ИСТИНА

Мембранные белки в организме выполняют разнообразные функции и участвуют во многих физиологических процессах. Исследование мембранных белков все еще остается сложной задачей, требующей оригинальных подходов и нетривиальных решений. Большинство мембранных белков прочно связано с липидным бислоем и, если и может быть растворено в водном растворе, то с потерей каталитической активности. Поэтому для получения каталитически активных препаратов таких ферментов в ходе их выделения применяют процедуру солюбилизации. Актуальной задачей является исследование мембранного фермента PGHS, обладающего рядом специфических свойств. Фермент простагландин-H-синтаза (PGHS, эндопероксид простагландин синтаза, циклооксигеназа; К.Ф.1.14.99.1) осуществляет в организме млекопитающих двустадийное превращение арахидоновой кислоты в простагландин H2, который является предшественником в биосинтезе простагландинов, тромбоксанов, простациклина (модуляция сердечно-сосудистой, желудочно-кишечной, почечной и репродуктивной систем). Терапевтический эффект нестероидных противовоспалительных препаратов обусловлен ингибированием PGHS. В настоящее время нестероидные противовоспалительные средства занимают 2-е место после антибиотиков по массовости применения среди лекарств. PGHS – бифункциональный фермент, катализирующий циклооксигеназное окисление арахидоновой кислоты двумя молекулами кислорода с образованием простагландина G2 и пероксидазное восстановление перекисной группы простагландина G2 в присутствии донора электронов с образованием простагландина H2. Реакции гемзависимы, проходят на одной молекуле в пространственно разнесенных активных центрах. Циклооксигеназный активный центр связан с мембраной гидрофобным каналом, тогда как пероксидазный расположен на поверхности фермента. PGHS может переходить в раствор только в присутствии детергента. Для сохранения активности PGHS для выделения используют неионные детергенты, способные образовывать мицеллы. Хотя уже было показано значительное влияние детергентов на действие ингибиторов PGHS, до сих пор влияние мицеллярных систем (мембранного бислоя или мицелл детергентов) не было изучено. Наш коллектив занимается исследованием PGHS уже более 15 лет. Нами разработан ряд методов по работе с этим ферментом, выявлены кинетические закономерности катализа и инактивации. Проведенные нами исследования показали, что скорость циклооксигеназной реакции зависит от концентрации детергентов в реакционной среде, тогда как скорость пероксидазной реакции не зависит от варьирования концентрации детергентов. Свойства катализа PGHS невозможно описать без учета взаимодействия фермента и мицеллярной фазы. В рамках данного проекта мы планируем исследование механизма взаимодействия PGHS и его субстратов в мицеллярных системах.

Экспериментально показано, что кинетические параметры циклооксигеназной реакции зависят от концентрации детергента в растворе. Константа Михаэлиса циклооксигеназной реакции по арахидоновой кислоте в первом приближении линейно зависит от концентрации детергента в растворе. При содержании твина-20 в растворе порядка 0,008% по объему наблюдаемая константа Михаэлиса составляет приблизительно 2 мкМ, в то время как при содержании 2 % твина-20 по объему в растворе наблюдаемая константа Михаэлиса возрастает примерно на два порядка. В ходе экспериментов с Triton X-100 в качестве основного и экзогенного детергента показано, что зависимости кинетических параметров циклооксигеназной реакции от содержания детергента однотипна для Твин-20 и Triton X-100. Эти эксперименты позволяют предположить, что причиной наблюдаемых эффектов является не химическое воздействие фермента с детергентов, а изменение объема мицеллярной фазы. Зависимость скорости пероксидазной реакции от концентрации донора электронов линеаризуется в двойных обратных координатах и в первом приближении не зависит от концентрации детергента в растворе. Размер мицелл твина-20 не меняется при различной концентрации твина-20 и при добавлении разного количества арахидоновой кислоты в среду и составляет примерно 8,9 нм в диаметре. В присутствии в растворе более 0,008 % по объему твина-20 не обнаружено собственных мицелл АА. Объяснением этому служит то, что арахидоновая кислота полностью растворяется в мицеллах твина-20. Экспериментально показано, что концентрация детергента влияет на эффективность ингибирования PGHS напроксеном. При повышении концентрации детергента эффективность ингибирования понижается, вследствие большей растворимости нарпоксена в мицеллярной фазе, чем в водной. Концентрация твина-20 не влияет на скорость связывания напроксена с PGHS. Показано, что увеличение концентрации твина-20 уменьшает максимальную скорость и увеличивает константу диссоциации холофермента. Сопоставление результатов кинетических экспериментов и данных по составу мицеллярной системы позволило произвести учет взаимодействия субстратов фермента с мицеллярной фазой позволил разработать модель взаимодействия фермента PGHS с субстратами с учетом гетерогенной системы с наличием гидрофобной и гидрофильной фаз. На основе построенной модели выведено уравнение зависимости реальной константы Михаэлиса от наблюдаемой. Все неизвестные в этом уравнении могут быть определены на основе кинетических экспериментов. Посчитан коэффициент распределения арахидоновой кислоты между фазами: 713. При использовании коэффициента распределения получены значения константы Михаэлиса для циклооксигеназной реакции в случае поступления арахидоновой кислоты из мицелл, и из воды: 6,8 мМ и 9,5 мкМ, соответственно, что различается почти на 3 порядка.То, через какую фазу вещество взаимодействует с ферментом, критично также для определения специфичности фермента к выбранному веществу. Разработанные подходы и модели можно использовать для других субстратов PGHS. Также возможно использование метода определения абсолютного значения Км для других ферментов в сходных системах.