ИСТИНА

В мире по сей день нерешенной остается проблема создания антидотов к отравляющим веществам, способных действовать эффективно в организме млекопитающих. Весьма привлекательной целью является создание антитела, способного нейтрализовать отравляющие вещества непосредственно в кровотоке. В связи с этим разработка новых технологий получения иммуноглобулинов с каталитическими свойствами, как антидотов к отравляющим веществам, носит принципиальный характер. Целью данного проекта является разработка принципов создания биокатализаторов de novo и направленное изменение их специфичности в приложении к медицине и сельскому хозяйству. Разработка методов получения искусственных каталитических антител (абзимов) с заданной субстратной специфичностью, в том числе способных осуществлять биокаталитические превращения, для которых нет соответствующих природных аналогов, имеет важное фундаментальное и прикладное значение. Низкая иммуногенность и высокая стабильность антител в кровотоке открывает широкие перспективы использования абзимов в качестве лекарственных средств. Поиск эффективного антидота, способного нейтрализовать фосфорорганические токсины (ФОТ), остается актуальной проблемой биохимии и биотехнологии. В настоящее время рекомбинантные антитела широко применяются как терапевтические агенты и имеют ряд преимуществ перед ферментами в качестве лекарственных средств. Потенциальный антидот на основе каталитического антитела (абзима) может сочетать в себе свойство фермента, способность эффективно осуществлять катализ с низкой иммуногенностью, продолжительным периодом циркуляции в кровотоке и действенными механизмами выведения из организма в составе комплекса антиген-антитело, характерными для молекул иммуноглобулинов. В связи с этим создание «каталитической» вакцины – каталитического антитела, способного нейтрализовать ФОТ, весьма актуально.

1. В ходе выполнения проекта была синтезирована представительная библиотека соединений, представляющих собой прототипы аналогов переходных состояний реакций гидролиза сложноэфирных и пептидных связей. Представлено около двухсот соединений и их функционально активных коньюгатов. Проверена их способность действовать в качестве механизм-зависимых ингибиторов эстераз и протеаз. Затем была получена высокорепрезентативная фаг-дисплейная библиотека иммуноглобулинов человека с представительностью 1,2х109 индивидуальных клонов, что является отличным показателем. Была отработана методика скрининга библиотеки антител с помощью синтезированных в лаборатории соединений методом фагового дисплея. Было отобрано антитело-антидот, способное взаимодействовать с рядом фосфорорганических токсинов и нейтрализовать их. Была разработана система экспрессии в виде клонов трансфектом, стабильно продуцирующих иммуноглобулины человека, была проведена оптимизация условий экспрессии клонов в виде полноразмерных антител в эукариотических системах. Затем была оптимизирована технология выделения антител и проведена проверка антител на наличие эстеразной, амидазной, протеолитической типов активности, а также на взаимодействие с ингибиторами. Был проведен скрининг фаг-дисплейной библиотеки и отобрано 8 ковалентно-связывающих фосфонат и 7 нековалентно связывающих клонов. Для всех ковалентно-связывающих клонов были проведены кинетические исследования. На основе анализа данных кинетики был выделены наиболее реакционно-способные клоны с кинетической эффективностью, сравнимой с аналогичными данными для бутирилхолинэстеразы. Для дальнейшего улучшения констант взаимодействия антитела и токсинов были получены структурные и термодинамические, кинетические и другие физико-химические данные о каталитическом антителе. На основе этих данных было сделано компьютерное предсказание замен, способных улучшить константы взаимодействия и получены мутантные антитела. Физико-химические и каталитические свойства всех полученных мутантных форм были охарактеризованы. На основании сравнения констант связывания выбраны клоны с лучшими характеристиками для дальнейшего направленного улучшения их свойств. Был осуществлен отбор наилучших клонов в качестве новых биокатализаторов, способных превращать ядовитые фосфорорганические соединения в безопасные вещества. Разработанный подход может быть использован для определения субстратной специфичности антител-антидотов, а также дает возможность рационального дизайна с целью улучшения нейтрализующих свойств антител-антидотов. 2. Созданная научная продукция является конкурентной и публикабельной в ведущих научных изданиях. 3. Научные решения являются новыми и представляют собой сочетание методологий, применяемых в ведущих научных группах. Результат основан на известных принципах и положениях, при этом имеет уровень, сопоставимый с передовыми научными школами, и соответствует современным тенденциям развития науки в данной области. 4. В результате проделанной работы было получено антитело-антидот с высокой эффективностью, не имеющее аналогов в мире, а также оригинальная технологическая платформа для рационального дизайна антител, обладающей заданной каталитической активностью