ИСТИНА

Целью проекта является разработка и характеристика эффективной системы комплексного скрининга посевного картофеля, обеспечивающей высокопроизводительный мультипараметрический контроль основных фитопатогенов вирусной, вироидной и бактериальной природы. Актуальность данной разработки определяется значительными потерями отечественного сельского хозяйства, обусловленными болезнями картофеля. Данный фактор приводит к снижению урожайности на 10-25%, а при эпифитотиях – до 80%. Учитывая возможность быстрого распространения инфекции в полевых условиях (например, для возбудителей, передаваемых насекомыми), крайне важно предельно минимизировать долю пораженных растений в посевном материале. С учетом распространенности, контагиозности и негативных последствий заражения выделяют десять приоритетных для картофелеводства в России патогенов, которые должны контролироваться в посевном материале. Существующие на сегодняшний день аналитические методы характеризуются трудоемкостью, методической сложностью, необходимостью значительных расходов как на реагенты, так и на приборное обеспечение. В связи с этим крайне востребовано создание новых методов, позволяющих проводить высокопроизводительное тестирование, одновременно и с высокой чувствительностью контролируя наличие в посевном картофеле всех основных фитопатогенов. Реализация такого аналитического метода обеспечит его конкурентный потенциал, возможность широкого практического применения и, благодаря этому – значительное повышение урожайности при выращивании картофеля. Научная новизна разработки основывается на сочетании при контроле фитопатогенов принципа иммунохроматографического анализа и оригинальных дополнительных методических решений, направленных на существенное повышение чувствительности и производительности тестирования. Метод иммунохроматографии обеспечивает экспрессность проведения анализа при минимальной пробоподготовке, отсутствии дополнительных реагентов и манипуляций с предподготовленным тестом, простоту детектирования результатов анализа. Все реагенты, необходимые для формирования детектируемых комплексов, предварительно наносятся на мембранные компоненты тест-полоски, контакт которой с тестируемой пробой (растертом в соответствующем растворе биоматериале – пробах листьев, клубня или стебля картофеля) инициирует движение жидкости вдоль тест-полоски под действием капиллярных сил. В ходе этого движения происходят специфические иммунные взаимодействия с потенциально содержащимся в пробе фитопатогеном, приводящие к формированию на определенных участках тест-полоски комплексов, содержащих иммунореагенты и окрашенную метку, наличие которой (отражающее наличие в пробе патогена) может контролироваться визуально, а интенсивность окрашивания (отражающая его содержание) - с помощью автономных портативных фотометрических детекторов, включая оптику бытовых коммуникационных устройств. Высокая чувствительность иммунохроматографического анализа в предлагаемых системах (обеспечивающая снижение предела обнаружения на один-два порядка) будет достигаться благодаря использованию предложенных авторами проекта оригинальных методических решений, включающих амплификацию сигнала а) при последовательном аффинном связывании нескольких нанодисперсных маркеров либо б) при независимой регистрации множественных вторичных маркеров, вымываемых из комплекса иммунореагентов с первичным маркером, в) разделение повторяющихся детерминант – компонентов вирусных и бактериальных антигенов – с их последующей независимой иммунодетекцией и др. На скрининговой стадии обследований для одновременного контроля большого числа фитопатогенов будут использоваться конъюгаты нанодисперсных окрашенных маркеров со смешанными препаратами антител разной специфичности, а на стадии подтверждающего тестирования – принцип двумерной иммунохроматографии, предполагающий формирование на тест-полоске упорядоченного массива зон связывания с иммунореагентами разной специфичности. Кроме того, для эффективного практического применения разрабатываемых тест-систем будут реализованы ранее предложенные заявителями подходы (успешно апробированные во внедренных в практику иммунохроматографических тестах для контроля других соединений), обеспечивающие воспроизводимость результатов анализа, высокую стабильность тест-систем при хранении. Исследования, которые планируется провести в 2016-2018 гг., должны будут обеспечить обоснованный выбор наиболее эффективных методических решений для анализа фитопатогенов картофеля, определить требования к компонентам тест-систем и протоколам их получения, а также к режимам проведения тестирования (включая порядок проведения высокопроизводительного неавтоматизированного тестирования большого количества проб). Будет охарактеризована аффинность и специфичность имеющихся у заявителей и коммерчески доступных антител для детекции приоритетных патогенов картофеля, сопоставлены аналитические возможности различных маркеров, используемых в иммунохроматографии. Особое внимание будет уделено получению реагентов для специфической иммунодетекции вироида веретеновидности клубней картофеля, который в силу отсутствия белковой оболочки не может быть использован как иммуноген в стандартных схемах иммунизации. Закономерности формирования специфических иммунных комплексов, их состав и реакционная способность будут изучаться с использованием комплекса современных методов, включающих просвечивающую электронную микроскопию, различные варианты атомно-силовой микроскопии, высокоразрешающую просвечивающую электронную микроскопию и сканирующую электронную микроскопию, биосенсорную регистрацию аффинных взаимодействий на основании измерений поверхностного плазмонного резонанса. Установленные в ходе этих исследований количественные закономерности позволят не только аргументированно выбрать оптимальные комплектации тест-систем и протоколы проведения анализа, но и предложить универсальные алгоритмы характеристики иммунореагентов, применимые для других иммуноаналитических систем (как при расширении панели контролируемых фитопатогенов, так и при решении других диагностических задач в медицине, ветеринарии, контроле потребительской продукции, экологическом мониторинге). Выбор технологических решений, наиболее эффективных при последующем серийном производстве тест-систем, будет производиться с учетом имеющегося у заявителей опыта по созданию и внедрению в практику средств иммунодиагностики. В состав исполнителей проекта входят авторы более чем 40 статей в международных журналах по разработке и характеристике иммунохроматографических тест-систем, лауреат Премии Правительства РФ 2010 года в области науки и техники за создание и внедрение в отечественную практику новых биотехнологических методов анализа. Экспериментальные серии тест-систем будут изготавливаться с использованием полупромышленного и промышленного оборудования, обеспечивающего унификацию процедур нанесения иммунореагентов на носители и их стабилизации, а также формировании тест-полосок. Характеристика предлагаемых технологических решений будет проводиться с учетом оценки их реализации малым предприятием, основанным организацией- заявителем и специализирующимся в области производства средств иммунодиагностики. Такой непосредственный учет практических требований в рамках проекта позволит оперативно перейти к технологизации и коммерциализации его результатов. Для доказательной проверки диагностической эффективности разрабатываемых тест-систем проект будет выполняться с привлечением специалистов из ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха, имеющих многолетний опыт мониторинга заболеваний картофеля с использованием различных аналитических методов, а также располагающих полевой базой и контактами для формирования широких репрезентативных выборок, необходимых для доказательных испытаний и сравнительной характеристики разрабатываемых тестов. Проект будет включать апробацию создаваемых тест-систем с использованием панелей проб из разных регионов РФ, что также повысит информативность и практическую значимость результатов проводимых испытаний.

The aim of this project is the development and characterization of an effective system of comprehensive screening of seed potatoes that will provide high-performance, multiparametric monitoring of the main plant pathogens of viral, viroid, and bacterial origin. The urgency of this development is underscored by a significant loss in national agriculture caused by potato diseases, which lead to 10–25% reduced yields and up to 80% for epiphytotic diseases. It is essential to minimize the percentage of infected plants in the inoculum due to the potential for the rapid spread of infection in the field (for example, for pathogens transmitted by insects). Given the prevalence, contagiousness, and negative effects of the infection, ten priority potato pathogens in Russia are represented in this proposal that should be monitored in the inoculum. At present, existing analytical methods are characterized by being labor-intensive and methodically complex, and involve substantial expenses in terms of reagents and instrumentation. In this regard, the development of new methods that will allow for both high-performance testing and high sensitivity by controlling the presence of main potato phytopathogens in plants is greatly needed. The implementation of this analytical method will ensure its competitive and practical potential and consequently lead to a significant increase in potato cultivation and yields. The scientific novelty of this approach is based on a combination of the principle of lateral flow immunoassay and original methodological solutions aimed at significantly increasing sensitivity and testing performance while controlling plant pathogens. Lateral flow assays provide rapidity of analysis with minimal sample preparation, no additional reagents and manipulations with prepared tests, and ease of results detection. All reagents needed to form detectable complexes are previously applied to the membrane components of the test strip, the contact of which with the test sample (the appropriate biomaterial extract – samples of leaves, tubers, or potato stems) initiates the movement of the liquid along the strip by capillary forces. During this movement, specific immune reactions can occur with phytopathogens potentially contained in a sample. This leads to the formation of colored complexes containing immunoreagents in certain areas of the test strip. The colored label (whose presence can be monitored visually) reflects the presence of the pathogen in the sample, and the intensity of staining reflects its content via autonomous portable photometric detectors, including optics of consumer communication devices. The high sensitivity of the lateral flow assay in the proposed system, which will ensure reduction of the detection limit by one or two orders of magnitude, will be achieved through the use of original methodological solutions proposed by the project authors, including signal amplification, in the following ways: (1) sequential affine binding of several nanodispersed labels (2) the registration of multiple secondary labels eluting from the primary label (3) the separation of spatially repeating determinants (components of viral and bacterial antigens) and their subsequent independent immunodetection, etc. The conjugates of nanodispersed colored labels with mixed antibodies of different specificities will be used at the screening stage survey to simultaneously control a large number of plant pathogens. The principle of two-dimensional immunochromatography, which involves the formation of the test strip with an ordered array of immunoreagents of different binding specificities, will be used at the confirmatory testing stage. Furthermore, for the effective practical application of the developed test systems, previously proposed approaches (that have proven successful when embedded in practice lateral flow tests for the control of other compounds) that ensure the reproducibility of analytical results and high stability of test systems upon storage will be implemented by the applicants. Studies planned for 2016–2018 must provide a reasonable selection of the most effective methodological solutions for the analysis of potato plant pathogens and determine the requirements for test system components, preparation protocols, and modes of testing, including non-automatized procedures for high-performance testing of a large number of samples. Commercially available antibodies (as well as those obtained by the applicants) used to detect the priority of potato pathogens will be characterized by their affinity and specificity, and the analytical capabilities of the various labels used in the immunoassay will be compared. Special attention will be paid to producing the specific reagents for Potato spindle tuber viroid immunodetection. Due to its lack of a protein shell, the Potato spindle tuber viroid cannot be used as an immunogen in standard immunization protocols. Regularity of specific immune complexes’ formation in terms of their structure and reactivity will be studied using a complex of modern techniques, including transmission electron microscopy, various types of atomic force microscopy, high-resolution transmission electron microscopy and scanning electron microscopy, and biosensor registration of affine interactions based on surface plasmon resonance measurements. Quantitative regularities estimated during these studies will not only facilitate the selection of an optimum configuration of test systems and assay protocols, but will also offer universal algorithms for immunoreagent characteristics suitable for other immunoassay systems, both for expanding the controlled plant pathogens panel and for solving other diagnostic tasks in medicine, veterinary medicine, consumer product control, and environmental monitoring. The choice of technological solutions that will be the most effective in the subsequent mass production of test systems will be carried out based on the applicant’s experience in the creation and implementation of immunodiagnostic means and practices. Project researchers include the authors of more than 40 articles in international journals on the development and characterization of immunochromatographic test systems, including the winner of the Russian Federation National Awards in Science and Technology in 2010 for the creation and implementation of biotechnological methods of analysis in national practice. An experimental series of test systems will be manufactured with the use of semi-industrial equipment to ensure harmonization of the procedures of immunoreagents application on carriers and their stabilization as well as the formation of test strips. To characterize the proposed technological solutions, we plan to involve the small enterprise that based on the applicant’s organization is specializing in the production of immunodiagnostic kits. Such a direct view of the practical requirements of the project will move quickly toward technologizing and commercializing its results. The diagnostic efficacy of the developed test systems will be implemented with the involvement of experts from A.G. Lorch All-Russian Potato Research Institute, who have had many years of experience monitoring potato diseases via various analytical methods. This institute also has a field base and contacts with agricultural manufacturers to form a broad representative panel of sample for validation of the developed tests. The project will include the approbation of established test systems using samples from different regions of Russia, which will also increase the information content and practical significance of the studies.