Белки, участвующие в транспорте РНК по сосудистой системе растенийНИР

Proteins involved in RNA transport in plant vascular system

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 5 мая 2017 г.-31 декабря 2017 г. Белки, участвующие в транспорте РНК по сосудистой системе растений
Результаты этапа: Исследована способность модельных РНК, синтезируемых в листьях растений N. benthamiana, агроинифльтрированных бинарными векторами, несущими клонированные последовательности этих РНК, транспортироваться по флоэме в верхние листья. Показано, что модельные РНК могут быть детектированы в верхних листьях растений, но их количество там находится на пороговом уровне детекции. На основе клонированной копии генома Х-вируса картофеля разработана экспериментальная система, которая может быть использована для проверки способности фрагментов различных клеточных и вирусных РНК направлять флоэмный транспорт. Показано, что фрагмент мРНК FT (flowering locus T) A. thaliana и фрагменты изучаемых модельных РНК могут направлять флоэмный транспорт рекомбинантных РНК. С использованием препаратов ренатурированных рекомбинантных белков, экспрессированных в бактериальных клетках, методом сдвига в геле изучалась способность белков Nt-4/1d90 и NtPBL-C связывать различные РНК. Исследованы сходства и различия в характере связывания этими белками таких РНК-субстратов, как природные тРНК, полученные in vitro транскрипты тРНК, вирусные тРНК-подобные структуры, предшественники миРНК и клеточные РНК, способные к флоэмному транспорту. Изучена субклеточная локализации белков рр16 и ТСТР. С помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии листьев N. benthamiana, агроинфильтрированных конструкциями для временной экспрессии, показано, что слитные белки pp16-GFP, GFP-pp16 и TCTP-mRFP распределяются диффузно в цитоплазме и нуклеоплазме. Обнаружено, что ко-экспрессия pp16 и TCTP не меняет локализацию этих белков. Показано, что белок ТСТР не меняет свой локализации в клетках, инфицированных Х-вирусом картофеля. Обнаружено, что при ко-экспрессии Nt-4/1d90-GFP, который имеет диффузную локализацию в клетках растений, с NbVAP27-mRFP, который локализуется преимущественно в сети эндоплазматического ретикулума (ЭПР), происходит концентрация Nt-4/1d90-GFP вокруг трубочек ЭПР. Изучена наблюдаемая в условиях механического стресса субклеточная ре-локализация белка Nt-4/1d90-GFP в сферические тельца, ассоциированные с кортикальным эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР) и NbVAP27-специфическими тельцами на трубочках ЭПР. Выявлено, что сферические тельца ассоциированы с реорганизованными в результате стресса микротрубочками (МТ) и содержат маркер МТ mRFP-MAP4. Показано, что ре-локализация Nt-4/1d90-GFP может быть связана с дефосфорилированием белка. На модели РНК вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) отработаны условия получения РНК-белковых комплексов и дальнейшего анализа их белкового состава. Подобраны условия, в которых полученный in vitro биотинилированный транскрипт ВВКК при инкубации с флоэмным экссудатом тыквы (Cucurbita maxima) образует РНК-белковые комплексы, которые могут быть очищены на стрептавидин-агарозе для дальнейшей идентификации входящих в их состав белков. Показано, что в этих условиях транскрипт ВВКК взаимодействует с флоэмным белком РР2. Отработаны методики сайленсинга гена PBL в растениях N. benthamiana. Получены конструкции для локального сайленсинга, несущие в составе бинарного вектора под контролем 35S-промотера две копии фрагмента гена NbPBL в виде инвертированного повтора, и системного сайленсинга, несущие фрагмент гена NbPBL в составе вектора на основе вируса погремковости табака. Проведена оценка эффективности локального и системного сайленсинга с использованием полученных конструкций.
2 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Белки, участвующие в транспорте РНК по сосудистой системе растений
Результаты этапа: Проводились исследования структурных особенностей РНК, определяющих способность к флоэмному транспорту. С помощью ранее разработанной в рамках данного проекта экспериментальной системы для анализа способности фрагментов различных клеточных и вирусных РНК направлять флоэмный транспорт модельной РНК в растениях N. benthamiana показано, что структурированный фрагмент первичного транскрипта миРНК содержат сигнал(ы) флоэмного транспорта. С использованием препарата ренатурированного рекомбинантного белка, экспрессированного в бактериальных клетках, методом сдвига в геле было исследовано связывание белка NtPBL-C с мутантными транскриптами предшественника миРНК. Анализ библиотеки первичных чтений длинных флоэмных РНК, полученных ранее методами секвенирования нового поколения, выявил наличие предшественников миРНК. С помощью анализа сравнительной представленности последовательностей предшественников миРНК и мРНК во флоэмном экссудате получены указания на то, что непроцессированные транскрипты миРНК селективно включается в путь флоэмного транспорта. Была исследована способность структурно несхожих тРНК-подобных структур, локализованных в 3'-некодирующих областях геномных РНК ряда вирусов растений, направлять флоэмный транспорт модельной РНК. Показано, что такая способность присуща вирусным тРНК-подобным структурам трех известных типов. Проводили исследование возможного влияния РНК-цитозин-метилтрансферазы DNMT2 N. tabacum на межклеточный и флоэмный транспорт Х-вируса картофеля (ХВК). С использованием временной экспрессии рекомбинантных белков методом агроинфильтрации обнаружено, что DNMT2, но не его мутантный вариант, лишенный ферментативной активности, стимулирует накопление вирусных РНК в локусах инфекции ХВК и межклеточный транспорт вируса, но не оказывает значимого влияния на флоэмный транспорт вирусной РНК. Клонирована кодирующая последовательность DNMT2 Arabidopsis thaliana, получен штамм E. coli, продуцирующий AtDNMT2, отработаны условия его очистки и ренатурации. Начаты работы по анализу ферментативной активности рекомбинантного AtDNMT2 in vitro с использованием различных РНК-субстратов. В серии предварительных экспериментов подобраны оптимальные условия для идентификации остатков 5-метилцитозина в РНК-транскриптах, обработанных рекомбинантным AtDNMT2, с помощью бисульфитного секвекнирования. Был получен бинарный вектор, несущий под контролем 35S-промотера полноразмерный элемент ретРНК N. benthamiana (NbRZ), включающий два LTR и центральную область. Анализ растений, агроинфильтрированных данной конструкцией, выявил накопление (+) и (-) цепей NbRZ в инфильтрированных листьях, что говорило о репликации NbRZ, а также накопление (+)цепей NbRZ в верхних листьях, что служило указанием на то, что происходил системный (дальний) транспорт NbRZ из инфильтрированных листьев в апикальную часть растения. С использованием биотинилированых транскриптов РНК, способных транспортироваться по флоэме, были выделены комплексы, формируемые этими РНК и белками флоэмного экссудата Cucurbita maxima. Белковые компоненты комплексов разделяли в полиакриламидном геле и идентифицировали с помощью масс-спектрометрии. Были идентифицированы два флоэмных белка C. maxima, для которых ранее не были описаны РНК-связывающие свойства. Данные белки были экспрессированы в бактериальных клетках и выделены с помощью аффинной хроматографии. Анализ способности рекомбинантных белков связывать различные РНК-субстраты, который проводили методом сдвига в геле, выявил сродство одного из этих белков к РНК, способным транспортироваться по флоэме.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".