ИСТИНА

Экспериментальная и теоретическая работа, цель которой – выяснение молекулярных механизмов функционирования биологических преобразователей энергии: мембраносвязанных оксидоредуктаз, катализирующих векторный перенос протонов (NADH-убихинон оксидоредуктаза, комплекс I), и протон-транслоцирующих ATPаз (Fo∙F1-ATPаза). Изучение принципов регулирования работы ферментов, связанных с внутренней мембраной митохондрий, и их анализ для условий, моделирующих физиологическое и патологическое состояния. Сравнительный анализ строения и свойств комплекса I и ATP синтетаз митохондрий и прокариот. Разработка и усовершенствование методов получения препаратов ферментов - преобразователей энергии, и измерения их активностей.

1) Ранее мы обнаружили новое явление: сильную (до 10 раз) стимуляцию парциальной NADH : гексамминорутений (ГАР) редуктазной активности комплекса I (NADH : убихинон редуктазы) добавлением АТР [1]. Уместно отметить, что эта парциальная активность была открыта и охарактеризована в нашей лаборатории [2, 3] и в настоящее время широко используется в мировой практике. Стимулирующее действие АТР проявляется только при низких (~ Км) концентрациях субстрата – NADH. Для удовлетворительного объяснения этого явления потребовалось найти удобный для анализа способ регистрации NADH : ГАР редуктазной реакции при любых наперед заданных концентрациях NADH и ГАР. Мы разработали такой способ, применив две сопряженные ферментативные системы. Одна, новая NADH-регенерирующая система, – NAD+-зависимая формиатдегидрогеназа дрожжей, любезно предоставленная нам доктором В.И. Тишковым (кафедра химической энзимологии, химического факультета МГУ), необратимо катализирующая окисление формиата до СО2, позволяет поддерживать любую стационарную концентрацию NADH в системе а) формиат + NAD+ → NADH + СО2; б) NADH + ГАР (окисленный) → NAD+ + ГАР (восстановленный) и далее в) ГАР (восстановленный) + О2 → ГАР (окисленный) + (Н2О + Н2О2). Система позволяет прослеживать скорость реакции б) (предмет нашего изучения) в реакции нулевого порядка в) по поглощению кислорода. Эта система экспериментально отработана, и полученные материалы готовятся к публикации. 2) Существенным тормозом в понимании функционирования псевдообратимой Fо∙F1 АТРазы/синтетазы – главного фермента, обеспечивающего синтез АТР, было отсутствие препаратов демонстрирующих классическое, описанное для интактных митохондрий, явление «дыхательного контроля» - кратковременной стимуляции дыхания и активации окислительного фосфорилирования в ответ на добавление небольших концентраций ADP. Мы получили препарат замкнутых прочно-сопряженых мембран бактерии P. denitrificans, в котором Fо∙F1 комплекс свободно доступен для субстратов окислительного фосфорилирования, и впервые проследили кинетику изменения дыхания, мембранного потенциала и синтеза АТР для таких препаратов. Так как результаты этой работы опубликованы [4], в настоящем отчете мы ограничимся приведением резюме этой опубликованной работы: Прослежены синтез ATP, поглощение кислорода, и трансмембранный электрический потенциал в ходе окислительного фосфорилирования, катализируемого прочносопряженными вывернутыми (inside-out) мембранами Paracoccus denitrificans. Синтез ATP, инициированный добавлением ограниченных количеств либо ADP, либо неорганического фосфата (Pi), протекал вплоть до очень низких остаточных концентраций лимитирующего субстрата. Образованный ATP не снижал скорость синтеза, инициированного добавлением ADP. Количество остаточного ADP, определенного в состоянии 4 дыхания, не зависело от десятикратного изменения концентраций Pi или ATP. pH-зависимость Km для Pi не совпадает с простой кривой степени диссоциации фосфорной кислоты. Частичное ингибирование дыхания приводит к снижению скорости синтеза ATP, не оказывая влияния на отношение ATP/ADP, достигаемое в состоянии 4. При pH 8,0 разобщитель (FCCP) в низкой концентрации индуцирует гидролиз ATP, аккумулированного в состоянии 4, в то время как полное разобщение приводит к быстрой инактивации ATPазы. При pH 7,0, не наблюдали обращения ATP-синтазной реакции под действием разобщителя. Показано, что отношение ATP/ADPPi, поддерживаемое в состоянии 4, не уравновешено генерируемой дыханием протондвижущей силой. Обсуждаются возможные механизмы кинетического контроля и однонаправленной работы Fo∙F1-ATP синтазы. [1] Grivennikova, V.G., Gladyshev, G.V., Vinogradov, A.D. Allosteric nucleotide-binding site in the mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase (respiratory complex I). FEBS Lett. (2011) 585, 2212-2216 [2] Sled V.D. and Vinogradov A.D. Kinetics of the mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase interaction with hexammineruthenium (III). Biochim. Biophys. Acta (1993) 1141, 262-268. [3] Gavrikova E.V., Grivennikova V.G., Sled V.D., Ohnishi T., Vinogradov A.D. Kinetics of the mitochondrial three subunit NADH dehydrogenase interaction with hexammineruthenium (III). Biochim. Biophys. Acta (1995) 1230, 23-30. [4] Zharova T.V., Vinogradov A.D. ATPase/synthase activity of Paracoccus denitrificans Fo•F1 as related to the respiratory control phenomenon. Biochim. Biophys. Acta (2014) 1837, 1322-132)