ИСТИНА

Развитие методов анализа экспрессии генов позволило обнаружить явление повсеместной транскрипции и трансляции генетической информации. Роль трансляции малых открытых рамок считывания в настоящее время недостаточно изучена. Настоящий проект направлен на широкомасштабный поиск малых открытых рамок считывания, участвующих в пролиферации клеток человека. Трансляция малой открытой рамки считывания может приводить к синтезу пептида, играющего регуляторную роль в определенном процессе, или быть регуляторным событием в отношении трансляции основной открытой рамки считывания, что позволяет клетке быстро реагировать на изменившиеся условия. Факт повсеместной трансляции в настоящее время установлен, но работ, посвященных систематическому изучению малых открытых рамок считывания и их роли в регуляции определенных процессов в клетке, практически нет. В настоящем проекте мы планируем провести широкомасштабный поиск малых открытых рамок считывания, участвующих в пролиферации клеток человека. Разработанную в ходе выполнения проекта, методологию можно будет в дальнейшем использовать для выявления малых открытых рамок считывания, участвующих в регуляции других внутриклеточных процессов.

The development of methods for analysis of gene expression has made it possible to detect the phenomenon of pervasive transcription and translation of genetic information. The role of small open reading frame translation is currently poorly understood. The present project is aimed at a large-scale search for small open reading frames involved in human cell proliferation. Translation of a small open reading frame can lead to the synthesis of a peptide that plays a regulatory role in a certain process, or be a regulatory event in relation to the translation of the main open reading frame, which allows the cell to quickly respond to changing conditions. The fact of ubiquitous translation has now been established, but there are practically no articles devoted to the systematic study of small open reading frames and their role in the regulation of certain processes in the cell. In this project, we plan to conduct a large-scale search for small open reading frames involved in human cell proliferation. The methodology developed during the project realization can be further used to identify small open reading frames involved in the regulation of other intracellular processes.

Ключевой задачей настоящего проекта является широкомасштабный поиск малых открытых рамок считывания, участвующих в пролиферации клеток человека. В целях ее реализации нами будет создана библиотека лентивирусов, кодирующих направляющие Cas9 гидовые РНК, специфичные выбранным на основании анализа рибосомных профилей малым открытым рамкам считывания. Механизмы функционирования малых открытых рамок считывания, мутации которых оказывают влияние на пролиферацию клеток, будут изучены более подробно. Исследования последних лет открыли новый уровень регуляции функционирования клеток, основными участниками которого являются малые открытые рамки считывания, которые могут кодировать короткие пептиды, выполняющие регуляторную роль в функционировании клеток, а могут сами являться регуляторными элементами, ответственными за трансляцию основной открытой рамки считывания в составе единой мРНК. Исследование функционирования малых открытых рамок считывания, участвующих в регуляции пролиферации клеток, будет способствовать пониманию механизмов опухолеобразования, регенерации тканей, т.е. решению задач входящих в направление из Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации «Переход к персонализованной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения».

Научный коллектив уже работает над реализацией настоящего проекта. Отработаны методы создания библиотеки лентивирусных частиц, кодирующих гидовые РНК, а также отбора клеток после трансдукции, получения ампликонови и последующего секвенирования. Методология, предложенная в настоящем проекте, проверена и может быть использована в дальнейшем для работы с библиотеками большего размера. Руководитель коллектива имеет опыт идентификации и изучения функции новых малых белков, закодированных в неканонических участках генома. В ходе предыдущих исследований коллективу удалось продемонстрировать кодирующий потенциал теломеразной РНК человека. Белок hTERP защищает клетки от гибели в условиях индукции апоптоза, а мутации в нем приводят к нарушениям в протекании аутофагии. Белок hTERP участвует в регуляции АМРК-зависимого сигнального каскада, регулирующего аутофагию. 3’-концевой процессинг теломеразной РНК человека протекает в промотор-зависимой манере и требует участия белкового комлекса Интегратор (Rubtsova, SciRep, 2019). В ходе биогенеза предшественник теломеразной РНК подвергается процессингу при помощи различных форм РНК-экзосомы, а ингибирование РНК-экзосомы, отвечающей за деградацию матричных РНК, которой приводит к накоплению предшественника теломеразной РНК в цитоплазме клеток. При участии Рубцовой М.П. бла определена функция гена, ранее ошибочно аннотированного, как ген некодирующей РНК LINC00116. Как оказалось, этот ген кодирует митохондриальный пептид Mtln, участвующий в липидном обмене и необходимый для работы дыхательной цепи митохондрий. В лаборатории налажена работа с библиотеками нуклеотидных последовательностей, которые используют для различных целей. В частности, была изучена зависимость эффективности трансляции от состава 5’-нетранслируемой области и сиквенс-специфичность действия антибиотиков-ингибиторов трансляции. В лаборатории постоянно применяется метод геномного редактирования при помощи CRISPR/Cas9 технологии.

В ходе выполнения проекта было отобрано около тысячи малых открытых рамок считывания (малых ОРС), расположенных в 5’-нетранслируемых областях мРНК человека, основываясь на имеющихся в открытом доступе данных рибосомного профилирования. Для проведения широкомасштабного скрининга выбранных малых ОРС с помощью системы CRISPR–Cas9 подобраны специфичные гидовые РНК, нацеленные на выбранные мишени. Из подобранных гидовых РНК собрана библиотека, включающая в себя также отрицательные и положительные контроли. Данная библиотека может быть использована для отбора малых ОРС, которые играют роль в специфичных процессах клетки. Библиотека гидовых РНК была клонирована в вектор, с помощью которого в свою очередь были получены лентивирусные частицы, несущие данную библиотеку. С помощью полученных лентивирусов был проведен скрининг малых ОРС, которые важны для пролиферации клеток линий HAP1, A549 и HEK293T. Обнаружено, что инактивация 135, 31 и 23 малых ОРС значимо снижает пролиферацию клеток модельных линий HAP1, A549 и HEK293T, соответственно. При сравнении результатов, полученных на линиях HAP1, A549 и HEK293T, установлено, что большая часть малых ОРС является специфически важной для пролиферации только одной или двух линий клеток. Индивидуальная проверка 25 малых ОРС при помощи анализа конкуренции показала, что случайные мутации в 22 малых ОРС отрицательно влияют на пролиферацию мутантных клеток HAP1 по сравнению с диким типом. Проведено клонирование последовательности и анализ 5’-концов мРНК для 6 проверенных малых ОРС методом 5’ RACE, который подтвердил последовательность 5’-концов целевых транскриптов. С помощью клонированных последовательностей подтверждена трансляция 4 малых ОРС в составе репортерной конструкции при помощи мечения кодируемых пептидов меткой HiBiT. Кроме того, для 2 малых ОРС получены клеточные линии со вставкой последовательности довеска HiBiT на С-конце кодируемых ими пептидов. При помощи данных линий показано, что кодируемые меченые пептиды присутствуют в клетках при эндогенной экспрессии. Для разграничения отобранных мишеней на регуляторные и кодирующие функциональный пептид мы провели ряд экспериментов. Во-первых, мы оценили влияние мутаций в кодирующей последовательности на пролиферацию клеток в 6 генах и провели сравнение этого влияния с аналогичными эффектами для малых ОРС этих генов. Результаты для 2 малых ОРС позволяют предположить независимую функцию пептидов малых ОРС этих генов важную для пролиферации HAP1. Во-вторых, мы провели инактивацию при одновременной комплементации кодируемого пептида 2 малых ОРС. Результаты комплементации указывают на отсутствие независимой функции пептида данных малых ОРС для пролиферации клеток линии HAP1. В-третьих, для 3 малых ОРС получены образцы геномной ДНК для анализа мутаций, индуцируемых двухцепочечных разрывом из-за действия CRISPR–Cas9, по их влиянию на пролиферацию клеток при помощи высокопроизводительного секвенирования, чтобы оценить вклад конкретных мутаций в снижение пролиферации клеток линии HAP1. Для изучения функции конкретной малой ОРС получены клеточные линии с инактивированной малой ОРС гена MCRS1 с помощью системы CRISPR–Cas9. Установлено, что данная малая ОРС подавляет трансляцию основной ОРС MCRS1. Кроме того, показано, что в 5’-нетранслируемой области гена MCRS1 также присутствует несколько других малых ОРС, которые принципиально могут транслироваться. Помимо общего анализа мишеней мы провели эксперименты для выяснения роли малой ОРС гена MCRS1. В рамках этого мы получили и протестировали люциферазные репортеры для определения механизма регуляции трансляции за счет малой ОРС MCRS1. Нами установлено, что мутации с различным укорочением малой ОРС снижают ее репрессивное влияние на трансляцию кодирующей последовательности. В то же время слияние малой ОРС с основной ОРС не повышает уровень функционального белкового продукта кодирующей последовательности. Путем инактивации старт-кодонов кодирующей последовательности MCRS1 мы выяснили, что второй старт-кодон задействован в инициации трансляции примерно с той же эффективностью, что и первый. Таким образом, в ходе выполнения проекта мы обнаружили, что открытые рамки считывания в 5’-НТО мРНК могут кодировать функциональные пептиды, а также влиять на уровень экспрессии основного продукта данного гена. Мутации в мОРС в 5’-НТО влияют как на содержание в клетке основного продукта экспрессии, так и на его протеоформу, что очевидно может оказывать эффект на локализацию и функции основного белка. Эти находки являются существенными и требуют дальнейшего исследования, т.к. мутации в этих областях могут быть источником патологий и развития различных заболеваний, а используемые в настоящее время подходы к анализу экзомов больных исключают их из рассмотрения.