ИСТИНА

Данный проект подразумевает проведение исследований процесса транспорта тРНК в митохондрии дрожжей. Наши предыдущие исследования в этой области показали, что импорту подвергается только одна цитозольная тРНК - лизиновая тРНК с антикодоном CUU (далее - тРЛ1). (Недавно другой группой исследователей был продемонстрирован импорт двух глютаминовых тРНК, однако этот процесс происходит по совершенно иному механизму). Мы идентифицировали нуклеотиды в составе тРЛ1, определяющие возможность ее импорта. Также мы выявили три цитозольных белка, необходимых для направления импорта тРЛ1 в митохондрии. Наконец, в 2007 году была впервые прямо продемонстрирована функция тРЛ1 в митохондриальном матриксе - участие в митохондриальной трансляции при повышенных температурах роста дрожжевых клеток (в этих условиях митохондриальная изоакцепторная тРНК не способна распознавать соответствующие кодоны). Из более ранних исследований также известно, что для импорта тРЛ1 в митохондрии дрожжей необходимы белки-компоненты системы транспорта белков в митохондрии, а именно белки Tom40p и Tom20p (канал и рецептор, соответственно), входящие в состав так называемого ТОМ-комплекса, ответственного за транслокацию белков через внешнюю митохондриальную мембрану. Более того, энергетические параметры импорта тРЛ1 в митохондрии практически полностью совпадают с таковыми в случае импорта белков. Все это заставляет предположить, что ТРЛ1 импортируется в митохондрии по каналам белкового импорта, видимо, будучи связанной с каким-то белком-переносчиком. (Наиболее вероятным кандидатом на эту роль является предшественник митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы, preMsk1p). Тем не менее, точные молекулярные механизмы транслокации тРЛ1 через митохондриальные мембраны до сих пор остаются неизвестными. На решение этой проблемы и направлен настоящий проект.

1. Показано, что методы микроскопического слежения за одной молекулой пригодны для исследования аппарата импорта РНК в митохондрии дрожжей 2. Показано, что белок Tom40p совершает во внешней мембране дрожжевых митохондрий быстрые, но крайне ограниченные в пространстве движения 3. Показано, что в дрожжах дикого типа в процессе импорта тРНК в митохондрии с молекулой тРНК связывается следующие белки-компоненты TOM-комплекса: Tom5p (обеспечивает стабильность ТОМ-комплекса), Tom40p (канальный белок для импорта белков) и Tom71p (рецептор). Интересно, что Tom40p был идентифицирован методом химических сшивок, но не методом North-Western (два других белка были выявлены обоими методами). 4. В клетках дрожжей с делецией гена вольтаж-зависимого анионного канала (VDAC) наблюдалась совершенно иная картина: с импортируемой тРНК в таких клетках взаимодействовали белки Tom40p и Tom22p (еще один рецептор импортируемых белков). 5. Полученные результаты поставили под сомнение ранее постулировавшуюся абсолютную необходимость белка Tom40p для процесса импорта тРНК в митохондрии дрожжей. Действительно, мы показали, что импорт тРНК через внешнюю мембрану митохондрий может происходить как через Tom40p, так и через порин (по всей видимости, через его первую изоформу). 6. Разработаны оригинальные методики выделения и очистки белков Tom40p, Por1p и Por2p из клеток пекарских дрожжей. 7. Показано, что импортируемая тРНК напрямую взаимодействует со всеми идентифицированными ранее белками. В случае белков Tom40p, Por1p и Por2p показано, что данное взаимодействие не до конца специфично: с данными белками взаимодействуют также и неимпортируемые тРНК. Судя по всему, отбор РНК-кандидатов на импорт осуществляется либо еще в цитозоле, либо на внешней мембране митохондрий, но посредством белков-рецепторов, а взаимодействие РНК с канальными белками внешней мембраны само по себе является не до конца специфическим.