Новые инструменты для изучения регуляторных зон рибосомного туннеля, полученные на основе специфических лигандов пептидилтрансферазного центра рибосомыНИР

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2013 г.-31 декабря 2013 г. Новые инструменты для изучения регуляторных зон рибосомного туннеля, полученные на основе специфических лигандов пептидилтрансферазного центра рибосомы
Результаты этапа: Полученные в 2013 году важнейшие результаты Задачей проекта является создание новых производных антибиотиков, ингибирующих биосинтеза белка за счет специфического связывания с рибосомой в А-сайте ее пептидилтрансферазного центра (ПТЦ). Такие соединения представляют интерес как зонды для изучения регуляции функционирования рибосомы, а также как вещества, на базе которых могут быть созданы новые антибиотики. На основе имеющихся в литературе данных об атомной структуре комплексов антибиотиков с большой субъединицей рибосомы планируется создать соединения, которые способны, с одной стороны, образовывать прочные комплексы с рибосомой за счет собственно антибиотика или его фрагмента, выполняющих роль «якоря», а с другой, взаимодействовать с интересующими нас сайтами рибосомного туннеля c помощью связанного с "якорем" заместителя ("щупа"). В качестве антибиотиков, играющих роль «якоря», в проекте использованы хлорамфеникол (Рисунок 1) и цефалотаксин (Рисунок 2, а), связывание которых с А-сайтом ПТЦ рибосомы хорошо доказано. Механизм действия хлорамфеникола основан на ингибировании пептидилтрансферазной активности посредством прямого блокирования А-сайта ПТЦ рибосомы, при этом дихлорацетильная группа антибиотика направлена в сторону РТ. Если заменить дихлорацетильную группу в структуре антибиотика на пептидный фрагмент, открывается возможность получения пептидных аналогов, которые могут связываться в ПТЦ за счет остатка хлорамфеникола, и при этом пептидная часть этих аналогов ("щуп") будет находиться в РТ. В основе биологической активности цефалотаксина и его аналогов лежит способность ингибиторовать элонгацию полипептидной цепи преимущественно на рибосомах эукариот. Для алкалоида семейства цефалотаксина, гомохаррингтонина (Рисунок 2, б), с помощью рентгеноструктурного анализа показано, что он взаимодействует с А- сайтом большой субчастицы рибосомы, препятствуя связыванию аминоацил-тРНК в ПТЦ, при этом ацильный заместитель находится в РТ. Выбор заместителей в гибридных молекулах основывался как на литературных данных последних лет, так и на наших собственных результатах, касающихся взаимодействия элементов рибосомного туннеля с боковыми цепями растущей полипептидной цепи. В частности, особый интерес представляет исследование области так называемого «аденинового кармана», образованного регуляторным (.сенсорным.) нуклеотидным остатком А2062 рибосомной 23S РНК (E.coli) и его окружением, с которым возможно взаимодействует ключевой остаток аргинина некоторых «стоп-пептидов» при аресте трансляции. С этим же элементом РТ по нашим данным взаимодействует остаток карнитина в соответствующем производном тилозина. Исходя из этого, а также с учетом рентгеноструктурных данных о сайтах связывания в рибосоме гомохарингтонина и хлорамфеникола для моделирования были предложены производные цефалотаксина, модифицированные по гидроксильному остатку радикалами различной структуры и длины, несущими положительный заряд (аргинин-содержащие пептиды, карнитин, бетаины, амины), а также производные хлорамфеникола, в которых заместитель представлен аминокислотными, ди- и трипептидными радикалами, включая «стоп-пептиды». Компьютерное моделирование комплексов предполагаемых аналогов цефалотаксина и хлорамфеникола с рибосомой E.coli было выполнено методом молекулярного докинга на основе известных рентгеноструктурных данных с помощью программы PyMol. Был проведен виртуальный скрининг связывания с рибосомой E.coli аминокислотных, ди- и трипептидных аналогов хлорамфеникола, в которых заместитель был представлен всеми возможными вариантами из остатков 20-ти белковых L-аминокислот (всего 11154 структуры, включая таутомерные формы His и Arg). Генерирование 3D конформаций пептидных производных хлорамфеникола с оптимальной геометрией проводилось из соответствующих молекул, записанных в формате SMILES, с помощью программы OpenBabel. При этом предполагалось, что конформация рибосомы жестко закреплена, а соответствующие лиганды подвижны. Полученные конформации производных хлорамфеникола в комплексах с рибосомой были ранжированы по энергии связывания и по соответствию расположения хлорамфеникольной части в этих структурах данным РСА (были рассчитаны RMSD). В результате виртуального скрининга комплексов аминокислотных и пептидных производных хлорамфеникола с рибосомой E.coli и компьютерного моделирования комплексов аналогов гомохарингтонина с рибосомой H.marismortui были выбраны соединения, которые предполагается синтезировать в рамках данного проекта. В отчетном году начат синтез пептидных производных хлорамфеникола; получены производные со следующими пептидами: AcMetArgLeu, Ac- IleArgAla, Ac-IleTrpPro (AcMRL-CLM, AcIRA-CLM, AcIWP-CLM, соответственно). Для этого гидролизовали амидную связь в кислых условиях и конденсировали полученное соединение через образованную аминогруппу методом активированных эфиров с защищенным по боковым функциям ацетилтрипептидами. Для блокирования гуанидиновой группы аргинина использовали Pbf-защиту, индольное кольцо триптофана защищали Вос-группой. Кроме того, синтетическая часть проекта предполагала получение цефалотаксина. Нами разработана оригинальная методика получения предшественника цефалотаксина - пентациклического (1R*,2S*,3aS*,14bS*)-1,2,3,5,6,8,9,14b-октагидро-4H- циклопента[a][1,3]диоксоло[4,5-h]пирроло[2,1-b][3]бензазепин-1,2-диола с цис-расположением гидроксильных групп. Полный синтез данного соединения, исходя из пирролидин-2-она, включал одиннадцать стадий, из которых ключевые четыре – это диаллилборирование с использованием триаллилборана, внутримолекулярный метатезис в присутствии катализатора Граббса 1-го поколения, реакция бромоциклокарбамирования спиробициклического амида под действием NBS (N-бромсукцинимида) и внутримолекулярное арилирование спиробициклического аллильного катиона. В ходе работы было найдено, что синтетическую цепочку можно сократить на две стадии, при использовании Pd(TFA)2 вместо NBS. В этом случае трехстадийное превращение спиробициклического олефина в трициклический лактам проходит в одну стадию. Кроме того, исследовался каталитический вариант этого превращения. Стадию арилирования также была усовершенствована использованием биметаллического металлокомплексного катализатора на основе Ir и Sn с вместо 10 кратного избытка агрессивного реагента SnCl4, применение которого описано в литературе. Полученное соединение планируется использовать для получения пептидных производных по гидроксильным группам. Очистка промежуточных и целевых соединений производилась с применением колоночной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Соединения охарактеризованы методами масс- спектрометрии, ЯМР-спектроскопии и аминокислотного анализа. Для изучения связывания полученных производных с рибосомами разработана методика с использованием метода поляризации флуоресценции, который позволяет оценивать константы связывания новых соединений либо по связыванию их флуоресцентных производных, либо по вытеснению этими соединениями флуоресцентно-меченных ингибиторов из их комплексов с рибосомой. В рамках работы были получены производные тилозина, десмикозина и 5-О- микаминозилтилонолида (ОМТ), содержащие флуоресцентные остатки родамина, флуоресцеина, Alexa Fluor, BODIPY FL и нитробензоксадиазола (NBD), а также BODIPY FL С5-производное эритромицина. Было изучено связывание cинтезированных флуоресцентных соединений с рибосомами E. сoli путем измерения зависимости поляризации флуоресценции от концентрации рибосом при постоянной концентрации флуоресцентного производного; рассчитаны кажущиеся константы диссоциации (Kd) комплексов рибосомы с флуоресцентными производными макролидов. При апробации методики определяли связывание синтетических производных макролидов, ранее полученных в нашей лаборатории, с бактериальными рибосомами, которое изучалось по вытеснению BODIPY-меченного эритромицина и BODIPY- или NBD-меченного тилозина из их комплексов с рибосмами E.сoli; было показано, что Kd, полученные методом поляризации флуоресценции, изменяются в том же ряду, что и ранее определенные значения ингибирующей активности, которую те же соединения проявляли в бесклеточной системе биосинтеза белка. Методика разработана в применении как к флуориметру с одной кюветой, так и в частично автоматизированном варианте с использованием планшетного флуориметра. По разработанной методике определяли константы связывания новых пептидных производных хлорамфеникола с рибосомами E.coli. Показано, что в то время как хлорамфениколамин практически не связывается с рибосомами, комплексы производных AcMRL-CLM, AcIRA-CLM, AcIWP-CLM характеризуются константами диссоциации, значения которых находятся на уровне немодифицированного антибиотика.
2 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. Новые инструменты для изучения регуляторных зон рибосомного туннеля, полученные на основе специфических лигандов пептидилтрансферазного центра рибосомы
Результаты этапа: Полученные в 2014 году важнейшие результаты Задачей проекта является создание новых производных антибиотиков, ингибирующих биосинтеза белка за счет специфического связывания с рибосомой в А-сайте ее пептидилтрансферазного центра (ПТЦ). Такие соединения представляют интерес как зонды для изучения регуляциифункционирования рибосомы, а также как вещества, на базе которых могут быть созданы новые антибиотики. На основе имеющихся в литературе данных об атомной структуре комплексов антибиотиков с большой субъединицей рибосомы планируется создать соединения, которые способны, с одной стороны, образовывать прочные комплексы с рибосомой за счет собственно антибиотика или его фрагмента, выполняющих роль «якоря», а, с другой, взаимодействовать с интересующими нас сайтами рибосомного туннеля c помощью связанного с «якорем» заместителя («щупа»). В качестве антибиотиков, играющих роль «якоря», в проекте использованы хлорамфеникол (Рисунок 1) и цефалотаксин (Рисунок 2, а), связывание которых с А-сайтом ПТЦ рибосомы хорошо доказано. Механизм действия хлорамфеникола основан на ингибировании пептидилтрансферазной активности посредством прямого блокирования А-сайта ПТЦ рибосомы, при этом дихлорацетильная группа антибиотика направлена в сторону РТ. Если заменить дихлорацетильную группу в структуре антибиотика на пептидный фрагмент, открывается возможность получения пептидных аналогов, которые могут связываться в ПТЦ за счет остатка хлорамфеникола, и при этом пептидная часть этих аналогов («щуп») будет находиться в РТ. В основе биологической активности цефалотаксина и его аналогов лежит способность ингибиторовать элонгацию полипептидной цепи преимущественно на рибосомах эукариот. Для алкалоида семейства цефалотаксина, гомохаррингтонина (Рисунок 2, б), с помощью рентгеноструктурного анализа показано, что он взаимодействует с А- сайтом большой субчастицы рибосомы, препятствуя связыванию аминоацил-тРНК в ПТЦ, при этом ацильный заместитель находится в РТ. Выбор заместителей в гибридных молекулах основывался как на литературных данных последних лет, так и на наших собственных результатах, касающихся взаимодействия элементов рибосомного туннеля с боковыми цепями растущей полипептидной цепи. В частности, особый интерес представляет исследование области так называемого «аденинового кармана», образованного регуляторным («сенсорным») нуклеотидным остатком А2062 рибосомной 23S РНК (E.coli) и его окружением, с которым возможно взаимодействует ключевой остаток аргинина некоторых «стоп-пептидов» при аресте трансляции. С этим же элементом РТ по нашим данным взаимодействует остаток карнитина в соответствующем производном тилозина. Исходя из этого, а также с учетом рентгеноструктурных данных о сайтах связывания в рибосоме гомохарингтонина и хлорамфеникола для моделирования были предложены производные цефалотаксина, модифицированные по гидроксильному остатку радикалами различной структуры и длины, несущими положительный заряд (аргинин-содержащие пептиды, карнитин, бетаины, амины), а также аминокислотные и пептидные производные хлорамфеникола. В отчетном году проведен синтез аминокислотных производных хлорамфеникола и цефалотаксина, структура которых выбрана на основе. компьютерного моделирования комплексов аналогов цефалотаксина и хлорамфеникола с рибосомами H.marismortui и E.coli, выполненного методом молекулярного докинга на основе известных рентгеноструктурных данных на первом этапе проекта. Был проведен виртуальный скрининг связывания с рибосомой E.coli аминокислотных, ди- и трипептидных аналогов хлорамфеникола, в которых заместитель был представлен всеми возможными вариантами из остатков 20-ти белковых L-аминокислот (всего 11154 структуры, включая таутомерные формы His и Arg). Осуществлен синтез серии аминокислотных производных хлорамфеникола, как со свободной аминогруппой аминокислотного остатка, так и содержащих ацетильные и трет- бутилоксикарбонильные группировки. Синтез осуществляли по отработанной ранее методике, включающей кислотный гидролиз хлорамфеникола с образованием хлорамфениколамина, конденсацию последнего через образованную аминогруппу с защищенными по аминогруппе и боковым функциям аминокислотами методом активированных эфиров и деблокирование конъюгата. По результатам компьютерного моделирования аминокислотных производных цефалотаксина для синтеза были выбраны аналоги, содержащие положительно-заряженные аминокислотные остатки: бетаина, L-карнитина, L-аргинина. Ввиду низкой реакционной способности гидроксильной группы цефалотаксина, ее ацилирование проводили посредством хлорангидридов аминокислотных производных, которые получали из бетаина, О-ацетил- либо О-бензоил-L-карнитина и N-бензилоксикарбонилнитро-L-аргинина. Очистка промежуточных и целевых соединений производилась с применением колоночной хроматографии на силикагеле и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Соединения охарактеризованы методами масс-спектрометрии, ЯМР-спектроскопии и аминокислотного анализа. Для изучения связывания полученных аминокислотных производных хлорамфеникола с рибосомами E.сoli был применен метод с использованием поляризации флуоресценции, который позволяет оценивать константы связывания новых соединений по вытеснению этими соединениями флуоресцентно-меченных ингибиторов из их комплексов с рибосомой. В качестве флуоресцентно-меченных ингибиторов были использованы BODIPY-меченный эритромицин и BODIPY-меченный тилозин. Для определения констант диссоциации комплексов производных хлорамфеникола с 70S рибосомами E. coli готовили и инкубировали комплекс флуоресцентно-меченного производного антибиотика и 70S E.coli, затем добавляли растворы производных хлорамфеникола в диапазоне концентраций от 0,5 мкМ до 1000 мкМ. Для каждого из соединений были получены кривые зависимости поляризации флуоресценции от количества добавленного соединения и рассчитаны константы диссоциации комплексов с рибосомами. Показано, что объемные группировки (Вос) в структуре аминокислотных производных хлорамфеникола оказывают негативное влияние на связывание этих соединений с рибосомой, в то время как ацетильные производные и особенно соединения со свободной аминогруппой образуют значительно более прочные комплексы с рибосомами E.coli. Показано, что предсказанные в результате виртуального скрининга константы диссоциации комплексов аминокислотных производных хлорамфеникола с рибосомами E.coli в значительной степени коррелируют с экспериментально полученными в рядах аминокислотных производных хлорамфеникола и ацетиламинокислотных производных хлорамфеникола. Наиболее прочным связыванием с рибосомами E.coli характеризовались пролиновое, глициновое, аланиновое и гистидиновое производные хлорамфенткола, причем константа диссоциации последнего оказалась на порядок ниже таковой для хлорамфеникола. Изучение способности аминокислотных производных хлорамфеникола ингибировать трансляцию проводили в системе биосинтеза люциферазы светлячков in vitro (исследование было проведено совместно с В.А. Колбом, Институт белка РАН, Пущино). Об уровне синтеза белка люциферазы судят по интенсивности люминесценции, которая появляется вследствие катализируемого люциферазой окисления люциферина. Оказалось, что данные по ингибированию трансляции in vitro, коррелируют с данными, полученные методом поляризации флуоресценции. Таким образом, из данных по связыванию аминокислотных производных хлорамфеникола с рибосомами E. coli и способности ими ингибировать трансляцию in vitro, можно сделать вывод о том, что введение аминокислотного или пептидного остатка на N концевую группу хлорамфениколамина значительно усиливает взаимодействие образующихся конъюгатов с рибосомой. Возможность конкурировать за связывание с флуоресцентно меченным макролидом (эритромицином или тилозином) свидетельствует о том, что данные соединения связываются именно в рибосомном туннеле. Применение методов молекулярного докинга и молекулярной динамики позволяет говорить о наличии взаимодействия между заряженной аминогруппой аминокислотных производных с фосфатной группой G2505 рибосомного туннеля. Однако более точное выявление молекулярных контактов между полученными соединениями и элементами РТ требует применение дополнительных подходов, таких как химический пробинг и рентгеноструктурный анализ.
3 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. Новые инструменты для изучения регуляторных зон рибосомного туннеля, полученные на основе специфических лигандов пептидилтрансферазного центра рибосомы
Результаты этапа: Проектом предусматривался дизайн, синтез и изучение взаимодействия с рибосомой новых инструментов для исследования механизма регуляции трансляции, полученных на основе антибиотиков, специфически взаимодействующих с рибосомой в области А-сайта ее пептидилтрансферазного центра. Такие соединения представляют несомненный интерес как зонды для изучения регуляции функционирования рибосомы, а также как вещества, на базе которых могут быть созданы новые антибиотики. На основе имеющихся в литературе данных об атомной структуре комплексов этих антибиотиков с большой субъединицей рибосомы созданы соединения, которые способны, с одной стороны, образовывать прочные комплексы с рибосомой за счет собственно антибиотика или его фрагмента, выполняющих роль «якоря», а с другой, взаимодействовать с функционально важными сайтами рибосомного туннеля c помощью связанного с «якорем» заместителя («щупа»). В качестве антибиотиков, играющих роль «якоря», в проекте использованы хлорамфеникол и цефалотаксин, связывание которых с А-сайтом ПТЦ рибосомы хорошо доказано. В ходе выполнения проекта методом молекулярного докинга проведено моделирование взаимодействия производных цефалотаксина с ПТЦ архейной и эукариотической рибосом; осуществлен синтез ряда новых эфиров цефалотаксина, в которых гидроксильная группа цефалотаксина ацилирована остатками аминокислот и коротких пептидов; показано, что аминокислотные производные цефалотаксина проявляют цитотоксическую активность на линии эукариотических клеток HEK293T с концентрациями полуингибирования 20-200 мкМ и способны подавлять трансляцию репортерных мРНК in vivo. В проекте существлен синтез ряда аминокислотных и пептидных производных хлорамфеникола, структура которых выбрана на основе компьютерного скрининга связывания всех аминокислотных, дипептидных и трипептидных производных хлорамфеникола с рибосомой E.сoli. С помощью вытеснения флуоресцентно-меченных антибиотиков из их комплексов с рибосомами по изменению поляризации флуоресценции определены константы связывания аминокислотных производных хлорамфеникола с рибосомой E.coli, найдены корреляции между экспериментальными и расчетными константами. Проверена эффективность ингибирования биосинтеза белка аминокислотными производными хлорамфеникола в прокариотических системах трансляции; показано, что данные по ингибированию трансляции in vitro, коррелируют с данными по связыванию этих производных с бактериальными рибосомами, полученными методом поляризации флуоресценции. На заключительном этапе проекта в рамках совместной работы с Ю. Поликановым (University of Illinois, Chicago, USA) проведены рентгеноструктурные исследования комплексов ингибиторов, проявивших наиболее интересные свойства, с рибосомами T. Thermophiles; показано, что заместители при аминогруппе хлорамфениколамина направлены в сторону в район сенсорного н.о А2062, показано, что аминокислотный остаток в гистидиновом аналоге хлорамфеникола взаимодействует с основанием U2506 (нумерация н.о. по E.coli) и посредством сети водородных связей с участием молекулы воды с фосфатом G2505 23S рРНК. Таким образом, предложенные в данном проекте соединения, сконструированные на основе антибиотиков, связывающихся в А-сайте ПТЦ рибосомы, позволили выявить наиболее вероятные контакты аминокислотных и пептидных фрагментов с элементами рибосомного туннеля. В случае гистидинового аналога хлорамфеникола удалось получить прямые данные о взаимодействии аминокислотного остатка с нуклеотидными остатками 23S РНК в сенсорном участке РТ, который является важным элементом системы регуляции экспрессии генов на уровне трансляции.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".