Структурные исследования теломеразного комплекса термотолерантных дрожжейНИР

Соисполнители НИР

EMBL Соисполнитель

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 15 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Структурные исследования теломеразного комплекса термотолерантных дрожжей
Результаты этапа: Для ранее полученного структурного фрагмента TERT H.polymorpha, соответствующего N-концевому домену (TEN, остатки 1-153), решена кристаллическая структура (разрешение 2,2 А). Обнаружено, что некоторые участки цепи TEN обладают крайне высокой конформационной подвижностью, вследствие чего эти участки не видны на карте электронной плотности. Основной кор молекулы TEN по общей укладке схож с имеющейся в базе данных кристаллической структурой TEN из T.termophila, однако между этими белками имеются и значительные отличия в расположении некоторых элементов вторичной структуры. Проведен анализ расположения в структуре TEN консервативных аминокислотных остатков. Согласно полученным данным, роль TEN в катализе TERT и механизм процессивности фермента может значительно различаться для жгутиковых, дрожжей и высших эукариот. Получены образцы TEN, меченные изотопами 1H, 13C, and 15N, и проведен анализ ЯМР. Сняты 3D-спектры HCCH-TOCSY, HNHB, 13C-1H HSQC-NOESY, 15N-1H HSQC-NOESY и 2D-спектры DQF-COSY. Проведено отнесение химических сдвигов. На основании полученных данных идентифицирована вторичная структура белка в растворе и определены структурные элементы, которые могут быть вовлечены во взаимодействие с белковыми партнерами TEN. Данные о вторичной структуре TEN в растворе совпадают с информацией, полученной из кристаллической структуры, и подтверждают конформационную подвижность участков цепи, для которых отсутствует электронная плотность. Проведен биоинформатический анализ последовательности TERT H. polymorpha и определены дополнительные участки, которые могут соответствовать стабильным белковым продуктам. Были получены конструкции на основе плазмиды pET30aTEV для экспрессии 11 отобранных фрагментов TERT с укороченной последовательностью. Из них лишь 8 экспрессировались в штамме BL-21(DE3) в достаточном для дальнейших исследований количестве. Два фрагмента TERT, которые экспрессировались в растворимом виде, а именно, N-2 (остатки 155-783) и N-25 (остатки 178-783), были выделены, очищены и идентифицированы масс-спектрометрически. Физико-химическая характеристика полученных белков показала, что они структурированы в растворе и устойчивы к агрегации при 25ºС, т.е. пригодны для дальнейших структурных исследований.
2 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Структурные исследования теломеразного комплекса термотолерантных дрожжей
Результаты этапа: ОТЧЕТ за 2016 г. 1. Структурный фрагмент hpTERT 178-783 (N-25) В 2016 г. для генно-инженерных конструкций укороченного hpTERT была тестирована возможность экспрессии в различных штаммах E. coli с целью получения белковых продуктов в растворимой форме. Были тестированы шесть различных штаммов, однако удовлетворительной экспрессии в клеточном лизате получено не было. Поэтому далее было решено сосредоточиться на укороченном фрагменте hpTERT N-25, в котором присутствуют все структурные домены hpTERT, кроме N-концевого. На прошлом этапе работы были найдены условия, при которых этот фрагмент экспрессируется в растворимой форме и в удовлетворительных количествах. На данном этапе протокол экспрессии и очистки N-25 был оптимизирован с целью увеличения выхода белка. Для увеличения выхода и гомогенности белкового препарата N-25 была использована полученная в 2015 г. генно-инженерная конструкция для одновременной экспрессии в E. coli белкового фрагмента hpTERT (в данном случае N-25) с фрагментом теломеразной РНК (в данном случае с TR6, содержащим практически полноразмерную теломеразную РНК). Ранее было обнаружено, что оптимальным штаммом для ко-экспрессии является Star pRare. На данном этапе были тестированы такие параметры экспрессии, как температура и время экспрессии, среда для роста клеточной культуры, способы разрушения клеточных стенок, экстракционный буфер. В результате в качестве оптимальной среды для культивирования была выбрана автоиндукционная среда (культивирование при 21°С, 60 ч). Клеточные стенки было предложено разрушать с помощью эмульгатора emulsiflex при добавлении лизоцима и ДНКазы I для резрушения геномной ДНК. Из тестированных буферных смесей различного состава наиболее значительное увеличение экспрессии наблюдалось при использовании буфера следующего состава: 50 мМ бис-трис-пропан рН 7.4, 0.5 М KCl, 5 мМ MgCl2, 10% глицерин, 10 мМ β-меркаптоэтанол. Этот состав был выбран для оптимизации условий очистки белка и последующего препаративного выделения белка. Использованная ранее схема очистки включала следующие стадии: - металлохелатная хроматография на Ni-NTA сефарозе; - удаление аффинного тага с помощью TEV протеазы; - ионообменная хроматография на гепарин-сефарозе; - гель-фильтрация на S-200. Эта схема приводила к потере практически половины белка на стадии ионообменной хроматографии. Данная стадия необходима для очистки целевого белка от фрагментов неспецифически связанных нуклеиновых кислот из лизата E. coli, а также ассоциированных с ними посторонних белков. Однако при этом целевой белок терял структурную целостность и агрегировал на колонке, вследствие чего с колонки элюировалась только часть белка. Для решения данной проблемы была предложена и тестирована альтернативная схема очистки, включающая два новых подхода. Первый подход заключался в добавлении в буфер для элюции белка с гепарин-сефарозы ДНК-олигонуклеотидов, моделирующих последовательность теломерной ДНК. Предполагалось, что такие олигонуклеотиды специфически свяжутся с целевым белком и позволят ему сохранить структурную целостность и элюироваться с колонки без потерь. Были тестированы два одноцепочечных ДНК-олигонуклеотида различной длины, включающих одинаковую последовательность теломерного повтора GGGTGGCG. Один из них соответствовал 1.5 длины теломерного повтора (всего 11 нуклеотидов), второй – 4 длинам теломерного повтора (всего 32 нуклеотида). Второй подход заключался в том, чтобы провести ионообменную хроматографию на тагированном белке, т.е. до стадии удаления аффинного тага. Предполагалось, что тагированный белок более растворим и не агрегирует на колонке, поскольку в состав тага входит S-пептид, специально созданный для увеличения растворимости белков. Результаты тестирования альтернативной схемы очистки N-25 показывают, что добавление ДНК-олигонуклеотида длиной 4 теломерных повтора действительно увеличило элюцию целевого белка с гепарин-сефарозы, однако полученный препарат белка отличался высокой гетерогенностью по массе, по-видимому, вследствие его частичной ассоциации на олигонуклеотиде. Добавление короткого ДНК-олигонуклеотида длиной 1.5 теломерных повтора, напротив, приводило к снижению элюции целевого белка и/или его агрегации. Использование альтернативной схемы без добавления олигонуклеотидов не приводило к значительному изменению количества элюированного белка по сравнению со стандартной схемой очистки. Таким образом, для препаративной наработки препарата целевого белка была выбрана стандартная схема очистки в сочетании с новой системой ко-экспрессии с фрагментом TR6. Препаративная наработка экспериментального образца N-25 была проведена в условиях EMBL (Гамбург). Для наработки клеточной культуры было взято 6 л среды. Экспрессия и очистка белка следовала описанной выше оптимизированной схеме. Суммарный выход белка после всех стадий очистки составил 5 мг с 1 л культуры клеток (всего было наработано 30 мг). Препарат белка после гель-фильтрации был сконцентрирован до 8.34 мг/мл и использован для скрининга условий кристаллизации. Скрининг условий кристаллизации целевого белка был проведен в условиях высокопроизводительной автоматизированной системы в EMBL (Гамбург). Были тестированы шесть коммерческих наборов реагентов, каждый включал по 96 условий. Помимо нативного белка, был использован N-25 в комплексе с ДНК-олигонуклеотидом длиной 1.5 теломерных повтора. На автоматическом этапе скрининга были обнаружены возможные хиты, которые могут соответствовать образованию микрокристаллов. В этих условиях получен мелкозернистый гранулят предположительно кристаллического характера. Для подтверждения микрокристаллического характера гранулята и дальнейшей оптимизации условий их получения эксперимент по кристаллизации N-25 необходимо продолжить вручную. 2. Теломеразный белок hpEst3 Был также проведен скрининг условий кристаллизации «длинного» варианта hpEst3. Согласно различным характеристикам, белок представляет собой компактную глобулу и конформационно гомогенен, однако попытки его кристаллизации пока не привели к успеху. Было решено получить структуру этого белка альтернативным методом – ЯМР в растворе. Для этого были получены варианты hpEst3, меченные изотопами 13C и 15N, и для этих препаратов были сняты 2D и 3D спектры ЯМР при 15 и 25ºС. В настоящее время проводится отнесение сигналов спектров. 3. N-концевой домен hpTERT (hpTEN) Полученная ранее и предварительно уточненная до R-фактора 29% кристаллическая структура hpTEN была на данном этапе доуточнена сотрудниками группы В. Ламзина (EMBL, Гамбург) до R-фактора 18%. Одновременно была доуточнена также полученная ранее ЯМР-структура этого белка. Сравнение структуры hpTEN, решенной разными методами (в твердом состоянии и в растворе), позволило сделать следующие выводы: 1. Субъединица белка содержит три участка – высокоупорядоченный структурный кор, конформационно подвижный С-концевой фрагмент и также подвижную петлю 71-98, в центре которой расположена альфа-спираль. Подвижные участки цепи соответствуют участкам, пропущенным (не видным) в кристаллической структуре. Упорядоченный кор практически совпадает в двух структурах. 2. В упорядоченный участок белковой структуры входит фрагмент, идентифицированный ранее как высококонсервативный структурный консенсус, включающий элементы α7- α8-Gly- α9, который обнаруживается как в hpTEN, так и в имеющейся в базе данных структуре TEN из Tetrahymena termophila (ttTEN). Некоторые другие элементы структуры hpTEN по сравнению с ttTEN можно отнести к топологическим гомологам (одинаковы по расположению в цепи, но не накладываются пространственно). 3. Наиболее значительно в hpTEN и ttTEN различается участок, который в hpTEN виден только в ЯМР-структуре. Он соответствует петле 71-98, в которой в hpTEN содержится альфа-спираль α6. В структуре ttTEN этому участку соответствует фрагмент, включающий бета-шпильку. Данная подвижная петля непосредственно предшествует структурно консервативному консенсусу и может быть важна для функционирования TERT. Согласно данным релаксационной динамики химических сдвигов, данная петля в hpTEN может принимать участие в связывании физиологических лигандов. Наблюдаемая разница во вторичной структуре этого участка может отражать разницу в функционировании TERT из разных организмов. Чтобы выяснить, какой элемент вторичной структуры содержится на данном участке в TEN из других организмов, было проведено множественное выравнивание последовательностей участка между альфа-спиралями α5 и α7. Результаты выравнивания показывают, что только в TEN из инфузорий и некоторых других одноклеточных эукариот данный участок, вероятнее всего, построен как в ttTEN, т.е. содержит бета-шпильку. В TEN из животных, дрожжей и водорослей, наиболее вероятно, данный участок построен как в hpTEN, т.е. представляет собой подвижную петлю с альфа-спиралью. 4. Поиск лигандов hpTEN Известно, что сигналы спектров ЯМР изменяются при взаимодействии атомов белка с лигандами. Это свойство было использовано для поиска лигадов hpTEN и выявления остатков, вовлеченных во взаимодействие. Для этого к раствору 15N-меченого hpTEN добавляли различные синтетические олигонуклеотиды в возрастающих концентрациях и регистрировали спектры ЯМР. Были тестированы более 10 одноцепочечных и двухцепочечных РНК- и ДНК-олигонуклеотидов, моделирующих последовательность теломерной ДНК и теломеразной РНК. Получены следующие результаты: 1. Специфического связывания hpTEN с одноцепочечной теломерной ДНК не обнаружено. 2. Обнаружено специфическое связывание hpTEN c одноцепочечными фрагментами РНК, соответствующими матричному участку теломеразной РНК и участку к 3' от него. 3. Обнаружено связывание hpTEN c гетеродуплексом, моделирующим дуплекс ДНК продукт – РНК матрица. 4. На поверхности hpTEN обнаружены два независимых интерфейса, которые отвечают за связывание ssRNA и гетеродуплекса. На основании полученных результатов предложена схема расположения N-домена hpTERT относительно остальных компонентов теломеразного комплекса, и модель функционирования TERT. Согласно этой модели, роль TEN в работе TERT заключается в ограничении длины гетеродуплекса, образующегося в результате катализируемой реакции. Такое ограничение необходимо для последующей диссоциации цепей и транслокации РНК обратно в активный центр фермента. Такая модель, по-видимому, может быть верной и для других TERT, включая TERT человека.
3 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Структурные исследования теломеразного комплекса термотолерантных дрожжей
Результаты этапа: Результаты этапа: 1. Структурный фрагмент hpTERT 178-783 (белок N-25) На прошлом этапе был оптимизирован протокол экспрессии фрагмента hpTERT 178-783 (N-25), позволяющий наработать препаративные количества белка. Препарат был охарактеризован физико-химическими методами, которые показали наличие в образце конформационной гетерогенности, несмотря на его высокую степень химической чистоты. Согласно компьютерному моделированию пространственной структуры N-25, он представляет собой кольцеобразную структуру с центральной порой. Пора играет функциональную роль и в нативной теломеразе служит для связывания гибридного дуплекса ДНК-праймер/РНК-матрица. Согласно данным молекулярного моделирования, в отсутствие дуплекса возможно движение доменов белка N-25 относительно друг друга, что, по-видимому, и вызывает конформационную гетерогенность. На настоящем этапе работы велись с целью увеличения гомогенности препарата белка N-25. Для этой цели было предложено получить комплекс N-25 с синтетическим олигонуклеотидом, моделирующим физиологический лиганд белка - гибридный дуплекс ДНК/РНК. Был синтезирован 21-звенный олигонуклеотид, содержащий последовательность матричного участка РНК и теломерной ДНК. В растворе этот олигонуклеотид образует шпильку, содержащую гетеродуплексный ДНК/РНК участок. Были разработаны и оптимизированы условия получения комплекса N-25 с данной шпилькой. Образование комплекса подтверждали гель-хроматографически. Согласно полученным данным, образованию комплекса способствует предварительное прогревание раствора белка в смеси со шпилькой в течение 5 мин при температуре 30ºС, близкой к температуре плавления белка. Комплекс белка N-25 c олигонуклеотидной шпилькой был охарактеризован физико-химическим методами. Показано, что образование комплекса повышает компактность полученных частиц и несколько повышает термическую стабильность белка. Эти параметры позволяют предположить, что полученный комплекс больше подходит для структурных исследований, чем исходный белок N-25 в апоформе. После препаративной наработки данного комплекса планируется начать скрининг условий его кристаллизации. 2. Теломеразный белок hpEst3 Скрининг условий кристаллизации теломеразного белка hpEst3 позволил найти условия образования микрокристаллов, которые в дальнейшем будут использованы для определения кристаллической структуры методом серийной кристаллографии. На данном этапе была также продолжена работа по получению структуры Est3 в растворе методом ЯМР-спектроскопии. Было закончено отнесение 2D и 3D спектров ЯМР, в настоящее время проводится решение структуры белка. 3. N-концевой домен hpTERT (белок hpTEN) Ранее в работе была определена пространственная структура hpTEN. В развитие этой работы планируется получение и характеристика комплексов hpTEN с олигонуклеотидными лигандами. На данном этапе было количественно охарактеризовано взаимодействие hpTEN с несколькими синтетическими РНК- и ДНК-олигонуклеотидами. Для этого был использован метод термофореза (Microscale Thermophoresis). Были определены константы диссоциации комплексов с этими лигандами для нативного hpTEN и трех мутантных вариантов с заменами аминокислотных остатков в одном из двух предполагаемых центров связывания олигонуклеотидов. Результаты работы показывают ухудшение сродства к лигандам для двух мутантных вариантов. Таким образом, получено экспериментальные подтверждение предложенной нами структурной модели теломеразного комплекса.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".