ИСТИНА

Разработать, апробировать и применить методику зондирования степени компактизации ДНК в хроматине клеточного ядра на основе спектроскопии комбинационного рассеяния света (КР) в низкочастотном (НЧ) диапазоне (от 10 до 200 см–1).

DNA plays a vital role in the life of all organisms, ensuring the provision and transmission of hereditary information. In eukaryotic cells, DNA molecules with a total length of over a meter are enclosed in a nucleus with a diameter of several micrometers, i.e. DNA is highly compacted.Compactization occurs largely due to the adsorption of DNA molecules on histone proteins. The structure formed in this way is called chromatin. At the same time, in different regions, the chromatin (and, accordingly, DNA) compaction changes depending on whether genes should be expressed and other important cellular processes, such as DNA replication and repair, should occur in them. Since the existence and functioning of cells, tissues and organs, and therefore the health of the body, depend on the correct and timely implementation of genes into proteins, the study of DNA compaction in the nucleus is important both in fundamental scientific and applied senses. Despite many years of intensive research, there is no clear understanding of the structure of the cell nucleus, in particular about the relationship between the micro- and nanostructures formed by chromatin (with varying degrees of DNA compaction) and the functioning of the cell. Accordingly, the study of this structure and its dynamics, as well as the factors influencing their change, is very relevant. It is planned in the Project to develop, test and apply a method for probing the degree of compaction of the DNA in the chromatin of the cell nucleus based on Raman spectroscopy in the low frequency (LF) range (from 10 to 200 cm–1). The method is based on the fact that DNA compaction is associated with dynamic disorder—the intensity of thermal fluctuations in atomic positions. Dynamic disorder, in turn, determines the intensity of LF Raman spectra, as we recently showed for molecular crystals and nucleic acid molecules. As a result, a method for assessing DNA in chromatin compaction in the cell nucleus will be developed based on LF Raman spectroscopy. The new method will make it possible to determine chromatin compaction in the cell nucleus directly, in contrast to the indirect methods currently used, which actually determine the distribution of the added dye or fluorophore, and will not require the preliminary introduction of additional substances into the cell. The method will be tested on model objects: DNA-protein complexes and mixtures of DNA with proteins and lipids. Finally, it will be applied to monitor chromatin compaction in the cell nuclei of various cells. The non-invasive method proposed in the Project will be a logical continuation of the development of advanced approaches to microspectroscopy of biological objects in the last decade and will be a world-class result. It is expected that it will contribute to obtaining new data on the structural and functional organization of the cell nucleus, incl. about micro- and nanostructures formed by chromatin, as well as its dependence on conditions and processes occurring in the cell. Such data are extremely important for biophysics, physical chemistry, molecular and cellular biology. The technique can be extended to other complex molecular systems, such as polymer composites, which will contribute to the development of materials science. In addition, the results obtained can contribute to the development of various fields of medicine, incl. oncology, cardiology, embryology and immunology, since they can shed light on the microscopic mechanisms that determine the development and course of various diseases. Thus, the results of the project are extremely important from both a fundamental and practical point of view.

Главным ожидаемым результатом мирового уровня является развитая методика зондирования компактизации ДНК в хроматине клеточного ядра с помощью НЧ КР-микроспектроскопии. Новая методика позволит определять компактизацию ДНК напрямую, в отличие от используемых в настоящее время косвенных методов, определяющих фактически распределение добавляемого красителя или флуорофора. Кроме того, она будет малоинвазивной, поскольку не требует введения в клетку дополнительных веществ. Разработанная методика станет логичным продолжением развития передовых подходов микроспектроскопии и может иметь широкое применение для научных исследований в области молекулярной и клеточной биологии и биофизики, что обусловливает научную значимость проекта. В частности, методика позволит получить новую информацию о структуре хроматина в ядре (которая до сих пор является предметом интенсивных исследований, см. п. 4.5) и отслеживать in vivo влияние на эту структуру различных факторов (например, температуры, окислительного стресса, стресса голодания, лекарств). Полученные с помощью такой методики результаты могут способствовать существенному усовершенствованию широкого спектра медицинских технологий, в частности, в области онкологии, эмбриологии и иммунологии, что обусловливает общественную значимость результатов проекта. Кроме того, ожидается, что впервые будут: 1. Проведена НЧ КР микроспектроскопия клеточных органелл. Результат важен для развития КР-микроспектроскопии и клеточной биологии. Полученные спектры будут служить дополнением к данным высокочастотной (ВЧ) КР-микроспектроскопии, которая активно применяется в клеточной биологии. 2. С помощью НЧ КР-картирования получена карта компактизации ДНК в ядре клеток при их делении (митоз) и между делениями (интерфаза). Данный результат позволит улучшить понимание клеточных процессов. 3. С помощью НЧ КР-картирования определена компактизация ДНК в ядрах поврежденных клеток. Данный результат покажет возможность отслеживания влияния факторов стресса на структуру хроматина с помощью предложенного подхода.

1. Разработан подход для оценки динамического беспорядка с помощью НЧ спектроскопии КР в органических полупроводниках (ОП). А именно, выявлена связь интенсивностей КР колебательных мод с их вкладом в локальное и нелокальное электрон-фононное взаимодействие. Показано, что относительная интенсивность НЧ КР может быть использована для оценки динамического беспорядка. На основе полученных результатов предложен метод скрининга ОП с низким динамическим беспорядком и, как следствие, потенциально высокой подвижностью заряда. 2. Впервые получены спектры комбинационного рассеяния двух некодирующих РНК - транспортной РНК и рибосомной РНК (в составе рибосомы), а также проведено их сравнение со спектром ДНК. Показано, что НЧ КР может быть использовано для оценки компактности нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), отвечающих за важнейшие функции по хранению, передаче и реализации генетической информации.   3. Выявлено, что при изменении компактности молекул ДНК и РНК, интенсивность НЧ области КР спектров изменяется: в более компактных образцах интенсивность НЧ области КР спектров меньше, чем в менее компактных. В качестве образцов ДНК выступала нативная ДНК и резаная ДНК, которая обладает более компактной формой 5. Предварительные измерения показали, что в существенной части клетки HeLa в спектре НЧ КР имеется ярко выраженный пик на 30 см-1, соответствующий колебанию пи-стэка нуклеотидов, в то время как в других точках такой пик не виден на фоне сильного низкочастотного широкополосного сигнала. 9. Проведено моделирование транспорта носителей заряда по молекулам РНК (тРНК и фрагменты рибосомы). Выдвинуто предположение о биологической роли транспорта заряда в процессе трансляции (синтезе белка на рибосоме). Результаты представлены в работах 14. Осуществлено ВЧ КР-картирование тончайших 2D-монокристаллов — монослоев органических полупроводников, и с его помощью обнаружено наличие субмонослоя — аморфного материала между кристаллическими доменами

Первый год выполнения проекта: 1. Рассчитаны и сопоставлены вклады в интенсивность НЧ области спектра колебательных движений участков молекул белков, липидов и нуклеиновых кислот. 2. Зарегистрированы КР спектры ДНК-белковых комплексов и смесей ДНК с разичными белками и липидами, с помощью дескриптора R установлена компактизация ДНК в них. Развита методика определения компактизации ДНК в составе хроматина. 3. Зарегистрирован массив КР спектров в разных точках нативных интерфазных клеток типа Hela с разрешением 0.5 мкм, для каждой клетки получено около 10000 КР спектров. На основе анализа полученных КР спектров в разных точках клеток апробирована методика определения компактизации хроматина в клетках. 4. Оптимизировано программное обеспечение для более удобной, быстрой и надёжной обработки массива данных КР картирования, включающего порядка 10000 спектров. 5. Подготовлено 2 статья и отчёт, результаты представлены на российских и/или международных конференциях. Второй год  выполнения проекта: Проведено КР-картирование ядер нативных интерфазных клеток. Установлена компактизация ДНК в разных участках хромосом с помощью анализа относительной интенсивности НЧ области спектров КР (дескриптора R, см. ур. (4)). Данный результат является результатом мирового уровня. 2. По данным КР-картирования ядер клеток, находящихся в разной стадии митоза установлена компактизация ДНК в разных стадиях митоза и в разных участках хромосом с помощью анализа относительной интенсивности НЧ области спектров КР (дескриптора R). 3. Осуществлено НЧ КР-картирование интерфазных клеток, подвергнутым повреждению ДНК . Установлена количественно компактизация ДНК при воздействии факторов стресса. Соотнесены полученные значений дескриптора R со значениями дескриптора R для неповрежденных клеток. 4. Подготовлены 2 статьи и финальный отчёт, результаты представлены на российских и/или международных конференциях.