ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Настоящий проект будет посвящен изучению субэпидермального спикульного комплекса представителей филогенетически далеких групп: Nudibranchia и Acochlidiimorpha. Полученные данные по взаимному расположению спикул и морфологии спикульного комплекса этих групп помогут в понимании микромеханики минерализованных тканей. Изучение химического состава минерального компонента спикул, их гистологии и тонкого строения на разных стадиях созревания внесут существенный вклад в понимание процессов биоминерализации внутриклеточных спикул, и станут основой для исследований этих процессов на молекулярном уровне. Полученные данные по пространственной и структурной организации спикульного комплекса, а также их ультраструктуры для изучаемых видов станут новыми для науки и лягут в основу дальнейшего, более глубокого, изучения процессов формирования и синтеза спикул, включающего исследования биохимии и регкляции процесса.
Biocomposites the materials consisting of two or more components, having significantly different physical and chemical properties, and at least one of the components is naturally occurring. Biological composites first appeared in the sea millions of years ago. Their origin is related to the processes of biomineralisation, which allowed solid skeletal structures to evolve. That resulted in the Cambrian explosion, during which many invertebrates developed a high diversity of solid skeletal and feeding structures. Both biologically induced and controlled mineralisations facilitated the origin of solid materials, which protect living organisms from the harsh environments. It is hard to overestimate the significance of studying biocomposite materials, as they have a high potential for medical use and the creation of biomimetics, which can be used in a broad range of industries, including space. Despite that, the knowledge of formation mechanisms, growth and renewal of animal mineral structures is limited to several species, most important in practical use, and does not cover the diversity seen in the living systems. By widening the range of the research objects and types of biomineralization, one may find new, previously unknown models of biocomposite materials’ formation. The process of controlled biomineralization includes the formation of the organic matrix of protein or polysaccharide origin, which determines the crystals’ growth. Biomineral structures are widely distributed among invertebrates. These include coral skeletons, arthropod exoskeletons, mesodermal echinoderm skeletons, annelid jaws, molluscan and brachiopod shells, molluscan radulae, diverse skeletal elements of molluscs, e.g., plates, external scales, internal spicules, etc. For deuterostomes, e.g., echinoderms and vertebrates, the internal mesodermal skeleton is characteristic, while the protostomes, which include molluscs, usually have external ectodermal skeletal elements, such as shells. However, among gastropod molluscs, there may be intracellular skeletal structures exceptional for protostomes, that is, the subepidermal spicules. The subepidermal spicules are reported only for three groups of the shell-less Gastropoda — Rhodopoidea, Nudibranchia and Acochlidiimorpha. At the same time, the mechanisms of formation and mineralisation of the subepidermal spicules in these groups are still not known. The detailed morphology of the spicules is studied only for several representatives of Nudibranchia, whereas the data on Rhodopoidea are scarce, and those on Acochlidiimorpha are absent. This project aims to study the diversity of formation patterns of the mineral biological structures in the case of the intracellular spicules of the gastropod molluscs.
Основной методологический подход, который будет использован в проекте – сравнительно-морфологический. Он включает все основные классические и современные методы микроскопии (световая, сканирующая и трансмиссионная электронная, конфокальная лазерная сканирующая), также метод компьютерной микротомографии, анализ элементного состава биокомпозитных материалов с помощью функционала EDS сканирующего электронного микроскопа и Рамановской спектроскопии для определения основных минералов в составе твёрдых скелетных элементов. Основные морфологические методы и подходы для решения поставленных задач по проекту отработаны участниками коллектива в течении многих лет работы с беспозвоночными, в том числе с безраковинными гастроподами. Объектами исследования были выбраны широко распространенные в Белом море 5 видов голожаберных моллюсков Onchidoris muricata, Adalaria proxima, Acanthodoris pilosa, Cadlina laevis, Palio dubia и встречающиеся акохлидиды в Белом море: Asperspina cf. brambelii и в Баренцевом – A. murmanica. Все виды несут в теле субэпидермальные спикулы, особенности строения которых до сих пор остаются не известны, а химический состав минерального компонента вовсе никогда не был определен. Данный проект предполагает комплексный подход к изучению уникальных субэпидермальных спикул Nudibranchia и Acochlidiimorpha на разных этапах онтогенеза, сочетая исследования сразу на нескольких уровнях организации объектов: от наблюдения за живыми животными до гистологических методов. В рамках решения каждой задачи планируется использование ряда взаимодополняющих и верифицирующих друг друга методов, что обеспечит получение полной информации об особенностях строения спикульного комплекса. Методы исследования. Сбор материала. Сбор голожаберных моллюсков 5 видов будет осуществлен легководолазным методом и вручную на литорали в окрестностях ББС МГУ им. Н.А. Перцова (Белое море) с глубины 10-20 м. Моллюски всех видов будут собраны на разных стадиях онтогенеза, как в половозрелом состоянии, так и ювенили. Сбор живых акохлидиид будет производиться с использованием анестетика и промывки через мейобентосный сачок. Для этого будет собран песчаный грунт (средняя и нижняя литораль близ пос. Дальние Зеленцы, Баренцево море) или хорошо промытая битая ракуша Modiolus modiolus легководолазным методом (Белое море), после чего субстрат будет залит изотоническим раствором хлорида магния (для открепления моллюсков от частиц субстрата) и промыт через мейобентосный сачок с диаметром ячеи 65 мкм. Поиск моллюсков будет производиться под бинокуляром. Будут отобраны особи разных размеров. Прижизненные наблюдения. Сразу после сбора объекты будут помещены в чистую фильтрованную морскую воду при температуре +10..+12 или в проточную систему морских аквариумов. Собранные моллюски будут сфотографированы с помощью стереомикроскопа Olympus SZ51, Leica M 165 (Leica, Germany) и телефона iPhone 5C с приставкой к микроскопу iDu Optics LabCam. Подготовка перед фиксацией. Перед осуществлением фиксации моллюски будут расслаблены с помощью раствора MgCl2, изотоническому морской воде. Для фиксации животных, обитающих в Белом море (24-26‰), протокол приготовления раствора: 5.08 г MgCl2x6H2O на 100 мл. Для животных, обитающих в условиях океанической солености (33-35‰) на 1 долю MgCl2x6H2O 13 долей дистиллированной воды. Расслабление будет проводиться при температуре их содержания. Изучение отдельных спикул. Для изучения отдельных спикул, разные участки тела будут помещены в раствор 10 % раствор гипохлорита натрия (NaOCl) при комнатной температуре до полного растворения мягких тканей в течении 10–15 мин. Далее спикулы будут промыты дистиллированной водой. Полученные тотальные препараты будут изучены с помощью светового микроскопа, а также проведены промеры с использованием масштабного отрезка или электронной линейки. Длина многоосных спикул будет оценена по длине главной оси. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) позволит изучить как внешнюю морфологию отдельных частей спикульного тракта, отдельных спикул, так и их внутреннюю морфологию. Для изучения методом СЭМ, особи будут зафиксированы 2,5% глютаровым альдегидом на модифицированном какодилатном буфере (Lavrov et al., 2022). Фиксация будет проведена при температуре +4℃ на качалке со сменой раствора через час. После раствор будет сменен на буфер, смена которого будет производиться 3 раза каждые 20 минут. После отмывки буфером объекты будут дегидратированы. Для этого раствор буфера будет сменен на этиловый спирт восходящих концентраций 10%, 30%, 50%, 70%, 85%, 96%. На каждом этапе спирт будет сменен трижды после 20 минут экспозиции при комнатной температуре на качалке. Затем объекты будут помещены в смеси 96% спирта с ацетоном в соотношении 3:1, 1:1, 1:3, (3 смены по 20 минут). После раствор будет сменен на чистый ацетон дважды. Затем объекты будут помещены в контейнеры для сушки в критической точке. Для изучения объектов на СЭМ объекты будут приклеены на углеродный скотч и напылены золотом или смесью платины и палладия. Световая микроскопия, методы гистологической окраски. Для понимания особенностей гистологии и цитологии спикульного комплекса моллюсков будут изготовлены полутонкие срезы толщиной 1 мкм. Фиксация аналогична описанной для СЭМ. Постфиксация будет осуществляться 1% тетраксидом осмия (OsO4) в течении 2 часов в темноте при комнатной температуре. Затем раствор осмия будет сменен 3 раза буфером. После объект будет дегидратирован с помощью спирта и ацетона аналогично описанному для СЭМ. Дальнейшие манипуляции с объектом будут направлены на пропитывание объект эпоксидной смолой для заливки в блок. Для этого объект проведут по смесям ацетона и смолы в соотношениях 3:1, 1:1, 1:3 соответственно в течение суток в каждой смеси при комнатной температуре на качалке. После этого объект будет помещен на силиконовый коврик в чистую смолу для создания блока. Матрасик с блоками будет выдерживаться сутки в термостате при температуре 37℃, затем при температуре 60℃. После заливки в блок, объекты будут разложены на серии полутонких срезов с помощью микротомов LKB Bromma 2088 Ultratome V (LKB, Швейцария), Leica EM UC6 (Leiсa, Германия), Leica UC7 (Leiсa, Германия) с использованием алмазного ножа (Histo Jumbo, Diatome, Biel, Швейцария и PELCO 12785SU, Ted Pella, США). Для последующего изучения срезы будут окрашены раствором метиленового синего, толуидинового синего, а для выявления органического материала внутри спикул также будут применены полихроматические окраски с помощью основного фуксина. Окрашенные препараты будут изучены с помощью микроскопов Nikon Eclipse E200 и Leica DM 2500. Серии срезов будут оцифрованы с помощью слайд-сканера Olympus. Трехмерная реконструкция. По сериям полутонких срезов разных частей тела половозрелых моллюсков будут изготовлены трехмерные реконструкции специализированных спикулогенных клеток – склероцитов, что позволит понять особенности их строения. Для этого фотографии срезов будут преобразованы в 8-битный формат. Затем выровнены в стопки с использованием программного обеспечения AMIRA 5.2.2 (Amira Visaging GmbH, Германия). Компьютерная трехмерная реконструкция будет изготовлена в программе Imaris 7.0.0 (Bitplane AG, Zurich, Швейцария), по методу Рутенштайнера и Хеса (Ruthensteiner & Heß, 2008). Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ). Позволит изучить ультратонкое строение, цитологические особенности строения спикул и их окружения. Ультратонкие срезы изготавливаются аналогично полутонким на ультратомах, толщина срезов достигает 70 нм. Ультратонкие срезы будут смонтированы на бленды, контрастированы 1% уранилацетатом при температуре 37°С в течении 40-60 минут, затем цитратом свинца в течении 5-10 минут при комнатной температуре, отмывка дистиллированной водой будет производиться после каждого этапа контрастирования. Ультратонкие срезы будут изучены с помощью трансмиссионных электронных микроскопов JEM-1011, JEM 100B, JEOL JEM 1400 Flash (JEOL, Япония). Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (КЛСМ). Позволит детектировать коллаген на разных стадиях онтогенеза в спикулах, окрасить ядра, а также мышечные клетки. Для изучения методом КЛСМ фиксация будет осуществляться 4% параформальдегидом на фосфатном буфере. Фиксация в течении 4 часов на качалке при температуре +4℃. После раствор трижды будет сменен на фосфатный буфер. Для детектирования коллагена будет производиться иммуногистохимическая окраска с использованием антител Anti-Collagen I (rabbit) (DAR 647, Invitrogen), окраска ядер — красителя Propidium Iodide solution (PI, 5 μg/ ml in PBS, Sigma) и DAPI (10 μg/ml in PBS, Sigma), мышц — Phalloidin fluorescencein (FITC, F432, Sigma-Aldrich), Phalloidin (TRITC, P1951, Sigma-Aldrich). Образцы будут просветлены с помощью глицерина или раствора Murray’s Clear (1 часть бензилового спирта к 2 частям бензилбензоата). При детектировании в составе спикул минералов с содержанием кальция будет возможно изучить зоны минерализации спикул. Для этого будет использована отработанная участниками коллектива методика работы с кальцеином (кальцеина динатриевая соль (1 мкг/мл в морской воде) Honeywell Fulka, Santa Cruz Biotechnology). Подготовленные образцы будут исследованы с помощью конфокального микроскопа Nikon A1R-A1 (Nikon Corporation, Япония) и флуоресцентного микроскопа Leica DM 2500 с лампой EBQ-100 (Leica, USA). Компьютерная микротомография (µCT). Неинвазивный метод, который позволяет без препарирования изучить взаимное расположение спикул в разных частях тела моллюсков. Данный метод позволит быстро выявить различия в строении спикульных комплексов особей на разных этапах онтогенеза, а также сравнить спикульные комплексы моллюсков разных родов. Помимо этого, метод может быть использован для косвенной оценки плотности отдельных спикул. Пробоподготовка аналогична описанной для СЭМ. Второй способ подготовки образцов для изучения: фиксация и хранение в 96% этиловом спирте. В этом же растворе особей можно изучать с помощью микротомографа. Строение спикульного комплекса будет исследовано на микротомографе ScyScan 1270 (Bruker, Belgium). Параметры съемки будут подобраны индивидуально для каждого образца. Элементный анализ. Позволит оценить качественный и количественный состав химических элементов в спикулах на разных этапах онтогенеза. Пробоподготовка аналогична СЭМ. Анализ будет осуществлён с помощью специализированной EDS системы в сканирующем электронном микроскопе Jeol 7000. Рамановская спектроскопия. Незаменимый метод для идентификации минеральных компонентов в спикулах. Для данного анализа отдельные спикулы будут выдержаны в растворе гипохлорита натрия для удаления органического компонента. После чего будут отмыты в пяти сменах дистиллированной воды, высушены на воздухе и смонтированы на углеродный скотч. Изучение будет произведено с помощью Рамановского спектрометра Olympus U-CTR30-2.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Внутриклеточные биокомпозиты моллюсков: разнообразие, морфология и минерализация. Первый год. |
Результаты этапа: | ||
2 | 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. | Внутриклеточные биокомпозиты моллюсков: разнообразие, морфология и минерализация. Второй год. |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".