ИСТИНА

ВВЕДЕНИЕ. Тромбоциты, безъядерные клетки крови, составляют основу тромбов благодаря своей способности к адгезии и агрегации. Причиной связывания клеток друг с другом является активация белков-интегринов на их поверхности. Кроме того, при активации тромбоциты секретируют растворимые прокоагулянтные и провоспалительные факторы, а иногда и сама их плазматическая мембрана преобразуется с появлением свойств ускорять свертывание плазмы крови. Процесс активации состоит в связывании растворимых или локализованных на поверхности сосуда активаторов, появляющихся при повреждении, с соответствующими рецепторами на поверхности тромбоцита. Лигированный рецептор передает сигналы внутрь клетки, что приводит в первую очередь к активации интегринов, при этом связывание интегрина со своим лигандом приводит к дополнительной активации тромбоцита (так называемая сигнализация «снаружи- внутрь», outside-in). При сильной активации некоторые тромбоциты выставляют фосфатидилсерин на внешней поверхности мембраны и таким образом способствуют свертыванию плазмы крови. Практически все функциональные ответы развиваются в первые секунды после активации тромбоцита. Однако в отсутствии повреждения тромбоциты не реагируют на внешние воздействия, так как находятся в заингибированном состоянии, поддерживаемом постоянно находящимися в кровотоке оксидом азота (NO) и простациклином. Это состояние обеспечивается высокими концентрациями cAMP и сGMP в тромбоците (в отличие от большинства клеток человеческого организма, в тромбоците циклические мононуклеотиды являются ингибирующими сигналами и блокируют случайную активацию). Таким образом, в условиях реального сосуда всегда происходит взаимодействие сигналов от нескольких рецепторов. Большинство тромбоцитарных активаторов приводит к повышению концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме, что приводит к секреции гранул и, как считается, активации интегринов. Кальций-зависимый активатор ГТФаз CalDAGGEFI активирует малую ГТФазу Rap1b, стимулируя ее ассоциацию с GTP. Дальнейший каскад приводит к активации интегринов. Ингибирующим сигналом для тромбоцитарных интегринов является инактивация Rap1bGTP посредством усиления гидролиза GTP GAP-белками (GTPase Activating Protein), для тромбоцитов этот процесс зависит от концентрации мембранного липида фосфоинозитол-3,4,5-трифосфата, появляющегося при запуске каскада тирозин-киназ (от рецептора к коллагену) или от бета и гамма субъединиц G-белков (остальные рецепторы). Кроме того, Rap1bGTP может как активироваться,так и инактивироваться cAMP-зависимым фосфорилированием. Таким образом, активация тромбоцитарных интегрином очевидно представляет собой сдвиг баланса между активацией (кальций-зависимые события) и ингибированием (cAMP-зависимое событие) и рассматривать тромбоцит только с одной стороны (активационной) строго говоря является некорректным. Однако какое из двух событий является определяющим для активации интегринов остается неясным. Первично активированные интегрины позволяют тромбоцитам сформировать непрочный агрегат, стабилизация которого предположительно осуществляется при кластеризации интегринов, зависящей от сигналов "снаружи-внутрь". При дальнейшем повышении концентрации кальция в цитоплазме тромбоцита происходит митохондриально-зависимый некроз, приводящий к инактивации интегринов. При этом полимеризованный фибриноген (лиганд основного интегрина – GPIIb-IIIa) остается на мембране тромбоцита в выделенной области, способствуя задержке некротических тромбоцитов в тромбе. Исследование описанного взаимодействия путей внутриклеточной сигнализации невозможно без использования методов системной биологии, позволяющей исследовать работу системы как единого целого. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ. Целью настоящего проекта является выявления механизмов формирования, распространения и взаимодействий внутриклеточных сигналов, начинающихся с рецепторов к тромбину и ADP и заканчивающихся формированием агрегационной активности тромбоцитов различной степени. Конкретные задачи проекта включают в себя три ключевых направления: 1. Выявление механизмов активации, инактивации, кластеризации интегрина αIIbβ3 при стимуляции тромбоцитов. В ходе выполнения этой задачи будут разрешены существующие противоречия, касающиеся роли кальциевых осцилляций и киназных каскадов в управлении этим процессом. 2. Определение взаимодействий кальциевой и цАМФ-зависимой сигнализаций в тромбоцитах, в первую очередь на уровне активации интегринов. 3. Определение физических закономерностей формирования тромбоцитарного агрегата, состоящего из тромбоцитов, активированных в разной степени. Основным вопросом здесь является, какая доля интегринов должна быть активирована на тромбоците для образования устойчивого агрегата. Для решения этих задач будут задействованы методы проточной цитофлуориметрии (суспензия клеток) и флуоресцентной микроскопии (одиночные клетки и агрегаты) для наблюдения корреляции активации интегринов и концентрации внутриклеточного кальция с некрозом и агрегацией тромбоцитов в зависимости от комбинации активаторов и ингибиторов. Полученные результаты будут суммированы в виде компьютерной модели внутриклеточной сигнализации тромбоците, учитывающей основные взаимное влияние кальций-зависимых и cAMP-зависимых ферментов на распространение сигнала. Такое экспериментально- теоретическое исследование позволит разобраться в механизмах, отвечающих за степень и динамику активации, кластеризации и инактивации интегринов.

INTRODUCTION. Platelets, the non-nucleated blood cells, form the basis of hemostatic plugs and arterial blood clots due to their ability for adhesion and aggregation. This ability is realized due to the activation of integrins on their surface. Also, when activated, platelets secrete soluble procoagulant and proinflammatory factors, and sometimes their plasma membrane itself is transformed with the appearance of properties to accelerate coagulation of blood plasma. The process of platelet activation starts when soluble or localized on the surface activators, those appear after vessel injury, bind to the corresponding receptors on the platelet surface. The ligated receptor transmits signals into the cell, which at first leads to the integrin activation, wherein the integrin binding to its ligand leads to the additional platelet activation (called "outside-in" signaling). After strong activation some platelets expose phosphatidylserine on the outer surface of the membrane and thus facilitate plasma clotting. Virtually all functional responses develop in the first seconds after platelet activation. However, in the absence of damage platelets do not react to external influences because of inhibitory state maintained by constantly present in the bloodstream nitric oxide (NO) and prostacyclin. This condition is ensured by high concentrations of cAMP and cGMP in the platelet (in contrast to most of the human body cells, platelet cyclic mononucleotides are inhibitory signals and block accidental activation). Thus, in a real vessel the interaction of several receptor signaling pathways always takes place. Most platelet activators leads to increased concentrations of free calcium ions in the cytoplasm which leads to the secretion granules and are believed to activate the integrins. Calcium-dependent activator of small GTPases, CalDAGGEF1, activates a GTPase Rap1b, promoting its association with GTP. Further cascade leads to the activation of integrins. Inhibitory signal for platelet integrin is Rap1bGTP inactivation by enhancement of the hydrolysis of GTP by GAP-proteins (GTPase Activating Protein). In platelets, this process depends on the concentration of the lipid membrane phosphoinositol-3,4,5-triphosphate, which appears in the cascade of tyrosine kinases (from the collagen receptor) or after the release of betagamma subunits of G-proteins (from almost all the other receptors). Furthermore, Rap1bGTP can be both activated and inactivated by cAMP-dependent phosphorylation. Thus, activation of the platelet integrins is the result of obvious shift in the balance between activation (calcium-dependent events) and inhibition (cAMP-dependent events). Thus considering the platelet from only one side (activation) is strictly speaking incorrect. However, which of the two events is crucial for the activation of integrins remains unclear. Primarily activated integrins allow platelets to form a fragile aggregate, the stabilization of which is presumably carried out during clustering of integrins, which depends on the "outside-in" signalling. With further increase of the calcium concentration in the cytoplasm of platelets a mitochondriadependent necrosis occurs, resulting, in particular, in integrin inactivation. But the polymerized fibrinogen (the ligand of the main integrin, GPIIb-IIIa) remains on the platelet membrane in the selected area, theoretically contributing to the detention of the necrotic platelets in thrombus. The investigation of the described interactions of intracellular signaling pathways is not possible without the use of methods of systems biology, which allows to study the operation of the system as a whole. AIM AND TASKS. The aim of this project is to identify the mechanisms of formation, propagation and interactions of intracellular signals, starting from the receptors to thrombin and ADP and leading to the formation of the various states of platelet aggregatory activity. Specific objectives of the project include three key areas: 1. Identification of the mechanisms of integrin αIIbβ3 activation, inactivation and clustering after platelet stimulation. Here we expect the contradictions regarding the role of calcium oscillations and kinase cascades in the management of this process to be resolved. 2. Determination of the interactions of calcium- and cAMP-dependent signaling in platelets at the level of integrin activation. 3. Determination of the physical laws governing the formation of platelet aggregates from platelets activated at varying degrees. The main issue here is what fraction of the integrins should be activated to form a stable plug containing necrotic platelets. To solve these problems we will utilize flow cytometry (cell suspension) and fluorescence microscopy (single cells) for monitoring the correlation between integrin activation, intracellular calcium concentration and platelet necrosis depending on the combination of activators and inhibitors. The results will be summarized in the computer model of platelet intracellular signaling, taking into account the mutual influence of the major calcium-dependent and of cAMP-dependent enzymes in the signal transduction. This experimental and theoretical research will allow understanding of the mechanisms responsible for the extent and dynamics of integrin activation, clustering and inactivation.