении STP, независимо от дозы, со статистической значимостью p≤0,05. Это говорит о том, что полисахарид STP эффективно предотвращает развитие язвы у крыс August в модели язвы резерпина с использованием метода Селье. Животные, предварительно обработанные HTLP, показали значительное снижение образования микроядер, показав в пять раз меньше микроядер в клетках костного мозга по сравнению с необработанной группой. Это сравнение подчеркивает потенциальный защитный эффект HTLP от повреждения хромосом, вызванного радиацией. Лечение HTLP демонстрирует значительное снижение опасности по сравнению с контролем, что указывает на его защитный эффект от облучения. Таким образом, можно сделать вывод, что использование HTLP увеличивает вероятность выживания животных при ионизирующем воздействии рентгеновских лучей и протонов. Анализ выживаемости показывает, что группы, обработанные HTLP, демонстрируют более высокую выживаемость по сравнению как с контрольной группой, так и с группой, обработанной цистеамином, что предполагает значительный защитный эффект HTLP от облучения, независимо от типа облучения (протонное или рентгеновское). Проведенные подводные измерения спектрального состава света на границе фотической зоны в семи прибрежных водоемах, в разной степени изолированных от моря, на морской акватории и в пресном озере показали, что в морских и солоноватых водоемах до нее доходит преимущественно зеленый свет, а в озерах c пресным верхним слоем — оранжевый, красный и дальний красный. В меромиктических водоемах фотическая зона была ограничена окрашенной прослойкой воды с массовым развитием фототрофных микроорганизмов. Их пигментный состав хорошо согласуется со спектральным составом проходящего света. В морских бухтах и лагунах доминировали таксоны, обладающие красными пигментами: криптофитовые водоросли с фикоэритрином-545, либо пурпурные серные бактерии с каротиноидом океноном, либо коричневоокрашенные зеленые серные бактерии с изорениератином и бактериохлорофиллом e. В озерах с пресным верхним слоем воды развивались одноклеточные водоросли либо зеленые серные бактерии с хлорбактином и бактериохлорофиллом d. Причиной такой избирательности является именно спектральный состав света, а не другие абиотические факторы, такие как соленость. Спектральный диапазон может служить селективным фактором, определяющим состав сообщества фототрофов со структурно различными антеннами, но схожими спектрами поглощения света. Завершена валидация модели проникновения водного раствора глицерина 12 % об. в сперматозоид человека через акваглицеропорины AQP7 и AQP3 на основании модели Кедем-Качальского, построенной в рамках выполнения НИР. На 12 образцах культур клеток исследовано проникновения водного раствора глицерина 12%об. Проведена проверка результата моделирования на 16 образцах с концентарциями глицерина 1М, 1,5М, 1,8М, 2М. В продолжении анализа модели получены зависимости изменения объема клетки в случае помещения в криопротекторую среду (КПС) с глицерином (12% об.) и с добавлением сахарозы в различных концентрациях [0,04М, 0,16М, 0,25М, 0,5М]. Установлено, что наличие сахарозы не влияет на общий профиль зависимости, однако концентрация сахарозы влияет на характерные размеры, достигаемые клеткой после погружения в КПС. Определено, что для растворов 0.04 М, 0.25 М и 0.5 М сахарозы значения наименьшего объема (Vmin) составляют соответственно 76%, 73%, 69% от изначального. Также сахароза влияет на конечный объем, достигаемый клеткой при достижении равновесия и на время, необходимое для достижения этого равновесия. Для растворов 0.04 М, 0.25 М и 0.5 М сахарозы значения равновесного объема (Vmax) составляют соответственно 129%, 89%, 73% от изначального, а времена достижения равновесия (T ) 50, 15, 5 с. соответственно. Таким образом, при увеличении концентрации сахарозы в КПС уменьшается конечный объем клетки, достигаемый при инкубации в растворе. Определена концентрация сахарозы, при которой клетка при достижении равновесия возвращается к своему начальному объему. С помощью построенной модели было рассчитано, что данная концентрация составляет 0.16 М. Минимальный объем клетки для такого раствора составляет 74 % от начального, а время выхода на равновесный объем равно 24 с. Результаты экспериментов (20 образцов культур клеток) достоверно подтверждают, что выживаемость клеток в растворе 0,16М сахарозы на 8% выше, чем в других растворах, что подтверждает результат моделирования. В рамках выполнения НИР исследована активирующая способность бикарбонат-ионов на основании регистрации и анализа изменений концентрации ионов Ca2+ как маркера активации сперматозоидов. Разработаны протоколы экспериментов и дополнительные приспособления (метод проточных камер). Для активации сперматозоидов были приготовлены буферные среды с содержанием бикарбоната натрия NaHCO3 в концентрациях 5 мМ (физиологическая культуральная среда), 10 мМ, 20 мМ и 50 мМ. Показано, что в стандартной культуральной среде с концентрацией бикарбонат-ионов 5 мМ концентрация [Ca2+] в клетках остается на физиологическом уровне данном уровне 150-200 нМ и активации клеток не происходит. В ходе работы было исследовано более 40 образцов донорского материала. Были выявлены различные типы ответов на активацию сперматозоидов бикарбонатами. Так, при инкубации в среде с концентрацией 20 мМ [HCO3–] регистрировалось три типа ответов изменения концентрации [Ca2+]: колебания, отдельные пики или рост концентрации [Ca2+]. В среднем клетки отвечают через 50 секунд инкубации, хотя регистрируются и «задержанные» ответы. Пики соответствуют концентрации [Ca2+] порядка 2 мкМ. Отмечено, что при инкубации с 20 мМ [HCO3–] клетки отвечают быстрее и с большей амплитудой, чем при инкубации с 10 мМ [HCO3–]. Таким образом были проанализированы все типы ответов при инкубации сперматозоидов в среде с различным содержанием бикарбонат-ионов. Определено, что для концентрации [HCO3–] 50мМ наиболее часто встречается резкий скачок концентрации кальция. Концентрация 50 мМ [HCO3–] моделирует естественный процесс активации, так как совпадает с концентрацией бикарбонат-ионов в женском репродуктивном тракте человека. Изменение концентрации кальция в клетках регистрируется с задержкой от 50 с до 900 с. У большей части клеток концентрация [Ca2+] необратимо растет до 1 мкМ и более, что, возможно, свидетельствует о необратимых изменениях в состоянии клетки - перестройки мембраны и переходу к капацитации и акросомальной реакции. Для стабилизации мембраны сперматозоидов при криоконсервации в качестве носителя холестерина были выбраны β-метил-циклодекстрины. Проведены и проанализированы изменения концентрации [Ca2+] после инкубации отдельных сперматозоидов с "пустыми" метил-бета-циклодекстринами (МБ-ЦД) в концентрациях 1, 2 и 4 мг/мл. Проведен детальный анализ вариантов ответов для рабочей концентрации 2 мг/мл МБ-ЦД. На 93 клетках были выявлены следующий варианты ответов. Примерно у 50% клеток изменения [Ca2+] не наблюдались. 21% клеток демонстрировали одиночный подъем [Ca2+] с 20 нМ базовой концентрации до 250 нМ - 400 нМ. У 29% клеток наблюдались периодические осцилляции. Методом двухэтапного кластерного анализа было проведено разделение такого типа ответа на 2 подгруппы. Первая подгруппа характеризуется периодом колебания [Ca2+] порядка 100 с и небольшой амплитудой первого скачка концентарции [Ca2+] (до 70 нМ). Вторая группа характеризуется периодом колебания [Ca2+] порядка 300 с и высокой амплитудой первого ответа - порядка 375 нМ. Планируется дальнейший детальный анализ осцилляций [Ca2+] для других концентраций МБ-ЦД. На 23 образцах проведена серия "обратных" экспериментов: вначале мембрана клетки насыщалась холестерином путем добавления комплексов MBCD-Ch в концентрациях 2, 4 и 6 мг/мл, а затем холестерин извлекался пустыми MBCD. Добавление комплексов циклодекстрин-холестерин не приводит к значительным повреждениям мембраны, соответственно клетка не активируется, и нет изменений внутриклеточной концентрации кальция. Добавление пустых циклодекстринов приводит к значимым мембранным перестройкам, которые влекут за собой проникновение [Ca2+] в клетку, что, возможно, повлечет за собой активацию каскада реакций, приводящих к активации сперматозоида. Эксперименты планируется продолжить. Проведенные тесты на цитотоксичность (13 образцов) показали, что полисахариды (ПС) молекулярной массы 200 - 300 кДа и 1,5 МДа быстро вызывают агглютинацию (слипание) сперматозоидов человека. Высказано предположение, что галактозо-специфический рецептор ASGP-R на поверхности сперматозоида может распознавать и связывать экспонированный фрагмент исследуемых полисахаридов, аналогично лакто-N-неотетраозе (олигосахарид Gal(β1-4)GlcNac(β1-3)Gal(β1-4)Glc) на асиалилированном гонококковом липоолигосахариде. На 12 образцах показано, что ПС молекулярной массой Mr1,2-5 МДа не только не вызывают цитотоксичность, но и повышают долю выживших клеток после криоконвервации на 7%. Методом поляризационной микроскопии оценено состояние веретена деления ооцита разной степени зрелости. Установлено, что для свежих или криоконсервированных бластоцист исход дробления эмбриона, а следовательно и успешная беременность, не зависит от размера веретена деления. Определено: у оплодотворенного ооцита высока вероятность формирования зиготы 2PN, в случае, если размер веретена деления попадает в интервал 80-120 мкм2 и высокий риск деградации клетки, если размер ветена менее 80 мкм2. Однако между размером веретена деления и наличием изменений в хромосомах зависимости не наблюдалось. Изучены фотосинтетические показателей листьев (индукция флуоресценции хлорофилла и кинетики редокс-превращений реакционного центра Р700) фотосинтетического аппарата двух контрастных видов рода традесканции: Tradescantia sillamontana (световыносливый вид) и Tradescantia fluminensis (тенелюбивый вид), в зависимости от длительности акклимации растений (в течение нескольких месяцев) к свету высокой и низкой интенсивности и выяснены структурно-функциональные и рН-зависимые механизмы адаптации фотосинтетического аппарата к условиям освещения, обеспечивающие защиту растений от светового стресса. Построена модель электронного и протонного транспорта в хлоропластах, учитывающая функционирование двух переносчиков на акцепторном участке фотосистемы 2 (молекулы пластохинона PQA и PQB) и проанализированы альтернативные режимы функционирования хлоропластах, связанные с работой цепей нециклического и циклического транспорта электронов. Показано, что расширенная модель адекватно описывает немонотонные кривые индукции флуоресценции хлорофилла а и фотоиндуцированных изменений концентрации Р700. Таким образом, модель может быть использована для анализа структурно-функциональных изменений фотосинтетического аппарата хлоропластов в зависимости от условий произрастания растений. Результаты моделирования показали, что варьирование соотношения числа комплексов ФС1, ФС2 и b6f и соответствующих констант скоростей реакций электронного транспорта, свидетельствую о возрастании вклада циклического потока электронов вокруг ФС1 в функционирование цепи циклического транспорта электронов в индукционный период, предшествующий установлению стационарного состояния. Методом функционала плотности рассчитаны термодинамические характеристики реакции гидролиза АТФ до ADP и ортофосфатата рамках модели, учитывающей в явном виде водное окружение, включающее 80 молекул воды. Результаты расчетов геометрии и энергии системы в зависимости от разменов водной оболочки вокруг субстрата и продуктов реакции гидролиза АТР хорошо согласуются с известными экспериментальными данными. Проведен анализ экспериментальных данных и возможностей применения конечных автоматов к моделированию механизмов агрегации тромбоцитов в присутствии опухолевых клеток показал, что конечные автоматы непригодны для этой цели. Показано, что клеточный автомат может быть использован для построения модели, но не дает вычислительных преимуществ по сравнению с общепринятыми методами моделирования.
18 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Физико-химические и биологические основы стабильного развития и сохранения экосистем
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Прикрепленные файлы

№ Имя Описание Имя файла Размер Добавлен