ИСТИНА

Вирусное инфицирование – многостадийный процесс, обеспечивающий как проникновение вирусного генома внутрь клетки, так и морфогенез дочерних вирионов. М1 белок вируса гриппа – мажорный белок, играющий круциальную роль во многих аспектах репликации вируса. Согласно общепринятой модели вирусной сборки М1 белок внутри вириона ассоциирован с мембраной и слой белка стабилизирован рядом белок-белковых и липид-белковых взаимодействий. На ранних стадиях инфицирования в результате белок-липидных трансформаций происходит деполимеризация слоя М1 белка, что делает возможным выход вирусных РНК в цитоплазму клетки. Однако структурный аспект всех этих взаимодействий изучен явно недостаточно. Что тормозит наше продвижение в понимании процессов молекулярных перестроек в вирионе, приводящем к инфицированию клеток? Во-первых, отсутствие детальной структурной информации об in situ пространственной организации полноразмерного белка М1 в составе вириона, а, значит, и отсутствие корректных представлений об участках мономеров белка М1, ассоциированных с вирусной мембраной. Во-вторых, крайне слабо изучена структурно-функциональная роль взаимодействий М1-М1, М1-НА, М1-НА-липидная мембрана в формировании функционально компетентных вирионов. И наконец, тот факт, что белок М1 является ключевой адаптерной молекулой между вирусными белками и компонентами клетки хозяина в процессе вирусной репликации, взаимодействие между которыми еще очень слабо изучено. Проект направлен на решение следующих трех основных задач. Во-первых, это изучение структурных особенностей белка М1, определяющих его полифункциональность. Мы придаем высокую значимость поиску и изучению у белка М1 участков, которые могут пространственно трансформироваться в процессе жизненного цикла вируса и обеспечивать ключевые роли во многих аспектах вирусной репликации. Мы планируем также наладить гетерологичную экспрессию белка М1 в Е. coli и далее использовать сайт-направленный мутагенез гена белка М1 с внесением изменений в проблемной области (с 154 по 174 аминокислотный остаток) с последующим изучением влияния произведенных изменений на возможность кристаллизации и проявление специфических активностей белка. Вторая задача непосредственно связана с изучением функционального ассоциативного комплекса между М1 белком и его функциональным партнером, неструктурным вирусным белком NS2, имеющим сигнал ядерной локализации. Постулируется, что формирование этого комплекса определяет экспорт из ядер инфицированных клеток вновь синтезированных РНП-частиц для сбора дочерних вирионов. Третья задача связана с исследованием тонких взаимодействий матриксного белка М1 с липидным бислоем. С этой целью мы планируем постановку экспериментов с использованием плоских мембраноподобных моделей, так называемых бицелл, предполагаем исследовать поверхностную полимеризацию белка М1 в растворе и на различных подложках. И наконец, на примере уже полученного в России так называемого холодо-адаптированного штамма вируса гриппа с мутацией в одном их холестерин связывающих консенсусов белка М1, мы планируем изучить его базовые характеристики, такие как способность к сборке вирионов, почкование, инфекционность и другие особенности в сравнении с природным штаммом вируса гриппа.

1. Изучены холестерин связывающие консенсусы матриксного белка М1 вируса гриппа и их роль в структурной организации вирусной рафтовой мембраны. Выявлено шесть участков, соответствующих формуле «холестерин-распознающего» консенсуса и показана амфипатическая природа альфа-спиралей. Генерированы 7 мутантов вируса гриппа, имеющих в отличие от дикого типа вируса A/WSN/33 филаментозную морфологию и проявивших значительные отклонения в отношении M1/NP. Предложена гипотеза, объясняющая амфитрофные свойства белка М1 и его рафт/холестерол связывающий потенциал. 2. Подобраны условия получения и очистки из рекомбинантного химерного белка, представляющего собой МС-фрагмент белка М1 вируса гриппа А, слитый с бета-галактозидазой, МС-фрагмента. Отмечена высокая степень неспецифического химического расщепления по связям Асп-Про рекомбинантного белка. Проведено изучение ф/х свойств МС-фрагмента, что позволило подтвердить его большую разупорядоченность (гибкость) в сравнении с компактным NM- фрагментом белка М1. 3. Продолжено изучение механизма образования и дезинтеграции слоя матриксного белка М1, контролируемого рН, методами рефрактометрии поверхностного плазмонного резонанса и атомно-силовой микроскопии. Предложена гипотеза, объясняющая механизм дезинтеграции слоя М1 белка как результат электростатического отталкивания между молекулами М1 белка вследствие увеличения их заряда при закислении. 4. Продолжено изучение роли пост-трансляционной модификации гликобелков оболочечных вирусов высшими жирными кислотами (S-ацилирования) в жизненном цикле вируса. Для идентификации молекулярного сигнала, определяющего предпочтительное присоединение стеарата, расположенного на границе мембраны, проанализирован ряд рекомбинантных вирусов. Впервые показано, что локализация сайта ацилирования, является решающим фактором для присоединения стеарата 5. Для получения препаративных количеств белка NEP, а также проведения экспериментов по сайт-специфическому мутагенезу, был использован специально сконструированный экспрессионный вектор с геном белка NEP, содержащим на 3’-конце His(6) модуль. Введение целевых мутаций в ген осуществляли методом ПЦР. Белок природной структуры, а также его мутантные варианты экспрессировали в клетках E.coli ER1821. Отработана методика выделения и очистки белка из телец включения.