ИСТИНА

Терапевтическое применение противоопухолевых ферментных препаратов, катализирующих деплецию определенных незаменимых аминокислот, основано на данных об отсутствии или низкой активности соответствующих синтетаз аминокислот в опухолевых клетках. L-аспарагиназы из E. coli (EcA) и Er chrysanthemi (ErA) используются в первой линии стандартной терапии острого лимфобластного лейкоза, а также при лечении других видов опухолей. Однако, длительное терапевтическое применение белковых препаратов вызывает развитие иммунологической гиперчувствительности, из-за чего терапию часто приходится прекращать преждевременно. Повышение переносимости препаратов АСП путём повышения их активности, а также понижения иммуногенности, могло бы способствовать более полной реализации их терапевтического потенциала. В разработке нашей научной группы имеется серия различных препаратов АСП из различных источников, включая EwA, RrA, WsА и др. Было замечено, что каталитическая активность препаратов АСП по аспарагину, измеренная in-vitro не всегда коррелирует с их цитостатической активностью на опухолевых клетках. Для многих препаратов наблюдаются кратные отклонения по активности при измерениях на клеточных линиях от «ожидаемых» исходя из величины ферментативной активности . Это невозможно объяснить различной чувствительностью раковых линий к деплеции аспарагина: будучи малочувствительна к одной АСП, та же клеточная линия может оказаться высокочувствительна к другой АСП в той же дозировке по МЕ. Данный феномен описан в литературе, однако убедительные объяснения отсутствуют. Отсутствие явных закономерностей в отклонениях по цитостатической активности L-аспарагиназ на разных клеточных линиях может указывать на многофакторный механизм их цитостатического действия. Исследования, проведённые в коллективе заявителей показали, что кроме способности гидролизовать L-аспарагин, некоторые АСП способны интернализоваться в лейкозные клетки, что влияет на противоопухолевую активность фермента. Другие же изученные L-аспарагиназы не способны проникать внутрь клеток. Прямых корреляций между свойствами фермента и его цитостатической активностью в настоящее время не найдено и вопрос о специфических механизмах дейтсивя аспарагиназных препаратов из различных источников требует дополнительных исследований. С другой стороны, нами было замечено, что некоторые из видов химической модификации аспарагиназ не только повышают их удельную ферментативную активность и стабильность в физиологических условиях, но также и делают их воспроизводимо более активными на различных клеточных линиях. С этой точки зрения, одним из перспективных, на основании предварительных экспериментов, представляется RrA. Это одна из самых «лёгких» (ММ в два раза ниже, чем у EcA) и одновременно высоко цитостатически активных АСП, что создает предпосылки для сниженной иммуногенности фенмента. Что ещё более важно, мы обнаружили что при модификации RrA катионными разветвленными сополимерами, наблюдается кратно более высокая антипролиферативная активность против ряда клеточных линий. Активность конъюгатов RrA на клетках превышает EcA и ErA, зарегистрированные в России и за рубежом. Предлагается систематически исследовать феномен повышенной активности на широкой панели раковых клеточных линиях (в тч лейкозных), с использованием АСП – нативных, модифицированных, мутантных форм, с целью выяснить механизмы наблюдаемого феномена. Планируется выяснить механизм влияния интернализации фермента на цитостатическую активность, объяснить эффект увеличения антипролиферативной активности АСП при формировании конъюгатов с поликатионами. В перспективе, результаты могут быть использованы для создания новых фармацевтических препаратов АСП с повышенной активностью и переносимостью.

The therapeutic use of antitumor enzyme preparations that catalyze the depletion of certain essential amino acids is based on data on the absence or low activity of the corresponding amino acid synthases in tumor cells. L-asparaginases from E. coli (EcA) and Er chrysanthemi (ErA) are used in the first line of standard therapy for acute lymphoblastic leukemia, as well as in the treatment of other types of tumors. However, long-term therapeutic use of protein preparations causes the development of immunological hypersensitivity, because of this, therapy often has to be stopped prematurely. Increasing the tolerability of ASP drugs by increasing their activity, as well as reducing immunogenicity, could contribute to a more complete realization of their therapeutic potential. In the development of our scientific group, there is a series of different TSA preparations from various sources, including EwA, RrA, WsA, etc. It has been observed that the catalytic activity of asparagine ASP preparations measured in vitro does not always correlate with their cytostatic activity on tumor cells. For many drugs, multiple deviations in activity are observed when measured on cell lines from the "expected" ones based on the amount of enzymatic activity. This cannot be explained by the different sensitivity of cancer lines to asparagine depletion: being insensitive to one ASP, the same cell line may be highly sensitive to another ASP in the same dosage by IU. This phenomenon is described in the literature, but there are no convincing explanations. Absence of obvious patterns in deviations The cytostatic activity of L-asparaginases on different cell lines may indicate a multifactorial mechanism of their cytostatic action. Studies conducted in a team of applicants have shown that in addition to the ability to hydrolyze L-asparagine, some ASPs are able to internalize into leukemic cells, which affects the antitumor activity of the enzyme. Other studied L-asparaginases are not able to penetrate into cells. Direct correlations between the properties of the enzyme and its cytostatic activity have not been found at present and the question of the specific mechanisms of the action of asparaginase preparations from various sources require additional research. On the other hand, we have noticed that some of the types of chemical modification of asparaginases not only increase their specific enzymatic activity and stability under physiological conditions, but also make them reproducibly more active on various cell lines. From this point of view, RrA seems to be one of the promising ones based on preliminary experiments. This is one of the "lightest" (MM is two times lower than that of the EcA) and at the same time high cytostatically active ASPs, which creates prerequisites for reduced immunogenicity of the enzyme. More importantly, we found that when modifying RrA with cationic branched copolymers, there is a multiple higher antiproliferative activity against a number of cell lines. The activity of RrA conjugates on cells exceeds the EcA and ErA registered in Russia and abroad. It is proposed to systematically investigate the phenomenon of increased activity on a wide panel of cancer cells lines (leukemia), using ASP – native, modified, mutant forms, in order to find out the mechanisms of the observed phenomenon. It is planned to find out the mechanism of the effect of enzyme internalization on cytostatic activity, to explain the effect of increasing the antiproliferative activity of ASP during the formation of conjugates with polycations. To validate the results obtained, it is planned to investigate the effectiveness of the developed enzymes in vivo in mice with model tumors in collaboration with specialists from the N.N. Blokhin Oncology Research Center. In the future, the results can be used to create new pharmaceutical preparations of ASP with increased activity and tolerability. It is proposed to systematically investigate the phenomenon of increased activity on a wide panel of cancer cell lines (including leukemia), using various ASP - native, modified by cationic copolymers, mutant forms, in order to find out the mechanisms of the observed phenomenon and the role of various factors influencing its manifestation. It is planned to conduct a targeted search for surface ASP receptors on cancer cells, to find out the mechanisms of their interaction and possible internalization, to try to explain the effect of a sharp increase in the antiproliferative activity of RrA (and possibly other ASPs) during the formation of conjugates with polycationic copolymers. To validate the results obtained, it is planned to investigate the effectiveness of the developed enzyme preparations in in vivo systems in mice with the corresponding model tumors. In the future, the knowledge gained can be used to create new pharmaceutical drugs with increased activity and tolerability.

Будет исследовано влияние конъюгирования на цитостатическую активность наиболее перспективных форм RrA, полученных в работе. Ожидается, что помимо влияния на уровень каталитической активности фермента в физиологических условиях, образование конъюгатов RrA с катионными сополимерами ПЭГ-полиэтиленмином и др Известно, что клеточные мембраны опухолевых клеток несут отрицательный поверхностный заряд за счет повышенной экспрессии анионных молекул таких как полианионные полисахариды. Ожидается, что за счет поликатионных свойств хитозана преимущественное связывание конъюгатов RrA-ПЭГ-хитозан (ПЭИ, спермин) с отрицательно заряженной поверхностью опухолевых клеток и повышение локальной концентрации фермента вблизи будет усиливать эффективность действия фермента. Ранее, нами было замечено, что формирование конъюгатов аспарагиназ с разрабатываемыми сополимерами не только повышают их удельную ферментативную активность в физиологических условиях, но также и делают их воспроизводимо более активными на различных клеточных линиях. Причем активность на клеточных культурах возрастает кратно, в том числе, по сравнению с EcA и ErA, зарегистрированными в качестве фармацевтических препаратов в России и за рубежом. Для оптимизации каталитических свойств L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum будет исследовано влияние молекулярной архитектуры со-полимера на стабильность фермента к протеолитической деградации в системах in vitro. За счет наложения эффектов конъюгирования, аминоПЭГилирования следует ожидать, что полученный препарат будет превосходить по своим биофармацевтическим свойствам исходную L-аспарагиназу RrA. Оптимизация этих свойств позволит увеличить время циркуляции препарата в крови в активном состоянии, позволив тем самым уменьшить кратность приема препарата и снизить необходимую дозу. Для наиболее перспективных (с точки зрения каталитической активности и стабильности) образцов конъюгатов L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum с со-полимерами будет изучена, противоопухолевая активность in vitro на культурах клеток обладающих статистически значимой чувствительностью к RrA в сравнении с коммерческими лекарственными препаратами нативной и пегилированной форм L-аспарагиназ E.coli. Следует особо отметить, что клетки A549, MCF7, планируемые для исследования, являются клетками солидных опухолей, поэтому планируемое исследование должно привести к расширению терапевтических возможностей L-аспарагиназной терапии. Полученные результаты послужат основой для разработки нового ферментного препарата с улучшенными биофармацевтическими свойствами. Будет систематически исследован феномен повышенной активности на широкой панели раковых клеточных линиях в системах in vitro на культурах лейкозных клеток К562, клеток Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза человека Jurkat, чувствительных к RrA в сравнении с клетками нечувствительными к L-аспарагиназным препаратам с использованием различных АСП – нативных, модифицированных катионными сополимерами, с целью выяснить механизмы наблюдаемого феномена и роль различных факторов влияющих на его проявление. Будет проведен поиск корреляций между молекулярными свойствами АСП и конъюгатов и антипролиферативной активностью; Будет проведен направленный поиск поверхностных рецепторов АСП на расширенной панели раковых клеточных линий, с целью выяснить механизмы их взаимодействия и объяснить эффект резкого увеличения антипролиферативной активности АСП RrA при формировании конъюгатов с поликатионными сополимерами. Для детального исследования механизма каталитического действия фермента в Проекте будет проведено впервые систематическое исследование влияния олигомерного состава L-аспарагиназы на каталитические параметры и цитостатическую активность. Есть предположение, что димерная форма фермента имеет более оптимальные каталитические параметры (в первую очередь, КМ, которая у АСП RrA относительно высокая) по сравнению с тетрамерной формой. Для этого исследования будет применен подход, разрабатываемый в научной группе заявителей, основанный на солюбилизации фермента в системе обращенных мицелл ПАВ. За счет варьирования степени гидратации внутренней полости мицелл, метод позволяет получать требуемые олигомерные формы фермента и изучить независимо их кинетические и структурные параметры. С применением метода модификации олигоаминами полученные олигомерные формы будет ковалентно «зафиксированы» в мицеллярной системе и выделены вводную фазу. С применением мицеллярного подхода будет исследовано влияние мутаций, и хитоПЭГилирования и аминоПЭГилирования на олигомерный состав фермента. Исследование влияния олигомерного состава на биокаталитические и цитостатическую активность открывает новые пути для выявления механизма действия L-аспарагиназ и разработки методов повышения эффективности данных ферментов, а также усовершенствования разрабатываемой технологии. В сотрудничестве со специалистами из НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина будут проведены исследования эффективности разработанных ферментных препаратов в системах in vivo на мышах с соответствующими модельными опухолями. Результаты работы будут применены для создания и апробации новых подходов к рациональному дизайну биокатализаторов с заданными свойствами, в первую очередь, препаратов медицинского назначения, что полностью соответствует основной цели проекта.

L-аспарагиназа Rhodospirillum rubrum (RrA) изучалась как перспективный препарат для лечения лейкемии из-за низкой гомологии с EcA (медицинский). RrA обладает противоопухолевой активностью. Были улучшены биокаталитические свойства RrA с помощью конъюгации с полиаминами они показали активность на 23-30% выше нативного фермента. Оптимум рН конъюгатов изменился с 9,0 до 8,5, а стабильность увеличилась. Конъюгирование RrA с полиаминами снизило доступность трипсина к поверхности белка и уменьшил константу инактивации. Мы разработали метод точного определения каталитических параметров L-аспарагиназы с помощью инфракрасной спектроскопии. Метод хорошо работает в сложных гетерогенных системах, таких как плазма крови и обращенные мицеллы. Впервые проведено прямое измерение активности димерной L-аспарагиназы как в нативной форме, так и в конъюгированной с полиэтиленгликолем хитозаном, проводится непрерывно в режиме реального времени. Разработанный подход применим к другим ферментативным реакциям. Активность L-аспарагиназы в плазме крови определяется непосредственно без дополнительной подготовки образцов. L-аспарагиназы, подавляют пролиферацию клеток. RrA подавляет активность теломеразы, что усиливает его противоопухолевые свойства. Конъюгированные формы RrA показали высокую антипролиферативную активность. Конъюгаты значительно снижали выживаемость клеток хронического миелолейкоза К562, конъюгаты показали более высокую эффективность по сравнению с коммерческими препаратами EcA и EwA.

Анализ данных о цитотоксичности полиамин-конъюгированной L-аспарагиназы в отношении лейкозных клеток показывает, что такая модификация может приводить к повышению противоопухолевой активности препарата по сравнению с нативным ферментом. Например, конъюгаты RrA с полиаминами проявляли более высокую цитотоксическую активность в отношении клеток хронического миелоидного лейкоза (K-562) и Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (Jurkat). Интересные результаты были получены при исследовании комбинации L-аспарагиназы, конъюгированной со спермином, с другим противоопухолевым препаратом – доксорубицином. Доставка этой комбинации с помощью адресной полимерной мицеллярной системы показала выраженный синергетический цитотоксический эффект в отношении лейкозных клеток. Эти данные свидетельствуют о том, что конъюгация с полиаминами не только улучшает поглощение L-аспарагиназы лейкозными клетками, но и может усиливать ее способность вызывать гибель этих клеток. Усиление цитотоксичности может быть обусловлено как увеличением внутриклеточной концентрации фермента за счет облегченного транспорта через PTS, так и возможным синергетическим действием самих полиаминов на опухолевые клетки. В некоторых исследованиях полиамин-конъюгированная L-аспарагиназа демонстрирует более высокую эффективность в подавлении роста лейкозных клеток по сравнению с нативной L-аспарагиназой. Проведены исследования эффективности разработанных ферментных препаратов в системах in vivo на мышах с соответствующими модельными опухолями. Результаты работы будут применены для создания и апробации новых подходов к рациональному дизайну биокатализаторов с заданными свойствами, в первую очередь, препаратов медицинского назначения, что полностью соответствует основной цели проекта.