В связи с техническими работами в центре обработки данных, возможность загрузки и скачивания файлов временно недоступна.
 

Разработка методов ЯМР для решения задач молекулярной фармакологииНИР

Development of NMR methods for molecular pharmacology tasks solution

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 июля 2014 г.-15 декабря 2014 г. Разработка методов ЯМР для решения задач молекулярной фармакологии
Результаты этапа: 1. Проведена модификация метода расчета пептидов и белков с использованием явно выраженного водного окружения и программы GROMACS. Разработанный протокол протестирован на серии полипептидов и небольших белков (коды PDB 2MKB, 1XCO, 2LA1, 2LL2 и 2M7E). Для большинства полипептидов наблюдалось существенное улучшение качества семейства структур ЯМР, которое выражается как в виде уменьшения среднеквадратичного значения разброса координат атомов, так и в виде повышения процента попадания аминокислотных остатков в наиболее благоприятные области карты Рамачандрана. Тестирование созданного протокола на более крупных белках (N-терминальном и среднем доменах фактора терминации трансляции eRF1 человека, коды PDB 2LLX и 2HST) показало неудовлетворительные результаты, выражаемые в отсутствии сходимости расчетов и большой их длительности. Требуется дополнительная модификация протокола расчета применительно к крупным белкам. 2. Написано несколько новых модулей программы NMRest, включая модуль для эффективного взаимодействия с программой молекулярной динамики GROMACS. Подготовлено краткое руководство по инсталляции программы NMRest и руководство по ее использованию. Подготовлены документы для регистрации авторских прав на программу. Обеспечена возможность свободного скачивания программы NMRest для потенциальных пользователей. 3. Получена информация об оптимальных условиях (pH, температура, концентрация лигандов и белка-мишени, параметры импульсных последовательностей, длительность и мощность импульсов насыщения, резонансные частоты насыщения сигналов белка) проведения экспериментов ЯМР STD и WaterLOGSY. Результаты получены на модельной системе, состоящей из бычьего сывороточного альбумина (модель белка-мишени) и смеси лигандов, связывающихся и не способных связываться с БСА (триптофан и глюкоза, соответственно). Полученные данные использованы далее для оптимизации экспериментов по поиску новых ингибиторов метионин гамма-лиазы. 4. Проведены расчеты по докингу низкомолекулярных соединений в сайт связывания субстрата C. freundii метионин гамма-лиазы. Этап виртуального скрининга in silico был необходим для сужения структурного разнообразия лигандов, способных связываться с ферментом и сокращения числа соединений, исследуемых далее экспериментально. В ходе исследований первого года выполнения проекта на базе коммерчески доступной библиотеки химических соединений была создана исходная выборка из 32000 лигандов, имеющих элементы структурного соответствия субстратам МГЛ. Виртуальный скрининг с использованием структуры C.freundii метионин гамма-лиазы (код PDB 2RFV) позволил отобрать 120 соединений, способных эффективно занимать карман связывания субстрата в структуре фермента. Из этого числа, используя экспертную оценку положения лиганда в сайте белка и правила Липински для соединений, имеющих высокую биодоступность при пероральном введении [1], было отобрано 21 соединение для дальнейшей экспериментальной проверки их способности связываться с МГЛ. 5. Получено необходимое для экспериментальных исследований количество C. freundii метионин гамма-лиазы методами генной инженерии. Клетки Escherichia coli BL21 (DE3), содержащие ген МГЛ из C.freundii в плазмиде pET-mgl [2], выращивали на «индуцирующей» среде [3] при 37C. Выделение фермента проводили по методике, описанной ранее [4]. Концентрацию очищенного препарата определяли, используя коэффициент А1%278 = 0.8 [5]. Чистоту препарата проверяли при помощи электрофореза в денатурирующих условиях по методу Лэммли. Активность препарата в реакции γ-элиминирования определяли по скорости образования α-кетомасляной кислоты в сопряженной реакции с D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназой в условиях, описанных в работе [5]. Рекомбинантная C. freundii метионин гамма-лиаза получена в количестве, необходимом для проведения несколько десятков спектральных измерений. 6. Подобраны оптимальные условия (pH, температура, состав буферной среды, концентрация лигандов и белка-мишени) для экспериментов STD и WaterLOGSY с использованием C. freundii метионин гамма-лиазы в качестве мишени. Проведены эксперименты ЯМР по детектированию специфического связывания с МГЛ соединений из группы, отобранных по результатам докинга in silico. Из 21 соединения было отобрано 4, обладающих заметной способностью связываться с ферментом. 7. Для четырех соединений, показавших в экспериментах ЯМР наивысшую аффинность по отношению к ферменту, проведены измерения их ингибирующих свойств на тест-системах в экспериментах in vitro. Отобраны два соединения-лидера, обладающих заметной ингибирующей активностью, сравнимой по величине с известным ингибитором МГЛ, L-норлейцином. 8. Разработан метод определения константы связывания исследуемых ингибиторов МГЛ на основе анализа измерения интенсивностей сигналов в спектрах WaterLOGSY в зависимости от концентрации ингибитора. Этим методом определены константы диссоциации для двух соединений, найденных в экспериментах ЯМР и показавших наличие ингибирующих свойств в экспериментах in vitro. 9. Проведена инсталляция программного пакета CS-Rosetta на суперкомпьютере МГУ Ломоносов и отлажен протокол расчета белков с помощью этого программного пакета при использовании ограниченного количества ограничений ЯМР (химических сдвигов сигналов). Проведено тестирование метода на C-домене фактора терминации трансляции eRF1 человека. Установлено, что указанный метод адекватно воспроизводит наличие двух конформационных состояний белка («открытого» и «закрытого»), структуры которых ранее были определены в растворе с использованием полного набора ограничений ЯМР (дистанционные ограничения на основе значений ядерных эффектов Оверхаузера, ориентационные ограничения на основе остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия, измеренных в разбавленных анизотропных средах, ограничения на диэдральные углы, водородные связи). 10. Усовершенствована программа докинга низкомолекулярных соединений в структуру биомолекул-мишеней Algocomb. В новой модификации программы реализован метод анализа углов между связями при оценке энергии образования водородной связи между атомами, а также учет внутрилигандных взаимодействий в процедуре их докинга в сайт связывания биомолекулы. Готовится публикация с изложением результатов тестирования нового подхода и сравнением его эффективности с другими программами докинга. 11. Разработана программа, позволяющая провести расчет эффектов STD для серии конформеров лиганда, полученных в процессе виртуального докинга, с целью выбора конформации, наилучшим образом соответствующей экспериментальным данным. Программа использует в качестве входных параметров структуру белка и набор конформаций лиганда в формате PDB, а также список экспериментально измеренных эффектов STD для протонов лиганда. Результатом расчета является таблица рассчитанных эффектов STD для каждой конформации лиганда с коэффициентами Пирсона, характеризующими качество корреляции между расчетными данными и экспериментом. Программа протестирована для соединений-лидеров, отобранных в качестве ингибиторов L-метионин-гамма-лиазы в ходе исследований первого года выполнения проекта. Литература 1. Lipinski CA, Lombardo F, Dominy BW, Feeney PJ (2001) Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev 46: 3-26. 2. Manukhov IV, Mamaeva DV, Rastorguev SM, Faleev NG, Morozova EA, et al. (2005) A gene encoding L-methionine gamma-lyase is present in Enterobacteriaceae family genomes: identification and characterization of Citrobacter freundii L-methionine gamma-lyase. J Bacteriol 187: 3889-3893. 3. Studier FW (2005) Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif 41: 207-234. 4. Manukhov IV, Mamaeva DV, Morozova EA, Rastorguev SM, Faleev NG, et al. (2006) L-methionine gamma-lyase from Citrobacter freundii: Cloning of the gene and kinetic parameters of the enzyme. Biochemistry (Moscow) 71: 361- 369. 5. Carlomagno T, Felli IC, Czech M, Fischer R, Sprinzl M, et al. (1999) Transferred Cross-Correlated Relaxation: Application to the Determination of Sugar Pucker in an Aminoacylated tRNA-Mimetic Weakly Bound to EF-Tu. Journal of the American Chemical Society 121: 1945-1948.
2 1 января 2015 г.-15 декабря 2015 г. Разработка методов ЯМР для решения задач молекулярной фармакологии
Результаты этапа:
3 1 января 2016 г.-15 декабря 2016 г. Разработка методов ЯМР для решения задач молекулярной фармакологии
Результаты этапа: В ходе исследований, проведенных в 2016 году, основные усилия были сосредоточены на решении актуальных задач молекулярной фармакологии методами и программными средствами, разработанными на предыдущих этапах. Определена структура высокого разрешения в растворе N-терминального домена (TEN) основной каталитической субъединицы TERT теломеразы из термофильных дрожжей Ogataea polymorpha. Координаты атомов депонированны в банк белковых структур (http://www.rcsb.org) с кодом доступа 5LGF. Исследованы динамические свойства белковой цепи TEN в шкале времени от пс до мс. Методами гетероядерной спектроскопии ЯМР изучено взаимодействие TEN домена с потенциальными партнерами по связыванию. Установлено, что TEN домен специфически связывается с короткими фрагментами одноцепочечной РНК и гетеродуплексами РНК-ДНК, содержащими теломерные повторы. Это может определять роль этого фрагмента TERT в механизме реакции удлинения цепи ДНК, катализируемой теломеразой. Получено отнесение сигналов ЯМР основной белковой цепи еще одной субъединицы теломеразы термофильных дрожжей Ogataea polymorpha - белка Est3. Определены элементы вторичной структуры этого белка. Начато исследование методами ЯМР нового фармакологически важного объекта -метилтрансферазы WBSCR27, продукта одного из генов, ассоциированных с генетическим заболеванием (синдромом Вильямса). Получена информация об отнесении сигналов аминокислотных остатков WBSCR27 и вторичной структуре белка. Методами ЯМР определено строение серии антибиотиков - аналогов амфотерицина B и исследовано взаимодействие рифабутина с циклодекстринами с целью повышения биодоступности препарата. Проведен поиск потенциальных ингибиторов C. freundii метионин гамма-лиазы (МГЛ) на основе структур фрагментов, связывающихся с ферментом в соседних участках. Методами ЯМР-скрининга в отобранной группе соединений найдены два соединения, связывающиеся с МГЛ. Проведена модификация программы докинга Algocomb с целью усовершенствования оценочной функции для осуществления более точной оценки свободной энергии образования белок-лигандного комплекса. Разработан интерфейс для интеграции программы SpINPHARMA в ранее оптимизированный программный пакет для моделирования белок-лигандных взаимодействий. За 2016 год в соответствии с запланированными показателями опубликовано 4 статьи в журналах, реферируемых WoS, Scopus и РИНЦ. Получены 3 авторских свидетельства на программное обеспечение. Результаты выполнения проекта представлены в 2016 году на 9-ти международных и российских конференциях и научных школах в виде 2 пленарных, 7 устных и 6 стендовых докладов.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".