| Результаты этапа: Рецептор нейротрофических факторов р75 является перспективной мишенью при нейродегенеративных заболеваниях, что показано на нескольких мышиных моделях. Однако, поскольку физиологическая значимость и механизм активности p75 пока не установлены, то р75-направленная терапия может иметь и серьёзные побочные эффекты. В рамках данного проекта было изучено взаимодействие p75 с новым вероятным посредником p75 - эфриновым рецептором EphA2. Обнаружено, что p75 влияет на димеризацию и подвижность EphA2 на плазматической мембране (ПМ) живых клеток. Экспрессия p75 увеличивает подвижность EphA2 примерно вдвое, а его стимуляция нейротрофическим фактором или олигомеризация антителами снижает подвижность EphA2 до уровня ниже исходного. Также показано, что экспрессия p75 снижает относительное содержание димеров EphA2 в отсутствии стимуляции. Путем внесения точечных замен в рецепторы p75 и EphA2 были установлены основные структурные элементы, необходимые для данного типа взаимодействия. Так, влияние р75 отсутствовало при удаление PDZ-домен связывающего мотива на C-конце или при блокировки липидной модификации пальмитиновой жирной кислотой примембранного домена за счет замены Cys279 на аланин. EphA2 оказался не чувствительным к воздействию p75 при замене трех катионных аминокислот (K563А+R566А+R568А) в примембранном домене. Известно, что катионные аминокислоты и модификация пальмитиновой жирной кислотой являются сигналами локализации в липидных рафтах, что указывает на участие липидных рафтов во взаимодействии р75 и EphA2. Можно предположить, что p75 вытесняет EphA2 из липидных рафтов, что увеличивает его подвижность и снижает относительное число димеров. Известно, что содержание липидных рафтов на ПМ ограничено анионными липидами в частности фосфатидилсерином. Стимуляция р75, по-видимому, приводит к его диссоциации из липидных рафтов и высвобождению фосфатидилсерина, который образует новые липидные рафты обогащенные уже EphA2. Большее сродство p75 к липидными рафтам может объясняться наличием липидной модификации и его связью с цитоскелетом посредством PDZ домена, поскольку липидные рафты тоже интенсивно взаимодействуют с цитоскелетом.
Было изучено влияние p75 на активность EphA2 и его экспрессию на поверхности клетки. Так, было показано, что активация EphA2 происходит даже без стимуляции эфрина если уровень его экспрессии достаточно высок. Эта спонтанная активация приводит к деградации рецептора в лизосомах и потере клеткой чувствительности к эфрину. При наличии p75 также наблюдается спонтанная активация EphA2, но клетки сохраняют чувствительность к эфрину. Было установлено, что при этом происходит интернализация EphA2, но он не попадает в лизосомы, а скапливается в примембранных везикулах. Стимуляция эфрином вызывает слияние этих везикул с ПМ в течение 2-3 мин и последующую активацию содержащегося в них EphA2. Эти данные указывают на то, что р75 перенаправляет внутриклеточный транспорт EphA2 и уберегает EphA2 от деградации вследствие его спонтанной активации. Также это указывает на возможный механизм участия р75 в патогене болезни Альцгеймера, поскольку помимо EphA2 в примембранных везикулах скапливается патогенный амилоидный пептид A, который может выбрасываться во внеклеточное пространство при стимуляции клеток. |
