ИСТИНА

Исследовать действие белка PARP1 на транскрипцию нуклеосом с разрывами и факторов, модулирующих образование, морфологию и стабильность репарационных жидкофазных конденсатов в хроматине.

To study the effect of the PARP1 protein on the transcription of nucleosomes with breaks and factors modulating the formation, morphology and stability of reparative liquid-phase condensates in chromatin.

Будет исследовано действие белка PARP1 на транскрипцию нуклеосом с разрывами, ингибирующее действие которых находится вне участка действия PARP1 на транскрипцию интактных нуклеосом. Будет изучено влияние «хвостовых» участков гистонов на транскрипцию нуклеосом с однонитевыми разрывами нематричной цепи ДНК. Будут изучены факторы, модулирующих образование, морфологию и стабильность репарационных жидкофазных конденсатов (ЖФК) в хроматине. Исследование роли линкерных участков нуклеосомы, ионного окружения, эффекта молекулярного краудинга. Изучение влияния линкерных гистонов, ингибиторов PARP1 и частичного поли-АДФ-рибозилирования в условиях дефицита субстрата на свойства ЖФК, образованных PARP1 и мононуклеосомами.

Коллектив исполнителей имеет возможность проводить исследования с помощью уникальной высокочувствительной системой для изучения структуры и функционирования единичных супрамолекулярных комплексов LSM710. Разработаны и успешно используются оригинальные методики получения нуклеосом заданной структуры и с заданным положением флуоресцентных меток в составе нуклеосом, а также высокоактивного фермента PARP1. Разработаны оригинальные методики изучения структуры одиночных нуклеосом и их комплексов с белками, в частности, остановленных элонгационных комплексов, с использованием Фёрстеровского резонансного переноса энергии.

Структурные перестройки внутри нуклеосомной ДНК в ЭК-5 дополнительно изучены методом мономолекулярной FRET-микроскопии (spFRET). Созданы нуклеосомы с внесенными в соседние супервитки ДНК флуоресцентными метками, составляющими FRET-пару, и с последовательностью ДНК, позволяющей получать ЭК-5 в ходе транскрипции in vitro в присутствии ограниченного набора рНТФ. Проведены эксперименты по spFRET-микроскопии ЭК-5, а также свободных нуклеосом и ЭК-39 (для контроля влияния экспериментальных процедур по сборке ЭК на флуоресцентно-меченые материалы). При сборке ЭК-39 наблюдается небольшое увеличение доли частиц без FRET-взаимодействия меток (предположительно, свободной ДНК, образующейся при лигировании ЭК к нуклеосомам с флуоресцентными метками), но средний уровень FRET для частиц не изменяется. В ЭК-5 наблюдается некоторое смещение пика эффективности FRET (EPR), что свидетельствует об изменениях в структуре внутринуклеосомной ДНК, сопровождающих момент входа РНКП в нуклеосомную ДНК, и совпадает с данными, полученными методом футпринтинга ДНК. Методом футпрнтинга ДНК и spFRET-микроскопии ЭК-5 обнаружено также, что вхождение РНКП в нуклеосомную ДНК сопровождается дополнительными структурными изменениями в нуклеосомной ДНК. Установлено, что в растворе, содержащем 150 мМ KCl, мононуклеосомы, реконструированные на матрице длиной 187 п.н., в присутствии РARР1 способны формировать гомогенные симметричные (сферические) конденсаты размером до 4 мкм. Определены пороговая концентрация РARР1, при которой происходит сегрегация его комплексов с мононуклеосомами в отдельную фазу, и время, в течение которого в системе протекают основные процессы фазового разделения. Показано, что конденсация комплексов РARР1 с нуклеосомами обратима и солезависима. Установлено, что мононуклеосомы в конденсатах имеют крайне низкую подвижность. Выявлено, что РARР1 в составе конденсатов сохраняет поли-AДФ рибозилирующую активность и что поли-AДФ-рибозилирование компонентов ведет к полной диссоциации микрофазных частиц. Также показано, что способность индуцировать микрофазовое разделение в растворах ДНК или мононуклеосом специфично для РARР1 и не обнаруживается у другого представителя сеймейства поли(AДФ-рибоза) полимерaз РARР2.