ИСТИНА

Гипоксическое и ишемическое повреждение головного мозга является распространенной клинической патологией, часто угрожающей жизни больного на протяжении всей жизни. В настоящее время имеется множество свидетельств что многие стволовые клетки, в частности мезенхимальные мультипотентные стромальные клетки (ММСК) костного мозга, обладают способностью защищать нервную ткань от повреждения и улучшать регенерации и пластичность уже поврежденного головного мозга. В частности известно, что ММСК обладают иммуномодулирующими свойствами, что может иметь очень важное значение для восстановления нервной ткани после инсульта, когда воспалительные изменения в мозге играют первостепенную роль в повреждении. В рамках проекта предполагается исследовать нейропротекторные и иммуномодуляторные свойства ММСК при моделировании ишемического повреждения нейронов головного мозга in vivo и in vitro. Необходимо выявить условия, в которых ММСК проявляют нейропротекторные свойства и начинают наиболее активно вырабатывать сигнальные молекулы, нейротрофины и иммуномодуляторы. Кроме того, значительная часть проекта будет посвящена изучению межклеточных взаимодействий МСК и клеток головного мозга, в частности образованию межклеточных контактов, передаче компонентов цитоплазмы и органелл, и соответственно, изучению роли этих процессов в реализации нейропротекторного потенциала стволовых клеток. Будут изучены на моделях in vitro и in vivo процессы направленной миграции ММСК в поврежденную ткань. Предполагается исследовать влияние прекондиционированных воспалением или ионами лития ММСК на воспалительный ответ и повреждение мозга при экспериментальном инсульте. А также исследование возможности улучшения свойств ММСК как нейропротекторов путем их сокультивирования с различными типами нейральных клеток. Предлагаемые исследования направлены, прежде всего, на раскрытие фундаментальных механизмов, лежащих в основе развития нейродегенерации при инсульте и о влиянии на него экзогенных ММСК.

Будут исследованы эффекты ионов лития, гипоксического прекондиционирования, кислотности среды, сокультивирования с различными типами нейральных клеток на свойства и биологические активности культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Будут получены новые данные о зависимости способности культур мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) к пролиферации и дифференцировке в зрелые клеточные элементы от источника клеток, а также от условий и длительности предварительного культивирования, в том числе в присутствии солей лития. Изучение терапевтического эффекта трансплантации стволовых клеток отдельно и в комбинации с солями лития при различных экспериментальных повреждениях мозга животных позволит разработать подходы к внедрению трансплантации ММСК в клинику. Будет изучено взаимодействие клеток при сокультивировании стволовых и нейрональных клеток. Будут исследованы два основных способа введения клеток: интрапаренхиматозный – непосредственно в ткань мозга и внутривенный, как наиболее близко отражающий возможное клиническое применение. Будет проведено изучение миграции, распределения и приживаемости в организме животного клеток, помеченных специфичным клеточным парамагнитным соединением. Для изучения интеграции в орган будут использоваться те же клетки, но помеченные генноинженерной конструкцией, несущей ген флуоресцентного белка, ориентированного в цитоплазму или митохондрии. Эти методы позволят также отслеживать возможные взаимодействия донорских и хозяйских клеток. Как на уровне системы сокультивирования in vitro, так и при введении в организм животного, мы будем использовать иммуногистохимические методы окраски для оценки дифференцировки стволовых клеток по пути генерации функционально зрелых нейронов, астроглии и других нейральных клеток. Для этого будут использоваться ряд специфических антител на маркеры дифференцированных клеток и маркеры недифференцированных ММСК. Наконец, мы попробуем доказать универсальность способности стволовых клеток образовывать контакты с различными типами дифференцированных клеток, как при совместном культивировании, так и при трансплантации в орган. Одновременно будет проверено какими сигнальными веществами (органеллами) обмениваются клетки и каков результат такого обмена, как для нейральных клеток, так и для стволовых клеток. Также будет изучаться влияние на трансдифференцировку по нейральному и глиальному фенотипу МСК сокультивированных с диссоциированными культурами клеток мозга. Модель фокальной ишемии головного мозга будет проводиться на 3-х месячных половозрелых крысах. Фокальный очаг повреждения головного мозга будет индуцироваться путем введения нити через внутреннюю сонную артерию до отхождения средней мозговой артерии, тем самым перекрывая ее. Через 1 час нить извлекается из сосуда, восстанавливая кровоток в бассейне средней мозговой артерии. В данной модели будет изучена с помощью магнитно-резонансной томографии и компьютерной морфометрии динамика и механизм развития ишемического очага головного мозга, последовательность вовлечения различных структур головного мозга в патологический процесс при окклюзии среднемозговой артерии, а также временного "окна" формирования ишемического очага при таком моделировании. Будет исследован временной интервал возможной защиты от развития ишемического повреждения, то есть определена максимально поздняя стадия, на которой еще возможна защита нейронов от гибели. Степень выраженности неврологического дефицита будет оценена с помощью неврологической шкалы. Планируется получить результаты о защите от повреждений и гибели нейронов используя модели фокальной ишемии головного мозга и трансплантации ММСК. Ожидается, что у животных, получавших ММСК, будет снижаться объем повреждения головного мозга, оцененный с помощью МРТ. Трансплантация ММСК должна способствовать восстановлению утраченных функций мозга, оцененных в различных поведенческих тестах и с помощью неврологической шкалы. Планируется получить результаты по поведению и дифференцировке трансплантируемых клеток с помощью гистологических, иммуногистологических методов и конфокальной микроскопии. Будет показано, что трансплантируемые МСК сохраняют жизнеспособность не менее 3 месяцев, мигрируют и трансдифференцируются по нейрональному фенотипу и глию в ткани поврежденного головного мозга в обеих моделях. МСК предполагается пометить парамагнитным наночастицами и с помощью МРТ наблюдать за динамикой миграции и накоплением МСК в различных структурах головного мозга. Основным же итогом работы станет создание протоколов воздействия на стволовые клетки (путем химической обработки, гипоксического прекондиционирования, сокультивирования, модуляций рН и т.д.) позволяющих многократно увеличивать нейропротекторный потенциал этих клеток, и позволяющих добиться значительного обращения нейродегенеративных изменений при инсульте, что откроет дорогу для дальнейших клинических испытаний и внедрения данных методик в практику лечения ишемических повреждений головного мозга.