Выяснение общих закономерностей структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариотНИР

The clarification оf general patterns of structural organization of nuclear and cytoplasmic organelles of eukaryotic cells

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Выяснение общих закономерностей структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот
Результаты этапа: 1)Для поиска новых ингибиторов трансактивации вируса иммунодефицита человека проведен анализ баз данных на предмет идентификации активности известных ингибиторов, механизмов трансактивации, способов выявления трансактиваторной активности, а также алгоритмов поиска ингибиторов трансактиваторной активности. 2)Исследован процесс реорганизации хроматина при репликации ДНК на модели хроматина растений с аномально крупным геномом. Показано, что гетерохроматин подвергается обратимой деконденсации на уровне хромонемных элементов непосредственно в сайтах репликации. 3)На основе Mycolicibacterium smegmatis получен рекомбинантный штамм, экспрессирующий P450scc-систему коры надпочечников быка, активно синтезирующий прегненолон, однако вследствие наличия в клетках систем, осуществляющих деградацию стероидов, прегненолон трансформируется в прогестерон. При использовании в качестве субстратов биоконверсии 3-метоксиметилового эфира холестерола в оптимизированных условиях рекомбинантный штамм продуцировал 85,2±4,7 мол. % 3-метоксиметилпрегненолона в течение 48 ч. После снятия защиты с 3-метоксиметильной функции кислотным гидролизом был выделен кристаллический прегненолон высокой чистоты (более 98% по массе). Полученные результаты открывают перспективы создания новых микробных биокатализаторов, способных эффективно производить стероидные соединения. 4)С использованием полицистронных плазмид была получена панель штаммов E. coli - BL21(DE3)pLys, С41, Rosetta(DE3)pLys, HMS174 и BL21(DE3) с реконструированной Р450scc-системой быка и белком STARD1 или STARD3 человека для эффективной трансформации холестерина в прегненолон, являющийся общим предшественником всех стероидных гормонов млекопитающих. Проведена оценка уровней экспрессии гетерологичных кДНК и стабильности гетерологичных белков в полученных клетках. Ультраструктурный анализ показал, что экспрессия 4-х гетерологичных генов млекопитающих в клетках данных штаммов не приводит к изменению их морфологии и что синтезирующиеся гетерологичные белки не образуют телец включения и, следовательно, приобретают нативную конформацию. Проведено определение эффективности трансформации холестерина в прегненолон полученными штаммами. Обнаружено, что активность P450scc системы варьирует в зависимости от использованного гена белка-переносчика (например, при использовании STARD1 или STARD3 и клеток BL21(DE3) она возрастает в ~ 1,9 и ~ 3,2 раза соответственно) и в зависимости от используемого штамма клеток. В качестве наиболее перспективного штамма выбраны клетки E. coli Rosetta(DE3)pLys – в случае использования STARD3 активность P450scc системы в данных клетках превышает ее активность в клетках BL21(DE3) более чем на порядок (в ~ 11,3 раза). 5)Проведено исследование молекулярных маркеров в разных компартментах эякулятов молодых мужчин на уровне протеома и транскриптома малых некодирующих РНК (мнРНК). В семенной плазме (СМ) идентифицировано 420 белков, а во внеклеточных везикулах (ВВ) – 979 белков. Из них 27% (299 белков) являются общими для обоих компартментов, 121 (11%) – специфичны для СП и 680 (62%) – специфичны для ВВ. Наиболее сильно экспрессирующимися в СП оказались простат-специфический антиген (KLK3), простатная кислая фосфатаза (PPAP) и пролактин-индуцируемый белок (PIP). Простатная кислая фосфатаза сильнее всего представлена во ВВ, где ее концентрация примерно в 20 раз выше, чем в СП. Уникальным для ВВ белком оказался белок обмена хлорид-анионов (S26A3), который не обнаружен ни в одном из образцов СП. С помощью секвенирования транскриптомов мнРНК во ВВ идентифицировано 256 miRNA, 62 piRNA, 159 зрелых tRNA и 77 фрагментов tRNA (tsRNA). В сперматозоидах более широко представлены piRNA (230), тогда как мнРНК остальных классов меньше: 104 miRNA, 136 зрелых tRNA и 13 tsRNA. Из всех идентифицированных мнРНК 94 miRNA, 44 piRNA, 128 зрелых tRNA и 8 tsRNA присутствуют и во ВВ, и в сперматозоидах, 162 miRNA, 18 piRNA,31 зрелых tRNA и 69 tsRNA обнаруживаются только во ВВ и, наконец, 10 miRNA, 186 piRNA, 8 зрелых tRNA и 5 tsRNA обнаруживаются только в сперматозоидах. Во ВВ 7 miRNA (miR-370-3p, miR-381-3p, Mir-320-P4_3p, miR-187-3p, miR-27a-3p, miR-1224-5p и miR-146a-5p) имеют четко выраженную негативную, а piR-28763 – позитивную корреляцию с уровнями KLK3. 6)Проведен анализ транскриптомов и ДНК-метиломов растений арабидопсиса при формировании передаваемой между поколениями растений эпигенетической памяти на повторяющийся биотический стресс (инфекция паразитическим растением повиликой). Идентифицированы гены, играющие роль главных регуляторов защитных ответов растения-хозяина на данный биотический стресс, а также гены – предполагаемые носители эпигенетической памяти. 7)На модели клеток ВНК21, содержащих виментиновые и десминовые промежуточные филаменты, исследовали механизмы контроля митохондриальных функций в клетках со смешанной сетью промежуточных филаментов. Нокдаун одного или обоих белков промежуточных филаментов в этих клетках при помощи РНК-интерференции или нокаута соответствующих генов показал, что при удалении любого из них мембранный потенциал митохондрий оставался на том же уровне, что и в присутствии двух белков. Удаление двух белков одновременно приводило к снижению потенциала на 20%. Таким образом, виментин и десмин играют одинаковую роль в поддержании мембранного потенциала митохондрий. 8)Изучены данные пациентов (n = 90) с первичной цилиарной дискинезией (ПЦД) . При трансмиссионной электронной микроскопии обнаружено полное отсутствие наружных и внутренних динеиновых ручек (51 %) и внутренних динеиновых ручек (17,9 %) в аксонемах ресничек дыхательного эпителия. Полноэкзомное секвенирование выполнено у 55 (61,2 %) пациентов. Наиболее распространенными были генетические варианты в генах DNAH5 и HYDIN. Проведено электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов 10 пациентов с полной потерей подвижности жгутиков сперматозоидов. Отсутствие наружных и внутренних динеиновых ручек аксонемы жгутиков сперматозоидов обнаружено в 3 образцах. При полноэкзомном секвенировании обнаружен патогенный вариант нуклеотидной последовательности c.461A > C в экзоне 4 гена CCDC103 в гомо/гемизиготном состоянии у сибсов с ПЦД, у их фертильного брата – в гетерозиготном состоянии. 9)При ультраструктурном и иммунофлуоресцентном анализе сперматозоидов пациентов с глобулозооспермией выявлены особенности организации ядерной периферии: изменение формы ядра, аномальное распределение ламина В1, а также аномальное для сперматозоидов сохранение ядерных пор в ядерной оболочке вне зависимости от степени конденсации хроматина. 10)Проведено исследование особенностей тублинового цитоскелета в клетках морских губок. Единственными тубулиновыми структурами, наблюдаемой в дифференцированных клетках губок, являются жгутики хоаноцитов, состоящие из ацетилированного тубулина, и веретена деления. Методами микроскопии видимого света и просвечивающией электронной микроскопии показано, что тубулиновый цитоскелет временно формируется в клетках губок на этапе трансдифференцировки при формирования нового организма из отдельных клеток. 11)Применен инновационный метод исследования биологических структур – микроскоп экстремального ультрафиолетового диапазона (ЭУФ) с высокоапертурным зеркальным объективом прямого падения. Данный прибор позволяет получать изображения с латеральным разрешением (предельным) 31 нм и аксиальным разрешением порядка 100 нм в сочетании со съемкой серий оптических срезов. Были изучены несколько биологических структур: гистологические срезы стеблей растений, тканей животных – кость и легкое, а также приготовленные по методике пробоподготовки для электронной микроскопии ультратонкие срезы сетчатки глаза крысы. Отличительной особенностью всех изученных препаратов является «ажурность» – или исходно присущая материалу ячеистая структура, или искусственно созданные в процессе пробоподготовки резкие вариации контраста. Проведен корреляционный анализ с использованием методов световой, трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии.
2 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Выяснение общих закономерностей структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот
Результаты этапа: 1.Завершен анализ транскриптомов и полных ДНК-метиломов растений арабидопсиса при их заражении паразитическим растением повиликой (Cuscuta campestris), а также при воспитании частичной устойчивости к такому заражению в последовательных поколениях растений, культивированных в условиях постоянного инфицирования повиликой. Показано, что однократное заражение приводит к индукции большой группы (несколько сотен) генов, преимущественно связанных с ответами растений на абиотические и биотические стрессы, в том числе с генами первичного (индуцированного молекулярными паттернами патогенов) и вторичного (индуцированного эффекторными молекулами патогенов) иммунитета. При воспитании частичной устойчивости наблюдается специфическая индукция двух групп генов, одна из которых преимущественно связана с реакциями растений на свет, в том числе фотоморфогенезом, и циркадными ритмами, а вторая – с системой белков теплового шока и других шаперонов. Следует подчеркнуть, что при однократном заражении повиликой контрольных растений индукции этих генов не наблюдается. Очевидно, именно с изменением их экспрессии связано частичное повышение устойчивости к повилике. Наш анализ позволил выявить гены, продукты которых в каждой из упомянутых групп генов выполняют роль главных регуляторных факторов. Кроме того, сравнивая изменения транскриптомов и ДНК-метиломов при воспитании частичной устойчивости, мы идентифицировали гены, для которых изменяются и экспрессия, и метилирование. Очевидно, эти гены являются наиболее перспективными кандидатами на роль носителей эпигенетической памяти, лежащей в основе эффекта воспитания частичной устойчивости. 2.Исследована роль генов NUP153 и POM121 в регуляции эластичности ядерной мембраны на экспериментальной модели ядерных почек. Для этого изучены эффекты избирательного ингибирования этих генов с помощью коротких интерферирующих РНК собственно на их экспрессию и на формирование ядерных почек. 3.Проведена экспериментальная оптимизация экспрессии человеческого белка-транспортера холестерина STARD3 в бактериальной системе биотрансформации стероидов на основе гетерологичной системы P450scc крупного рогатого скота. Для этого ген STARD3 экспрессировали в клетках Escherichia coli вместе с тремя генами системы P450scc (цитохрома P450scc (CYP11A1), адренодоксина и адренодоксин-редуктазы). Сравнивали различные стратегии экспрессии STARD3, такие как использование сигнальных пептидов pelB или TorA для выхода белка в периплазму, а также различные штаммы E. coli для достижения максимального уровня биотрансформации холестерина. Ни один из вариантов сигнального пептида не обеспечивал эффективного транспорта белка STARD3 в периплазму, но и оставаясь в цитоплазме и клеточной мембране, он сохранял способность транспортировать холестерин. Аутоиндукция лактозой обеспечивала более высокие уровни экспрессии генов STARD3 и системы P450scc по сравнению с индукцией IPTG. Среди протестированных штаммов E. coli  [BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3), C41(DE3), и Rosetta(DE3)pLysS], самый высокий уровень экспрессии гена STARD3 и наиболее существенная стимуляция биотрансформации холестерина наблюдались при использовании штамма Rosetta(DE3)pLysS. В этом штамме экспрессия STARD3 увеличивала активность системы P450scc примерно в три раза. В сумме использование STARD3 и штамма Rosetta(DE3)pLysS увеличило уровень биотрасформации холестерина в семь раз по сравнению с ранее разработанной системой в штамме BL21(DE3). Эти результаты могут быть использованы как основа для дальнейшей оптимизации биотехнологических систем продукции стероидов в бактериальных штаммах. 4.В качестве альтернативного хозяина для экспрессии стероидогенной системы млекопитающих (цитохром P450scc-адренодоксин-адренодоксин редуктаза) иссследованы метилобактерии Methylorubrum extorquens. Их преимуществами по сравнению с другими бактериями являются способность расти на дешевых минеральных средах и использовать метанол в качестве источника углерода и энергии, а также отсутствие собственной системы катаболизма стероидов. Разработанный рекомбинантный штамм метилобактерий продуцировал из холестерина ценный стероид прегненолон в качестве единственного продукта биотрансформации. Были исследованы эффекты различных параметров культивирования микобактерий на выход прегненолона. В оптимальных условиях он превысил 100 мг на литр культуры. Эти результаты демонстрируют перспективность метилобактерий для биотехнологического производства стероидных соединений. 5. Ультраструктура аксонем ресничек пациентов (n = 109) с предполагаемой первичной цилиарной дискинезией (ПЦД) изучались в материале браш-биопсий дыхательного эпителия. Нормальная структура аксонем обнаружена в 29 образцах (27%), дефект внутренних динеиновых ручек (IDA) - в 20 образцах (18%), комбинированные дефекты наружных и внутренних динеиновых ручек (ODA+IDA) - в 55 образцах (50%), небольшое количество ресничек в реснитчатых клетках - в одном образце (1%), дефект дуплетов периферических микротрубочек аксонемы - в двух образцах (2%), дефект центрального аппарата аксонемы - в двух образцах (2%). Полноэкзомное секвенирование выполнено у 109 пациентов (МГНЦ). Чаще всего встречались варианты в генах DNAH5, CFAP300, DNAAF11(LRRC6), DNAH11. 6. В образце экулята пациента с бесплодием выявлена аномальная структура акросомы сперматозоиов - отслоение акросомы от ядра у 49% сперматозоидов. Полноэкзомное секвенирование выявило новый вариант неизвестного клинического значения в гене ACTRT1 (Xq25), который был гемизиготным у пациента и гетерозиготным у его матери, что было определено с помощью секвенирования по Сэнгеру (МГНЦ). Консерватизм и моделирование белков позволяют предположить, что выявленный вариант оказывает негативное влияние на белок, что может способствовать развитию синдромной патозооспермии. Таким образом, показано, что гемизиготные варианты гена ACTRT1 могут вызывать Х-сцепленную спермопатологию. 7. Получены новые приоритетные данные о белке JAKMIP2 (Janus Kinase And Microtubule Interаcting Protein 2), также известном как NECC1 (neuroendocrine long coiled-coil protein 1). Он был ранее описан как белок, связанный с мембранами аппарата Гольджи, и возможно, имеющий отношение к внутриклеточному транспорту секреторных везикул. Мы впервые продемонстрировали, что JAKMIP2 присутствует не только на поверхности Гольджи, но и на центросомах клеток различных линий/ Продемонстрировали, что количество эндогенного белка зависит от фазы клеточного цикла: во время митоза количество JAKMIP2 на центросомах снижается. При экспрессии даже на самом низком уровне флюоресцентно-слитого JAKMIP2 в клетках уменьшается количество ацетилированного тубулина (что свидетельствует о дестабилизации микротрубочек). Кроме того, центросома (на которую экзлгенный белок, судя по всему, доставляется посредством минус-концевого транспорта вдоль микротрубочек) перестаёт выполнять функции ЦОМТ и тубулиновый скелет постепенно дезорганизуется. Эксперименты по восстановлению предварительно деполимеризованных микротрубочек при отмывке нокодазола показывают замедление (но не прекращение) нуклеации микротрубочек на центросомах при наличии на них экзогенного JAKMIP2. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание процессов (пере)распределения белков, осуществляющих функции нуклеации и заякоривания микротрубочек, между различными ЦОМТами. 8.Путём элиминации в культивируемых клетках центриолей посредством ингибирования киназы Plk4, с последующей трансфекцией клеток генетическими конструктами, кодирующими малую ГТФазу Arl4C дикого типа, доминантно-негативную и конститутивно-активную, были получены новые данные об участии Arl4C в процессах нуклеации микротрубочек. Впервые участие данного белка в этом процессе мы описали в прошлом году. Удаление из клеток основного центра организации микротрубочек – центросомы – позволило без помех исследовать процессы нуклеации в цитоплазме на мембранах альтернативных не-центросомных ЦОМТов. 9.Методом прижизненных наблюдений в клетках мыши линии 3Т3, экспрессирующих GFP-меченые TALEN-белки, связывающиеся in vivo с повторами главного сателлита были обнаружены события движения индивидуальных блоков прицентромерного гетерохроматина в клетках мыши, причем наблюдалось неожиданное явление отделения индивидуальных фрагментов, предположительно соответствующих прицентромерным зонам индивидуальных хромосом от ассоциаций таких блоков. Параллельно данные электронной микроскопии показывают, что часть таких гетерохроматиновых блоков - хромоцентров - не просто связаны с ядерной оболочкой, а ассоциируются со складками внутренней ядерной мембраны. 10. Для комплексного изучения молекулярных маркеров сперматозоидов и других компонентов эякулята были использованы последовательные процедуры работы с образцами из одного эякулята по выделению внеклеточных везикул из аликвот малого объема семенной плазмы, анализа протеома и профиля малой РНК. Эти методы включают фракционирование эякулята в градиенте плотности, ультрацентрифугирование семенной плазмы в градиенте плотности сахарозы для выделения внеклеточных везикул, сочетанное выделение ДНК и РНК из одного образца, подготовка библиотек малых РНК, РНК-секвенирование, панорамная хромато-масс-спектрометрия высокого разрешения триптических гидролизатов белков, биоинформатическая обработка данных, количественная валидация белков с использованием стабильных изотопно-меченых пептидов-стандартов (SRM), валидация малых РНК с использованием ПЦР в реальном времени. С помощью панорамной масс-спектрометрии были идентифицированы и количественно охарактеризованы представленные во всех образцах 319 и 777 белков в семенной плазме и внеклеточных везикулах семенной плазмы, соответственно. 10 из этих белков были валидированы с помощью таргетной масс-спектрометрии с использованием изотопно-меченых пептидов. С помощью РНК-секвенирования были идентифицированы и количественно охарактеризованы 409 малых некодирующих РНК (включая 212 микроРНК, 44 пиРНК и 153 зрелых тРНК) и 79 фрагментов тРНК во внеклеточных везикулах семенной плазмы. В сперматозоидах были идентифицированы и количественно охарактеризованы 265 малых некодирующих РНК (включая 50 микроРНК, 96 пиРНК и 119 зрелых тРНК) и 15 фрагментов тРНК. Была оценена внутрииндивидуальная вариабельность для каждого из молекулярных маркеров и были идентифицированы белки и малые РНК с низкой вариабельностью в изучаемых средах. Были выявлены ряд белков и малых РНК с низкой вариабельностью среди 111 белков, 176 малых РНК и 12 фрагментов тРНК, которые ранее предлагались в качестве биомаркеров мужской фертильности и репродуктивных исходов: TRFL, CRIS3, AACT, ESPB1, GSTM3, A1AG2, SAMP, AMPN, NEP, FAS и miR-10b-3p, miR-122-5p, miR-205-5p, miR-222-3p, miR- 34c-5p, miR-509-3-5p, miR-888-5p, miR-892a, miR-363-3p, miR-941, miR-146a-5p, miR-744-5p. Эти молекулы имеют низкую внутрииндивидуальную вариабельность в парных эякулятах и могут быть перспективными кандидатами на роль биомаркеров мужской фертильности и репродуктивного здоровья. 11. Исследовали влияние ZMPSTE24 на восстановление индуцированных этопозидом двунитевых разрывов ДНК по пути негомологичного соединения концов (NHEJ).На фиксированных препаратах клеточной линии фибросаркомы человека HT1080 с использованием антител к 53BP1 и γH2AX показано, что под действием ингибиторов уровень исходных повреждений выше, а динамика исчезновения фокусов замедлена по сравнению с контролем. Более разнообразные тенденции выявлены в прижизненных экспериментах с транзиентной экспрессией GFP-меченого 53BP1. Такой подход позволил проследить индивидуальные траектории изменения числа фокусов в реальном времени. В контрольных клетках наблюдалось несколько паттернов репарации, включая быстрое разрешение повреждений. В условиях ингибирования ZMPSTE24 баланс паттернов смещался: преобладало накопление трудноразрешимых фокусов 53BP1, а скорость их исчезновения значительно снижалась. Это указывает на угнетение эффективности NHEJ и формирование устойчивых повреждений ДНК, что может иметь ключевое значение для понимания побочных эффектов терапии, основанной на блокировании ZMPSTE24. 12. Исследовали функциональную активность и взаимодействия отдельных цитоскелетных структур, в том числе, полимеризованных из разных изоформ (β- и γ-)  актина, как между собой, так и с другими клеточными органоидами. Используя полученные нами линии клеток REF52 лишенных одной из изоформ актина  (REF52-(betaAct-/-) и REF52-(gammaAct-/-)) исследовали (1) организацию цитоскелета клеток в отсутствии одной из актиновых изоформ, а также выяснили, (2) как разные изоформы немышечного актина взаимодействуют с виментиновыми промежуточными филаментами; (3) как отсутствие β- либо γ-актина влияет на физиологическую активность фибробластов (способность к распластыванию и направленному движению).  Используя 3D-SIM-микроскопию исследовали колокализацию β- и γ- актина в эндотелиальных клетках и показали их частичную колокализацию в определенных областях цитоплазмы, при этом оказалось, что в базальной части цитоплазме преобладает β-актин, а по мере перемещения к апикальной цитоплазме соотношение изоформ выравнивается. Оказалось, что такая вариабельность имеет важное значение для реализации барьерной функции эндотелия – разделение β- и γ-актиновых структур значительно усиливается во время активации эндотелиальных клеток в экспериментах, моделирующих дисфункцию эндотелиального барьера in vitro, что демонстрирует их различные роли в функциональной активности эндотелиальных клеток. 13. Для исследования роли внутренне неупорядоченных доменов белков в организации ядерных и цитоплазматических органелл анализировали особенности организации и эволюции внутренне неупорядоченного домена с чередующимися кислыми и основными участками на примере NPM1. Были собраны данные для 60 животных разных таксономических групп, разработан скрипт для автоматического картирования границ кислых и основных доменов и изучена эволюция организации домена. Установлено, что в ходе эволюции белка, хотя аминокислотныя последовательность неупорядоченного домена серьезно изменялась, особенность распределения кислых и основных доменов оставалась стабильной. При этом наиболее константным признаком оставалось отношения заряда кислого домена к заряду основного домена, что по-видимому и определяет функциональность домена. Также исследовали возможность использования основного домена Tat белка вируса иммунодефицита человека в качестве клеточного проникающего пептида (CPP). Нам не удалось наладить эффективную доставку пептидов, что ставит вопрос о применимости этой системы. Созданы клеточные линии для анализа роли аминокислот, фланкирующих сигнала ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-40 (всего 8 клеточных линий).
3 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Выяснение общих закономерностей структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот
Результаты этапа: -
4 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. Выяснение общих закономерностей структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот
Результаты этапа: -
5 1 января 2028 г.-31 декабря 2028 г. Выяснение общих закономерностей структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот
Результаты этапа: -
6 1 января 2029 г.-31 декабря 2029 г. Выяснение общих закономерностей структурной организации ядерных и цитоплазматических органелл клеток эукариот
Результаты этапа: -

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".