![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Биосинтез белка – один из важнейших метаболических процессов в клетке. Он требует сложного молекулярного аппарата, включающего сотни специализированных компонентов, и круг известных участников этого процесса постоянно расширяется. Одно из направлений нашего проекта будет связано с выявлением новых и малоизученных трансляционных компонентов посредством проведения высокопроизводительных генетических скринингов на основе технологии CRISPR/Cas. Современные методы биохимии, клеточной биологии и молекулярной генетики, которыми владеют члены нашего коллектива, позволят приблизиться к пониманию функций таких компонентов путём нарушения работы их генов и последующего анализа изменений в активности репортерных генов. Для анализа профиля генной экспрессии мутантных клеток могут также применяться методы системной биологии (например, транскриптомика и рибосомный профайлинг). Такой интегрированный подход даст возможность не только изучить конкретные молекулярные механизмы, лежащие в основе интересующих нас явлений, но и понять их место в общей картине регуляции экспрессии генов в клетке. В частности, в рамках данного направления будут исследованы механизмы реинициации трансляции и регуляции встраивания селеноцистеина, которые пока не были проанализированы системными методами. Ещё сложнее организован процесс белкового синтеза в клетках, заражённых вирусами. Многие вирусы модифицируют компоненты трансляционного аппарата, чтобы заблокировать продукцию клеточных белков, а для трансляции собственных мРНК используют неканонические механизмы. Поиск и изучение клеточных белков, обеспечивающих работу этих механизмов, будет вторым направлением нашей работы. Мы собираемся изучить вклад в вирусную инфекцию конкретных белков, взаимодействующих с IRES-элементами (участками внутреннего связывания рибосом) пикорнавирусных мРНК, - так называемых ITAF (англ. IRES trans-acting factor). Будет изучен механизм работы нового потенциального ITAF, найденного нами недавно с помощью CRISPR-скрининга, а также определена роль некоторых других ITAF, ранее изучавшихся только в искусственных in vitro системах, в живых клетках в контексте вирусной инфекции. Нужно заметить, что для нормального жизненного цикла вируса очень важно интенсивное производство вирусных белков. Поэтому активация внутриклеточных механизмов, ингибирующих трансляцию в клетке, а также её искусственное подавление низкомолекулярными веществами часто приводит к замедлению вирусной инфекции, что даёт организму время для организации антивирусного ответа. В рамках третьего направления на доступной коллекции пикорнавирусов мы протестируем собранную нами панель малоизученных низкомолекулярных ингибиторов белкового синтеза, состоящую из представителей различных классов (ингибиторов рибосомы, трансляционных факторов, аминоацил-тРНК-синтетаз и модуляторов сигнальных каскадов). Изменения в динамике вирусной инфекции будут отслеживаться как простыми цитологическими текстами, так и с помощью специально созданных репортерных систем. Этот анализ поможет получить представления о том, внутри каких классов ингибиторов имеет смысл искать новые низкомолекулярные соединения, способные стать эффективными противовирусными препаратами. Кадровый и методический потенциал, накопленный нашим коллективом в ходе выполнения недавно закончившегося «мегагранта», а также научный задел, сформированный при выполнении предыдущего гранта РНФ, позволяет нам ставить перед собой подобные амбициозные задачи и быть уверенными в возможности их выполнения.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 15 мая 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Изучение механизмов трансляции вирусных и клеточных мРНК с применением интегрированного подхода, этап 1 |
Результаты этапа: | ||
2 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Изучение механизмов трансляции вирусных и клеточных мРНК с применением интегрированного подхода, этап 2 |
Результаты этапа: За отчётный период с целью изучения молекулярных механизмов инициации, терминации и реинициации трансляции было проведено шесть CRISPR-скринингов на бицистронных конструкциях, кодирующих флуоресцентные белки, в том числе на стабильных линиях и (впервые) путём мРНК-трансфекции. Получены предварительные списки «хитов», выявлены гены – кандидаты для дальнейшего изучения. Разработана система для проведения CRISPR-скрининга, направленного на поиск генов, продукты которых вовлечены в молекулярные механизмы поглощения РНК при мРНК-трансфекции клеток, основанная на новом маркёре негативной селекции. Вместе с большим международным коллективом авторов разработаны «Минимальные требования к использованию бицистронных репортеров». На панели репортерных конструкций с IRES-элементами четырёх классических типов систематически проанализировано влияние тотальной замены уридина на m1-псевдоуридин (применяемой в современных мРНК-вакцинах) на активность IRES-элементов, сделан вывод о практически полной инактивации большинства IRES-элементов. Показано, что нокаут гена PA2G4 делает клетки НЕК293Т устойчивыми к заражению вирусом энцефаломиокардита (EMCV), а также очень сильно снижает эффективность трансляции, направляемой IRES-элементом EMCV. Наработаны в E.coli и выделены рекомбинантные белки архей, предположительно являющиеся факторами рибосомного рециклинга. В сотрудничестве с лабораторией А.Буздина (Сеченовский Университет) получены несколько нокаутных линий по генам SLC39A8 и SLC39A14 (на основе линий аденокрцином HCT-15 и HuTu80) и показано, что отсутствие генов изменяет устойчивость опухолевых клеток к некоторым химиотерапевтическим препаратам, что позволяет говорить о потенциале белков семейства SLC39A как мишеней для разработки новых противоопухолевых терапий. В сотрудничестве с лабораторией В.Гладышева (Гарвардская школа медицины) разработаны надёжные мультитканевые транскриптомные часы биологического возраста (tAge) для млекопитающих. Часы применены для анализа изменений биологического возраста клеток в процессах клеточного репрограммирования и эмбриогенеза. | ||
3 | 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. | Изучение механизмов трансляции вирусных и клеточных мРНК с применением интегрированного подхода, этап 3 |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".