Исследование представленности неклассических миозинов I в Т-лимфоцитах человекаНИР

The representation of non-classical myosins I in human T lymphocytes

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 9 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Исследование представленности неклассических миозинов I в Т-лимфоцитах человека. Этап 1.
Результаты этапа: Миозины I класса представляют собой многочисленную группу одноголовых моторных белков, взаимодействующих с актином и мембранными фосфолипидами и участвующих в различных клеточных процессах, таких как изменение формы клеток, подвижность и инвазия, экзоцитоз и эндоцитоз. Большое количество членов данного класса, а также их неравномерное распределение в клетках и тканях человека затрудняют их изучение. Также это препятствует оценке их биомаркерного потенциала и их механистической роли в онкогенезе и других заболеваниях. Действительно, несмотря на появляющиеся данные об их мутациях и изменении количества в ряде опухолей и других заболеваний, большинство исследований рассматривают миозины I класса по отдельности или в группах из нескольких белков. Таким образом, вопрос об их избыточности и возможной функциональной замене игнорируется. В отчетном периоде мы одновременно оценили все восемь генов человеческого миозина I на клеточных линиях различного происхождения с помощью ре-анализа баз данных РНК секвенирования. Мы также описываем систему количественной ПЦР для скрининга человеческого миозина I и тестируем ее на наборе из более чем 35 перевиваемых клеточных линий, широко используемых в биомедицине и фундаментальных исследованиях. Полученные данные позволили уточнить тканеспецифичные ограничения экспрессии генов миозина I у человека. Выраженный паттерн наблюдался в иммунных клетках, в частности в Т-лимфоцитах. Далее возможно использование данной ПЦР-системы вместе с функциональной оценкой Т-клеток при их активации. Кроме этого, протокол неспецифической активации Т-клеток был разработан на перевиваемых клеточных линиях и воспроизведен на отсортированных популяциях Т-клеток периферической крови. Описываются метрики распластывания Т-клеток при активации. Эти данные предполагается сравнить с представленностью мРНК миозинов I класса, для оценки их роли в активации Т-лимфоцитов. Целью данного проекта является описание паттернов распространенности неканонических миозинов класса I в популяциях Т-лимфоцитов человека, а также формулировка гипотезы об их роли в активации и клеточной подвижности Т-лимфоцитов в норме и при Т-ОЛЛ. Несмотря на сложившиеся представления о тканеспецифичном распределении миозинов I и важной роли, которую каждый из них может играть в ремоделировании плазматической мембраны, их дифференциальная роль в активации и клеточной подвижности Т-лимфоцитов человека остается не до конца изученной. Передача сигнала через иммунные рецепторы и миграция по сложным паттернам являются основой нормального созревания и функционирования лимфоцитов, а нарушения этого процесса играют роль в развитии воспаления и онкогематологических заболеваний. Анализ участия миозинов I в организации клеточных мембран при активации и миграции различных популяций Т-лимфоцитов позволит лучше понять механизмы нормальной и патологической активации этих клеток и, таким образом, является важным для фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований. 1. Анализ представленности неклассических миозинов I в Т-лимфоцитах человека по открытым базам РНК секвенирования (RNAseq). Анализ данных РНК секвенирования in silico был выполнен для базы перевиваемых клеточных линий человека (GSE240542) в рамках разработки ПЦР-системы для анализа экспрессии миозинов I класса (гены MYO1A, MYO1B, MYO1C, MYO1D, MYO1E, MYO1F, MYO1G, MYO1H). Разнообразие представленных клеточных линий опухолевого и неопухолевого происхождения позволило нам выявить и сравнить паттерны экспрессии миозинов I в разных типах клеток человека, включая Т-лимфоциты: группа гематологических опухолей содержала основные модельные линии CD4+ и CD8+ Т-клеток человека: MOLT-4 и Jurkat. Аннотация к клеточным линиям, которые были использованы в in silico анализе, выполнялась вручную. Общее число клеточных линий, включенных в анализ, составило 66. Они были разделены на группы в зависимости от типа ткани, злокачественности/незлокачественности и предполагаемых метастатических свойств (линии, полученные из первичной опухоли vs. линии, полученные из дальних метастаз или метастаз в лимфатических узлах). Исходные данные RNA-seq были взяты из NCBI Sequence Read Archive (SRA) с помощью SRA Toolkit (v3.2.1) и преобразованы в формат FASTQ. Проверка качества и удаление адаптеров были выполнены с использованием fastp (версия 1.0.1). Количество транскриптов подсчитывалось при сравнении с референсным геномом человека GRCh38.p14 с использованием аннотации GENCODE Release 47. Выравнивание ридов проводилось при помощи STAR (версия 2.7.10). Специфичность по цепи оценивалась с помощью infer_experiment.py из пакета RSeQC (версия 5.0.4). Количество считываний для генов было получено с помощью featureCounts (версия 2.1.1). При анализе данных и построении графиков значения ТРМ для генов миозинов I класса были log2-трансформированы. Общая представленность и вариабельность миозинов I класса в выборке позволила выделить распространенные и малораспространенные миозины. К первой группе относятся гены MYO1B, MYO1C, MYO1D, MYO1E, экспрессированные на высоком уровне в большинстве клеточных линий. Ко второй группе относятся гены MYO1A, MYO1F, MYO1G, MYO1H. Гены MYO1A, MYO1F, MYO1G экспрессируются на высоком уровне в малом количестве клеточных линий, а ген MYO1H не экспрессируется на высоком уровне ни в одной клеточной линии (Дополнительные материалы к отчету, Рисунок 1, Рисунок 2А). Согласно первичной аннотации, 66 анализируемых клеточных линий были разделены на: 1) неопухолевые клетки; 2) карциномы; 3) фибромы/саркомы; 4) гематологические опухоли; 5) нейро-/глиобластомы (Дополнительные материалы к отчету, Рисунок 2Б). Для этих вариантов клеточных линий был проведен многомерный анализ экспрессии восьми генов миозинов I класса, значения ТРМ для генов были log2-трансформированы. В качестве метода снижения размерности при первичном анализе использовался UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection), результаты представлены на Рисунке 2В (Дополнительные материалы к отчету). UMAP-анализ на основе экспрессии восьми генов миозинов I класса выявил, что этих восьми генов достаточно для обособления группы, относящейся к клеточным линиям гематологических опухолей. Остальные группы образцов не обособлялись друг от друга. Интересно, что полнотранскриптомный UMAP-анализ также позволил обособить только их (Дополнительные материалы к отчету, Рисунок 3), остальные группы образцов обособлялись друг от друга слабо. Для описания паттернов экспрессии индивидуальных генов миозинов I класса в 66 клеточных линиях была составлена тепловая карта для log2-трансформированных значений ТРМ восьми генов миозинов I класса. Была проведена кластеризация образцов и генов миозинов по Уорду, результаты представлены на Рисунке 4 (Дополнительные материалы к отчету). Гены миозинов кластеризовались на две группы: распространенные (MYO1B, MYO1C, MYO1D, MYO1E) и малораспространенные (MYO1A, MYO1F, MYO1G, MYO1H) миозины. Исследованные клеточные линии, как ожидалось, сформировали два кластера (С1 и С2). Кластер С2 включал почти все гематологические клеточные линии, за исключением HAP-1 и RPMI-8226. Кластер С1 включал все остальные клеточные линии. Отличительной чертой кластера клеток гематологических опухолей (кластер C2 по сравнению с С1) является сниженная экспрессия генов группы распространенных миозинов (MYO1B, MYO1C, MYO1D, MYO1E), а также относительно повышенная экспрессия генов малораспространенных миозинов MYO1F и MYO1G. При этом собственно Т-клетки (Jurkat, MOLT-4) демонстрировали исключительно повышение экспрессии MYO1G, а не MYO1F. Таким образом, специфичность паттерна экспрессии миозинов I класса, отличная от других типов клеток, была подтверждена для иммунных клеточных линий человека, включая распространенные модельные Т-клеточные линии. В настоящее время проводится подтверждение полученных данных для неопухолевых Т-клеток человека, а также сравнение неопухолевых Т-клеток с клетками Т-ОЛЛ. 2. Разработка ПЦР-системы для анализа экспрессии миозинов I методом ПЦР в реальном времени. Наборы праймеров и зондов для каждого из восьми генов семейства миозинов I класса человека были написаны в соответствии со стандартными рекомендациями. Для оценки температур плавления олигонуклеотидов и отсутствия стабильных вторичных структур было использовано программное обеспечение Oligo Analyzer версии 1.0.3 (OligoSoftware, Куопио, Финляндия), а отсутствие неспецифичной амплификации проверялось с помощью онлайн-инструмента Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Все олигонуклеотиды были произведены компанией «ДНК Синтез» (Москва, Россия). Описания праймеров и зондов, включая идентификаторы генов, последовательности и температуры плавления, приведены в Таблице 1 (Дополнительные материалы к отчету). Для экспериментальной валидации полученных праймеров и зондов и сравнения данных ПЦР с данными транскриптомного анализа была проанализирована панель из 35 клеточных линий человека, включающая неопухолевые клеточные линии, карциномы различного происхождения и гематологические опухоли (включающие линии Т-ОЛЛ: Jurkat, MOLT-4, СЕМ/С1). Все клетки культивировались при 37°C в присутствии 5% CO2. Все 8 суспензионных клеточных линий, включая В-клетки (Raji, RPMI-8866), Т-клетки (Jurkat, MOLT-4, CEM/C1), моноциты (THP-1) и миелоидные клетки (HL-60, K-562) культивировались в среде RPMI-1640 с 10% FBS, 2 mM L-глутамином, 100 U/mL пенициллина/стрептомицина (ПанЭко, Москва). Прикрепленные клеточные линии неопухолевых клеток человека (Wi38, HEK293), а также карцином кишечника (HT29, CaCO-2, HCT-116, SW480, SW837), легкого (A549, H1299, H460, H358), простаты (DU-145), яичника (SKOV3), молочной железы (MDA-MB-231, MCF-7), поджелудочной железы (PANC-1, Capan-2, MIAPaCa-2) культивировались в среде DMEM с 10% FBS, 2 mM L-глутамином, 100 U/mL пенициллина/стрептомицина (ПанЭко, Москва). Линия HBL-100 культивировалась в среде DMEM/F12 с 10% FBS, 2 mM L-глутамином, 100 U/mL пенициллина/стрептомицина (ПанЭко, Москва). Клеточные линии 6 карцином яичника (EFO-21, OVCAR-3, OVCAR-8), простаты (LnCaP), поджелудочной железы (AsPC1), молочной железы (T-47D), культивировались в среде RPMI-1640 с 15% FBS, 2 mM L-глутамином, 100 U/mL пенициллина/стрептомицина (ПанЭко, Москва). Линия MCF10A культивировалась в среде DMEM/F12 (Gibco, Thermo Fisher Scientific) с 5% лошадиной сыворотки (Hyclone, Cytiva), 100 ng/mL холеротоксина (Sigma-Aldrich), 20 ng/mL EGF (Sigma-Aldrich), 0.01 mg/mL инсулина (ПанЭко, Москва), 500 ng/mL гидрокортизона (Sigma-Aldrich) и 100 U/mL пенициллина/стрептомицина (ПанЭко, Москва). Линия RWPE-1 культивировалась в среде Keratinocyte-SFM (Gibco) с 50 ug/ml BPE (Gibco), 5 ng/ml EGF (Gibco) и 100 U/mL пенициллина/стрептомицина (ПанЭко, Москва). Из клеточных линий была выделена РНК и проведена обратная транскрипция. Нуклеиновые кислоты выделяли из 100 мкл каждой клеточной суспензии с помощью набора RIBO-prep (AmpliSens, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией производителя, далее выделенные НК обрабатывали ДНКазой Е (Evrogen, Москва, Россия) и повторно выделяли с помощью набора RIBO-prep. Полученную РНК хранили при температуре -70°C. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора для обратной транскрипции MMLV фирмы Evrogen (Москва, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Полученную кДНК использовали для ПЦР-анализа. Первичная проверка праймеров в отсутствии зондов проводилась при помощи ПЦР-РВ в присутствии красителя SYBR Green I (использовался коммерческий набор для ПЦР-РВ с SYBR Green I “Синтол”, Россия). Протокол реакции включал денатурацию (95°C, 3 мин), за которой следовали 39 циклов амплификации (95°C, 15 с; 58°C, 30 с; и 72°C, 40 с). Праймеры были подобраны под одинаковые температуры плавления (~60°C), температура отжига во всех реакциях была установлена на 58°C. Анализ проводился на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad). Образцы обрабатывали в трех технических повторностях. Для нормализации данных использовались гены UBC и YWHAZ. Для объединения данных по разным плашкам использовался один и тот же образец кДНК в качестве калибратора. Специфичность амплификации для каждого продукта подтверждалась анализом кривых плавления. Дополнительно, специфичность амплификации для каждого продукта подтверждалась электрофорезом в 2% агарозном геле. Электрофорез проводили в камере для горизонтального электрофореза (Хеликон, Россия) при постоянном напряжении 117 В в течение 30–40 минут в TAE-буфере (1X). Размеры амплифицированных фрагментов определяли путем сопоставления с положениями полос ДНК-маркера (Евроген, Россия). По результатам анализа, ген MYO1C амплифицировался во всех образцах, однако его экспрессия была значимо снижена в линиях гематологических опухолей. Низкоэкспрессируемые гены MYO1H и MYO1F не детектировались ни в одной линии анализируемой панели. Для остальных исследуемых генов (MYO1A, MYO1B, MYO1D, MYO1E, MYO1G) была подтверждена специфичная экспрессия: они детектировались в ряде клеточных линий и отсутствовали в других. Для дальнейшей оптимизации анализа всех генов миозина I была проверена мультиплекс-система количественной ПЦР в формате TaqMan с использованием зондов флуоресцентно меченых VIC или ROX. Анализируемые гены были объединены попарно, все праймеры и зонды для одновременной оценки экспрессии генов проверялись на отсутствие стабильных вторичных структур с помощью Oligo Analyzer версии 1.0.3 (OligoSoftware, Куопио, Финляндия). Для нормализации данных также использовались гены UBC и YWHAZ. В дуплексированной системе анализа оцениваемые гены были спарены следующим образом: YWHAZ+MYO1B, UBC+MYO1C, MYO1D+MYO1G, MYOF+MYOE, MYOA+MYOH. Амплификация проводилась с использованием коммерческого набора qPCRmix-HS (Евроген, Россия) температурный режим не отличался от реакции в присутствии SYBR Green I. Образцы обрабатывались в трех технических повторностях. Для объединения данных по разным плашкам использовался один и тот же образец кДНК в качестве калибратора. По результатам ПЦР-анализа были выявлены некоторые отличия от обработанных данных РНК-секвенирования. Так, экспрессия MYO1C в лейкоцитарных клеточных линиях при ПЦР-анализе была снижена сильнее – до околонулевых значений и полного отсутствия в некоторых образцах. В остальных образцах продукт детектировался на высоком уровне. Экспрессия гена MYOF отсутствовала во всех образцах выборки, включая лейкоцитарные клеточные линии, где экспрессия этого гена ожидалась. Предположительно, это может быть связано с уровнем активации лейкоцитов в культуре. Еще одним отличием являлся довольно высокий уровень экспрессии MYOA при ПЦР-анализе. Этот миозин считается редким, однако он детектировался в большом количестве образцов на невысоком уровне, а в трех клеточных линиях был критически повышен. Для клеточной линии СаСО-2 подобный результат совпадает с данными РНК секвенирования. Для двух других клеточных линий выясняются причины такого результата. Данные были визуализированы в виде тепловой карты (Дополнительные материалы к отчету, Рисунок 5). Для сравнения с данными РНК секвенирования, относительные нормализованные количества продукта, полученные при ПЦР-РВ, были log10-трансформированы и представлены в виде тепловой карты. Кластеризация образцов отличалась за счет наличия трех высоко экспрессирующих MYO1A клеточных линий и полного отсутствия во всех линиях MYO1F. Несмотря на эти различия, большая часть линий гематологических злокачественных новообразований, за исключением THP-1, K562 и Raji, была сгруппирована в обособленный подкластер (кластер C1_2_2), как и при анализе данных РНК секвенирования. Поиск линии, экспрессирующей MYO1F, был продолжен. По результатам скрининга в качестве положительного контроля экспрессии этого гена может использоваться линия легочных фибробластов hTERT, не включенная в общую тепловую карту (Дополнительные материалы к отчету, Рисунок 6). Поиск положительного контроля для MYO1H продолжается. Учитывая данные о его крайне малой представленности, возможно, что такую клеточную линию не удастся. Однако, для других генов удалось выявить как положительные, так и отрицательные по экспрессии клеточные линии, что в целом подтверждает специфичность паттернов экспрессии миозинов I класса. 4. Активация отсортированных Т-лимфоцитов крови in vitro; оценка ключевых метрик распластывания и подвижности; заморозка клеток на РНК; получение кДНК. Оценка ключевых метрик распластывания Т-клеток отрабатывалась и проводилась на перевиваемых клеточных линиях Т-лимфоцитов MOLT-4, Jurkat и CЕМ/С1, работа с которыми была запланирована в следующем отчетном периоде. Был отработан протокол неспецифической активации для клеток, высаженных на субстрат, их адгезии и распластывания. Для неспецифической активации Т-клеток использовали классические способы: форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) (в концентрации 50 нг/мл), или смесь PMA с иономицином в концентрации 25 нг/мл и 1 мкМ соответственно. В качестве тестируемых адгезивных субстратов были использованы полилизин в концентрации 0,05мг/мл, и фибронектин в концентрации 10мкг/мл. На покровные стекла наносили раствор полилизина D в концентрации 0,05мг/мл, инкубировали в течении часа при комнатной температуре, отбирали оставшийся раствор, промывали 3 раза MQ водой. Для покрытия стекол фибронектином использовали раствор 10 мкг/мл, добавляли 300 мкл на лунку 24-луночного планшета, инкубировали в холодильнике ночь. Убирали оставшийся раствор, промывали 3 раза PBS. В качестве контроля прикрепления использовали суспензионные клетки культуры моноцитов THP-1, для которых способность распластываться на данных субстратах была выявлена ранее. Клетки высаживались на стекла в концентрации 1х10^5 клеток на лунку 24 луночного планшета. Воздействие проводилось в течении 16-24 часов. Для анализа морфологии клеток клетки фиксировали 4% раствором ПФА. Проводили окрашивание актина при помощи флуоресцентно меченого фаллоидина, ядра докрашивали Hoechst33342. Съемку проводили на инвертированном микроскопе LCI, объектив х60/1.45. Было показано прикрепление и распластывание всех клеточных линий при неспецифичной активации. (Дополнительные материалы к отчету, Рисунки 7-10). Препараты пригодны для морфометрической оценки, обсчет метрик распластывания проводится в настоящее время. Для активации Т-лимфоцитов ex vivo было решено использовать РМА+йономицин, а также фибронектин, как наиболее физиологичный вариант субстрата. Из активированных и неактивированных клеточных линий была выделена РНК и получена кДНК для сравнения с Т-лимфоцитами периферической крови. Поставлены ПЦР-реакции на референтные гены, верифицировано качество препаратов кДНК. 3. Оценка иммунофенотипа и сортировка наивных/зрелых популяций Т-лимфоцитов крови человека ex vivo; оценка ключевых метрик распластывания и подвижности; заморозка клеток на РНК; получение кДНК. Сортировка Т-лимфоцитов ex vivo проводилась из периферической крови здоровых добровольцев. Периферическая кровь доноров (n=7) собиралась в пробирки BD Vacutainer CPT, с фиколлом (BD, США), образец центрифугировали при 2000g в течение 20 минут. Кольцо мононуклеаров собирали и отмывали PBS. После отмывки клетки подготавливали к сортировке: в пробирку на 10 млн клеток добавляли по 10 мкл антител - anti-CD4-FITC (OKT4, BioLegend), anti-CD3-APC (OKT3, BioLegend), anti-CD8a-PE (HIT8a, BioLegend). Ресуспендировали клетки на вортексе и инкубировали в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре. После инкубации клеткам добавляли 3 мл бессывороточной среды AIM V (ThermoFisher, США), центрифугировали при 750 g в течение 5 минут и сливали супернатант. Далее в пробирки добавляли 5 мл среды AIM V и сортировали клетки на сортере FACSAria SORP (BD Biosciences, США) с диаметром ноззла 85 мкм и соответствующими настройками давления в системе. Для получения фракций CD4+ и CD8+ Т-клеток оценивалась коэкспрессия CD3 и CD4 для CD4+ Т-клеток и коэкспрессия CD3 и CD8 для CD8+ Т-клеток (Дополнительные материалы к отчету, Рисунок 11). Отсортированные клетки в среде AIM V высаживались на лунки 24-луночного планшета – по 1 мл суспензии на лунку (около 100 000 до 125 000 клеток). В соответствии с протоколом, в качестве субстрата был использован фибронектин. В качестве неспецифического активатора использовали PMA + йономицин. Отсортированные клетки от 7 доноров инкубировались 6 часов в режиме цейтраферной съемки (фазовый объектив х20) на инвертированном микроскопе LCI с системой для прижизненной съемки. Выявлялась динамика их прикрепления и характер подвижности. Первые адгезии к субстрату наблюдались у СD8+ Т-лимфоцитов на 2 час инкубации. В точке «2 часа» клетки снимали с подложки для подтверждения экспрессии интегринов, как маркера Т-клетокчной активации и распластывания. Выделение РНК, и обратную транскрипцию проводили так же, как описывали выше. Экспрессию генов, кодирующих интегрины, определяли с помощью набора с SYBR Green I («Синтол», Россия). Протокол реакции включал денатурацию (95°C, 5 мин) и 39 циклов амплификации (95°C, 15 с; 58°C, 30 с; и 72°C, 40 с). Использованные последовательности праймеров были опубликованы ранее (Potashnikova DM, Saidova AA, Tvorogova AV, et al. CTLs From Patients With Atherosclerosis Show Elevated Adhesiveness and Distinct Integrin Expression Patterns on 2D Substrates. Front Med (Lausanne). 2022;9:891916). Для нормализации данных использовался ген UBC. Для объединения данных по разным плашкам использовался один и тот же образец кДНК в качестве калибратора. Для сравнения активированных и неактивированных Т-клеток был использован непараметрический критерий Вилкоксона. Различия считались статистически достоверными при уровне значимости p <0,05. Результаты представлены на Рисунке 12. Неспецифическая стимуляция Т-клеток с помощью PMA+йономицина на коротких сроках инкубации оказала эффект на экспрессию мРНК интегринов ITGB7 и ITGA1 в CD8+ Т-клетках и никак не повлияла на CD4+ Т-клетки. Таким образом, цитотоксические Т-клетки дают более ранний ответ на стимуляцию, чем Т-хелперы. В настоящее время ведутся сортировка и анализ Т-клеток на длинных сроках инкубации. Клетки инкубируются ночь в режиме цейтраферной съемки (фазовый объектив х20) на инвертированном микроскопе LCI с CO2-инкубатором и системой для прижизненной съемки (в течение 16-24 часов). Выявляется динамика и характер клеточной подвижности. Получены и обсчитываются фиксированные препараты для оценки метрик распластывания, а также коллекция кДНК из активированных и неактивированных клеток. Таким образом: 1) В ходе выполнения проекта в 2025 году была разработана ПЦР-система для оценки представленности миозинов I человека. Разработанная ПЦР-система позволяет проводить индивидуальный (SYBRGreen I / TaqMan) и мультиплексированный (TaqMan VIC +ROX) анализ экспрессии генов миозинов I и двух референсных генов YWHAZ, UBC. Верификация системы была проведена более чем на 35 перевиваемых клеточных линиях человека, для всех генов, кроме MYO1H (крайне редкого) удалось подобрать положительные и отрицательные (слабо экспрессирующие/неэкспрессирующие) контроли. 2) Были проанализированы открытые данные РНК секвенирования для Т-лимфоцитов человека, представленность миозинов I была проанализирована in silico. Анализ данных РНК секвенирования in silico был выполнен для базы перевиваемых клеточных линий человека (GSE240542) в рамках разработки ПЦР-системы для анализа экспрессии миозинов I класса (гены MYO1A, MYO1B, MYO1C, MYO1D, MYO1E, MYO1F, MYO1G, MYO1H). Выбор базы данных был обусловлен достаточным количеством экспериментальных повторов на клеточную линию и разнообразием представленных клеточных линий как опухолевого, так и неопухолевого происхождения. Подобный набор позволил нам выявить и сравнить паттерны экспрессии миозинов I в разных типах клеток человека, включая Т-лимфоциты: группа гематологических опухолей содержала основные модельные линии CD4+ и CD8+ Т-клеток человека: MOLT-4 и Jurkat. В исследованных клеточных линиях по специфическому паттерну экспрессии миозинов I кластеризовались все гематологические клеточные линии, за исключением HAP-1 и RPMI-8226. Отличительной чертой кластера клеток гематологических опухолей является сниженная экспрессия генов группы распространенных миозинов (MYO1B, MYO1C, MYO1D, MYO1E), а также относительно повышенная экспрессия генов малораспространенных миозинов MYO1F и MYO1G. При этом собственно Т-клетки (Jurkat, MOLT-4) демонстрировали исключительно повышение экспрессии MYO1G, а не MYO1F. Исходя из имеющихся литературных данных по экспрессии этих малопредставленных миозинов в иммунных неопухолевых клетках мышей, есть основания предполагать, что, как минимум, часть этого паттерна является лейкоцит-специфичной, а не опухоль-специфичной. Таким образом, специфичность паттерна экспрессии миозинов I класса, отличная от других типов клеток, была подтверждена для иммунных клеточных линий человека, включая распространенные модельные Т-клеточные линии. В настоящее время проводится подтверждение полученных данных для неопухолевых Т-клеток человека, а также сравнение неопухолевых Т-клеток с клетками Т-ОЛЛ. 3) Полученные результаты были верифицированы методом ПЦР в реальном времени. На данном этапе были получены данные о представленности миозинов в модельных линиях Т-лимфоцитов человека, соответствующих Т-ОЛЛ. (Работы были запланированы на следующий отчетный период, но были проведены досрочно. Работы по сортировке наивных и зрелых Т-лимфоцитов периферической крови человека для оценки экспрессии миозинов I, соответственно, были перенесены на будущий отчетный период.) По результатам ПЦР-анализа были выявлены некоторые отличия от обработанных данных РНК секвенирования. Так, экспрессия MYO1C в лейкоцитарных клеточных линиях при ПЦР-анализе была снижена сильнее – до околонулевых значений и полного отсутствия в некоторых образцах. В остальных образцах продукт детектировался на высоком уровне. Экспрессия гена MYOF отсутствовала во всех образцах выборки, включая лейкоцитарные клеточные линии, где экспрессия этого гена ожидалась. Предположительно, это может быть связано с уровнем активации лейкоцитов в культуре. По литературным данным, экспрессия этих двух генов запускается в лейкоцитах в связи с их активацией. Активация суспензионных иммунных клеток может проходить в культуре индуцированно или спонтанно и выражается в прикреплении части клеток к подложке с изменением их формы и адгезивности. Эта гипотеза в данный момент проверяется при анализе экспрессии миозинов I в перевиваемых Т-лимфоцитах и в отсортированных ex vivo CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах после индуцированной активации. Общий подтвержденный специфичный паттерн экспрессии генов миозинов I (в отсутствии активации) для модельных Т-лимфоцитов заключается в индуцированной экспрессии MYO1G, среднем уровне экспрессии MYO1A, MYO1B, снижении MYO1C по сравнению с любыми другими клеточными линиями, отсутствии MYO1D, MYO1E, MYO1F, MYO1H. 4) Результаты работы были представлены на конференции – на отсортированных ex vivo CD4+ и CD8+ Т-клетках человека была показана смена морфологии при активации на ранних сроках и индукция экспрессии интегринов в CD8+ Т-клетках, как маркер их активации. Опубликованы тезысы: Голышева А.Е. «Изменения паттернов экспрессии интегринов в ответ на активацию Т-клеток человека» Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2025» (2025) Статья по результатам данного этапа (анализ баз РНК секвенирования и ПЦР-верификация данных) находится на рассмотрении в International Journal of Molecular Sciences (текст статьи приложен к отчету в Дополнительных материалах).
2 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Исследование представленности неклассических миозинов I в Т-лимфоцитах человека. Этап 2.
Результаты этапа: -

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".