Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеванийНИР

Epigenetic mechanisms of biological processes and their role in pathogenesis of oncological disease

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 13 апреля 2023 г.-31 декабря 2023 г. Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний
Результаты этапа: Изучено влияние вариантов и эпигенетических модификаций гистонов Н3.3, H2A.Z и H3K56Q на структуру нуклеосом. Установлено, что вариантные гистоны изменяют укладку нуклеосомной ДНК на октамере гисто- нов и ее динамику, модулируя стабильность нуклеосом и влияя, вероятно, тем самым на доступность нуклеосомной ДНК для ядерных факторов и на эффективность процессов транскрипции, репликации и репарации ДНК. На примере гистона Н3.3 показано, что вариантные гистоны влияют на способность фермента PARP1 модулировать структуру нуклеосом. Методом spFRET-микроскопии установлено, что линкерный гистон Н1.0, связываясь с нуклеосомой, не только сближает между собой линкерные участки ДНК, но и вносит изменения в структуру нуклеосомной ДНК. Эти структурные изменения происходят по всей длине нуклеосомной ДНК и сопровождаются увеличением расстояния между соседними супервитками ДНК. Установлено, что способность дрожжевого белкового комплекса FACT в присутствии белка Nhp6 к АТФ-независимому разворачиванию нуклеосом является универсальной и не зависит от вида гистонов, на которых сформированы нуклеосомы. Нуклеосомы, собранные на октамерах гистонов Homo sapiens, реорганизуются дрожжевым FACT в присутствии Nhp6 с образованием асимметричной, почти линейной структуры, такой же, как и в случае нуклеосом, собранных на октамерах гистонов Xenopus laevis. Были наработаны и очищены препараты белков HMO1, HMGB1 и полноразмерного yFACT, а также его мутантных форм, содержащих делеции одного или обоих С-концевых фрагментом субъединиц Spt16 и Pob3. Показано, что взаимодействие HMO1 с FACT, которое способствует АТФ-независимому разворачиванию нуклеосом, происходит по С-концам субъединиц Spt16 и Pob3, как и в случае гомологичного белка Nhp6. Апробирована методика дизайна пептидов, связывающихся с кислотным лоскутом нуклеосомы, на основе нейросетевого алгоритма ProteinMPNN. Для сгенерированных нейросетью полипептидных последовательностей с помощью нейросетевого алгоритма AlphaFold предсказаны структуры комплексов этих полипептидов с нукле- осомой. Эти структуры позволят провести in silico скрининг предложенных искусственным интеллектом пептидных последовательностей и отобрать наиболее перспективные пептиды для дальнейших исследований. Для измерения констант связывания флуоресцентно-меченых пептидов с нуклеосомами разработан протокол высокоточных измерений на основе анализа поляризации флуоресценции в малых объемах в планшетном формате. Разработаны программы для анализа данных, полученных в ходе измерений, и для определения константы диссоциации изучаемых комплексов. С использованием разработанного протокола определена константа диссоци- ации комплекса пептида LANA(1-22) с нуклеосомой. Для анализа взаимодействия белков р53 и PARP-1 с нуклеосомами получены флуоресцентно-меченые нуклеосомы,отличающиеся ротационной ориентацией сайта свя- зывания белка p53, расположенного на расстоянии 11 или 16 п.н. от границы нуклеосомы. Методом spFRET-микроскопии охарактеризована конформация линкерной ДНК и ее отличия для этих двух типов нуклеосом. Установлены изменения конформации нуклеосом при различной ротационной ориентации сайта связывания белка p53, и показано, что фермент PARP1 формирует различные комплексы с этими нуклеосомами. Для исследования влияния антираковых препаратов кураксинов на формирование Z-ДНК была создана плазмида, содержащей классическую Z-ДНК-образующую последовательность и разработана экспериментальная система для детекции Z-ДНК в негативно сверхспирализованной плазмидной ДНК. С использованием этой экспериментальной системы было определено, что на сверхспиральной плазмиде pYPCG32 Z-ДНК образуется в ожидаемом положении. Были получены высокочистые активные препараты РНК полимеразы II и фактора транскрипции TFIIS дрожжей. С помощью полимеразной цепной реакции получена матрица для сборки нуклеосом, позволяющая детектировать их положение после транскрипции с помощью рестриктного анализа. Разработан новый, оптимальный протокол флуоресцентного пульс-мечения РНК для анализа РНК-продуктов различной длины, образующихся при транскрипции in vitro. Получены нуклеосомы с однонитевыми разрывами нематричной цепи в положениях +12 и +22 нт от начала нуклеосомы и на них продемонстрирована применимость разработанного метода мечения РНК для изучения остановок РНК полимеразы, индуцируемых разрывом. В ходе экспериментов по транскрипции in vitro определено положение наиболее эффективной ник-индуцированной остановки РНКП при прохождении нуклеосом с разрывом нематричной цепи ДНК после 2 нт от входа в нуклеосому. Методом ПЦР-мутагенеза сконструирована матричная ДНК, позволяющая в ходе транскрипции в условиях ограниченного набора рНТФ получить элонгационный комплекс с РНКП, остановленной в этом положении независимо от наличия разрыва ДНК. Для изучения локальных изгибов центромерной ДНК пекарских дрожжей методом spFRET-микроскопии сконструированы и получены короткие флуоресцентно-меченые дуплексы ДНК с нуклеотидной последовательностью, которая, как предполагается, не вызывает образования изгиба (ранее были получены аналогичные дуплексы с последователь ностью участка центромерной ДНК). Исследования методом spFRET микроскопии показали отсутствие изгиба ДНК в сконструированных «прямых» дуплексах и тем самым дополнительно подтвердили наличие локального из- гиба в участке центромерной ДНК пекарских дрожжей, выявленного ранее методом spFRET микроскопии.
2 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний
Результаты этапа: Получен препарат белка Nhp6B и изучено его взаимодействие с ДНК. Показано, что связывание белков Nhp6А и Nhp6B приводит к деформации ДНК. Изменения в структуре ДНК, измеренные по эффективности Фёрстеровского резонансного переноса энергии, интерпретировали, как появление изгиба, который больше для Nhp6А, чем для Nhp6B. Изучение образования моно- и ди- тетрасом на тетрамерах гистонов Н3/Н4 X.laevis показало, что при недостатке тетрамера формируются моно- и ди- тетрасомы, а при соотношении 1:2 - только ди-тетрасомы. Показано, что в ди- тетрасомах частично реализуется нуклеосом-подобная укладка супервитков ДНК, а часть ди-тетрасом имеет альтернативную укладку, при которой расстояния между парами нуклеотидов 13/91, 35/112 и 57/135 не соответствуют расстояниям в нуклеосомах, существенно их превышая. Формирование структурированных субнуклеосомных и псевдонуклеосомных частиц с участием тетрамеров гистонов Н3/Н4 предположительно способствует поддержанию структуры хроматина во время ядерных процессов транскрипции и репликации, требующих временной диссоциации- реассоциации ядерных гистонов. Моделирование молекулярной динамики (МД) тетрасомы показало, что тетрамер гистонов стабильно связывает тетрасомную ДНК. При этом в микросекундном масштабе времен возможно динамическое нарушение контактов ДНК с гистонами (аналогично с откручиванием ДНК в нуклеосоме). В этом процессе может участвовать N-хвост гистона H4, препятствуя восстановлению исходных ДНК- гистоновых контактов. Глобулярная часть тетрамера гистонов (H3-H4)2 в составе тетрасомы обладает пластичностью как в вдоль оси супервитка ДНК, так и перпендикулярно ему, что важно для поддержания стабильной структуры тетрасомы в условиях торсионного стресса, связанного со сверх-спирализацией ДНК. Изучено влияние вариантных гистонов H2A.Z и Н3.3, а также миметика ацетилирования H3K56 на структуру нуклеосом, их комплексов с ферментом PARP1, участвующим в репарации ДНК, а также на структуру нуклеосом, высвобождающихся из комплексов с PARP1 в результате реакции поли-АДФ- рибозилирования. Выявлен и описан сложный характер воздействия этих гистонов на структуру нуклеосом и их комплексов, которое в зависимости от типа гистона или их комбинации может вызывать, усиливать, снижать или отменять реорганизацию нуклеосом, существенно модулируя, тем самым, доступ ядерныхИсследование флуоресцентно-меченых кор-нуклеосом, однолинкерных и двухлинкерных нуклеосом в комплексе в линкерным гистоном Н1.0 методами гель- шифт анализа и spFRET-микроскопии показало, что вне зависимости от наличия и числа линкерных участков ДНК образование комплексов стехиометрии 1:1 сопровождается структурными перестройками, затрагивающими всю нуклеосомную ДНК. Установлено, что тетрасомы, как и нуклеосомы, подвергаются реорганизации шапероном гистонов FACT. По данным электронной микроскопии реорганизованные тетрасомы не обладают асимметрией, их структура менее линейная, а их комплексы более компактные в сравнение с реорганизованными FACTом нуклеосомами. Установлено, что HMGB1 способен образовывать комплексы с FACTом (с димером Spt16/Pob3), однако он теряет эту способность при делеции С-концевого фрагмента хотя бы у одной субъединицы димера. Делеция С-концевого фрагмента у субъединицы Spt16 приводит к полной потере способности FACT к АТФ- независимому разворачиванию нуклеосом в присутствии белка HMO1, при сохранении этой активности в присутствии Nhp6. Разворачивания нуклеосом в присутствии HMGB1 мутантами содержащими делеции С-концевых фрагментов субъединиц не происходит. С использованием методов искусственного интеллекта и МД предсказаны последовательность и структура пептидов, нацеленных на связывание с кислотным лоскутом нуклеосом. Два наиболее перспективных пептида были синтезированы и в исследованиях показано их связывание с нуклеосомами с константами диссоциации 20 и 26 мкМ. Пептиды оказывают стабилизирующее действие на структуру нуклеосом. Установлено, что образование комплекса нуклеосом с PARP1 не препятствует связыванию c нуклеосомами ДНК-связывающего домена белка p53, которое не приводит к вытеснению PARP1 из комплексов. В тройных комплексах р53- нуклеосома-PARP1 происходит ограниченная реорганизация структуры нуклеосомы в области линкерной ДНК, не сопровождающаяся масштабным разворачиванием нуклеосомной ДНК. Показано, что кураксины CBL0100 и CBL0137 значительно понижают уровень сверхспирализации ДНК. Установлено, что кураксин CBL0137 приводит к ингибированию формирования Z-ДНК при концентрациях CBL0137 более 0,5 мкМ. Определено, что инкубация нуклеосом в присутствии CBL0137 приводит сначала к обратимому (3,5 и 5 мкМ), а потом необратимому (10 мкМ) разворачиванию нуклеосомной ДНК. Проведен сравнительный анализ транскрипции через нуклеосому в трёх описанных в литературе минимальных транскрипционных системах. Показано, что транскрипция через нуклеосому с использованием элонгационного комплекса (ЭК) на матрице с комплементарными цепями ДНК идёт с остановкой в районе +45 п.н. относительно входа в нуклеосому и сохранением наиболее приближенного к нативному паттерна паузирования. В результате сборки ЭК с некомплементарнымицепями ДНК или с выступающим концом ДНК при транскрипции через нуклеосому происходит изменение паттерна нуклеосом-специфических задержек РНК-полимеразы II. Определена роль субъединиц дрожжевого белкового комплекса FACT в транскрипции нуклеосом, содержащих однонитевые разрывы в нематричной цепи ДНК. Разработан протокол получения высокоочищенных концентрированных образцов ЭК+20 с однонитевым разрывом нематричной цепи ДНК в положении +12, соответствующих требованиям криоэлектронной микроскопии. Получены комплексы нуклеосом и элонгирующей РНК-полимеразы, в которых фермент остановлен в положении, соответствующем позиции наиболее выраженной спонтанной остановки РНКП при транскрипции нуклеосом с разрывом нематричной цепи ДНК после 2 нт от входа в нуклеосому. Отличия в структуре комплексов с разрывом ДНК и без него охарактеризованы методом ПЭМ. С помощью разработанных методических подходов установлено наличие протяженного изгиба в центромерной ДНК третьей хромосомы пекарских дрожжей, который локализован в районе диады и прилежащем к ней участке ДНК центромерной нуклеосомы. С разрешением 4 Å получена первая структура нуклеосомы с нуклеосом- позиционирующей последовательностью (НПП) 603. Эта НПП широко применяется в исследования транскрипции через нуклеосомы. Нуклеосомы с НПП 603 схожи по структуре с другими известными нуклеосомами, но характеризуются большей подвижность ДНК.
3 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний
Результаты этапа: Проведено: Исследование ДНК-шаперонных свойств белков семейства HMGB (HMO1, Nhp6A и Nhp6B) проводили с использованием ДНК матрицы длиной 187 п.н., содержащей нуклеосом-позиционирующую последовательность 603, флуоресцентные метки Cy3 и Cy5, и октамеры рекомбинантных гистонов X. laevis. Сборку нуклеосом в присутствии HMGB-белков проводили двумя способами: с использованием ступенчатого диализа против растворов с понижающейся ионной силой (с 2 М NaCl до 10 мМ NaCl) и в бездиализной системе. В качестве контроля использовали смесь ДНК и октамера гистонов без добавления HMGB-белков, а также смеси ДНК и HMGB-белков без октамеров. ДНК, октамеры и HMGB-белки смешивали в молярном соотношении 1:1:2. Было показано, что HMGB-белки по-разному влияют на сборку нуклеосом in vitro. В условиях бездиализной сборки при выбранных соотношениях ДНК и октамеров в контрольном образце часть ДНК уходит на образование нуклеосом. При добавлении в систему избытка HMO1 происходит его взаимодействие с нуклеосомами, но не с ДНК, что не сказывается на эффективности сборки нуклеосом. Белки Nhp6A и Nhp6B, напротив, напрямую взаимодействуют с ДНК, но не образуют дополнительных комплексов со сформировавшимися нуклеосомами. При этом Nhp6B не влияет на сборку нуклеосом, в то время как Nhp6A препятствует формированию нуклеосомных частиц. Аналогичная картина влияния на сборку нуклеосом наблюдается и в диализной системе, однако в данном случае практически вся ДНК оказывается включенной в нуклеосомы, за исключением сборки в присутствии Nhp6А. Для решения этой задачи суммарно было собрано 24 варианта нуклеосом на основе рекомбинантных гистонов человека (H3.3, H2A.Z, H3K56Q и их комбинаций) и ДНК-матриц (187 п.н.) с флуоресцентными метками в различных положениях. Исследование методом spFRET-микроскопии воздействия PARP1 на структуру нуклеосом c каноническими гистонами (wtN) показало, что при 20 нМ PARP1 эффективно реорганизует проксимальный к началу нуклеосом-позиционирующей последовательности краевой участок, слабее медиальную и слабо дистальную области. При 60 нМ PARP1 вызывает масштабную реорганизацию всей коровой области wtN. Проведены исследования, показавшие, что реорганизация нуклеосом, содержащих вариантные гистоны, сложным образом зависит от концентрации PARP1 и типа вариантного гистона в составе нуклеосом, усиливаясь, если в состав нуклеосом входит два вариантных гистона H2A.Z/H3K56Q или H2A.Z/H3.3. Присутствие только H3.3 ограничивает, а H3K56Q усиливает PARP1-индуцированную реорганизацию нуклеосом по сравнению с wtN. Методом гель-электрофореза показано, что введение в нуклеосому отдельных вариантных гистонов или их пар не блокирует формирование комплексов нуклеосома:PARP1 стехиометрии 1:1, 1:2, 1:3, но в ряде случаев модулирует эффективность их образования. Гистоны H3.3, H3K56Q и пара H2A.Z/H3.3 усиливали формирование комплексов соответствующих нуклеосом с PARP1 по сравнению с wtN. Влияние вариантных гистонов в составе нуклеосом на эффективность действия ингибиторов PARP (PARPi) — олапариба (Ola) и велипариба (Veli) — оценивали двумя методами: ферментативную активность PARP1 анализировали с помощью вестерн-блоттинга, а структурную организацию комплексов PARP1- нуклеосома — методом нативного гель-электрофореза. Установлено, что сами PARPi не влияют на структурную целостность нуклеосом с любыми вариантами гистонов: WT, H2A.Z, H3.3, H3K56Q, H2A.Z/H3.3 и H2A.Z/H3K56Q. В работе в дополнение к ингибированию оценивали влияние вариаций гистонов на эффективность PARPi-индуцированного ареста (траппинга) PARP1 в комплексах с нуклеосомами. Ola эффективно индуцирует траппинг PARP1 на всех типах нуклеосом, кроме нуклеосом с H2A.Z/H3.3, для которых траппинг отменяется, но сохраняется ингибирование каталитической активности PARP1. В отличие от канонических нуклеосом и нуклеосом с H3.3, Veli индуцирует траппинг PARP1 на нуклеосомах c гистоном H2A.Z и парой H2A.Z/H3K56Q. При этом Ola (1 мкМ) действовал как мощный ингибитор, полностью блокируя каталитическую активность фермента независимо от типа нуклеосомного субстрата. Veli (10 мкМ) не вызывал полного ингибирования PARP1 на нуклеосомах с H3.3, а также с парами H2A.Z/H3K56Q и H2A.Z/H3.3. Эти данные свидетельствуют, что эффективность ингибиторов PARP зависит не только от их химической структуры, но и от эпигенетического контекста в области локализации PARP1 в хроматине. Методами spFRET микроскопии и гель-шифт анализа исследовано влияние линкерного гистона H1.5 и глобулярного домена гистона H1.0 на структуру коровой области нуклеосом. По данным электрофореза глобулярный домен H1.0 связывается с нуклеосомами при концентрациях >10 нМ, но по spFRET-данным не влияет на их структуру в коровой области. С учетом наших данных о влиянии полноразмерного Н1.0 на структуру коровой области, можно заключить, что именно хвостовые неупорядоченные участки H1.0 определяют эти структурные изменения. По данным электрофореза и spFRET-анализа H1.5 эффективно образует комплексы с нуклеосомами при концентрациях 10 нМ и больше, вызывая в коровой области структурные изменения, регистрируемые как увеличение расстояния между соседними супервитками нуклеосомной ДНК вблизи входа ДНК в нуклеосому. Масштаб этих изменений больше, чем в случае гистона Н1.0. При этом аффинность H1.5 к нуклеосомам в 2-3 меньше, чем у гистона Н1.0. Проведено исследование влияния гистона H1.5 на транскрипцию РНКП II через нуклеосому. Установлено, что при низкой ионной силе гистон H1.5 замедляет прохождение РНКП II области 10 п.н. до нуклеосомы, не влияя на другие паузы в транскрипции. При увеличении ионной силы до физиологических значений это дополнительное паузирование не наблюдается, что позволяет сделать вывод о слабом влиянии гистона H1.5 на транскрипцию через нуклеосому. Проведена 2D-классификация проекций комплексов тетрасом с белковым фактором yFACT:Nhp6, полученных просвечивающей электронной микроскопией с негативным контрастированием (ПЭМ-НК). Выявлены интермедиаты реорганизации тетрасом фактором yFACT:Nhp6: (1) комплексы, с характерной для свободных компонентов формой электронных плотностей, (2) комплексы, в которых электронные плотности компонентов сливаются в единую компактную электронную плотность и (3) комплексы с развернутой структурой без выраженной асимметрии и линейностью меньшей, чем в комплексах с нуклеосомами. Для 2 классов проекций комплекса тетрасома:yFACT:Nhp6 построены 3D-модели. Дополнительно были изучены особенности транскрипции РНКП II через тетрасому при различной ионной силе [doi: 10.1093/nar/gkaf356]. Установлено, что в тетрасомах в положениях +25 и 45 п.н. сохраняются барьеры для транскрипции РНКП II. Высота барьеров в тетрасомах значительно ниже, чем в нуклеосомах, что позволяет заключить, что в нуклеосомах взаимодействия ДНК с тетрамером гистонов H3/H4 сильно стабилизированы димерами H2A/H2B. Полученные данные согласуются с ранее показанным ослаблением паузирования РНКП при удалении «хвостов» гистонов: утрата компактности может отражать разрушение внутринуклеосомной петли или иной стабильной структуры, препятствующей продвижению фермента. Так, компактная структура комплекса связана с высоким нуклеосомным барьером, а удаление «хвостов» гистонов ведёт к декомпактизации и облегчению транскрипции в области +(10–15). Все планируемые в отчетный период работы выполнены полностью

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".