| Результаты этапа: 1. Результаты исследования показали роль С-концевых хвостов тубулина в процессе роста микротрубочки. Во-первых, молекулярно-динамические расчеты на новых структурах тубулина подтвердили, что С-концевой хвост альфа-тубулина периодически взаимодействует с его продольным полимеризационным интерфейсом, таким образом, вероятно, напрямую мешая его присоединению к протофиламенту при росте микротрубочки. Взаимодействие альфа-хвоста с глобулярной частью белка обеспечивается за счет множественных контактов с консервативными положительно заряженными аминокислотными остатками на полимеризационном интерфейсе благодаря большому количеству отрицательно заряженных глутаматов в альфа-хвосте. Во-вторых, мы обнаружили, что С-концы альфа-тубулинов формируют контакты с соседними бета-субъединицами в теле микротрубочек, взаимодействия с аминокислотами R390, R391. Это предсказание напрямую подтверждается экспериментальными данными криоэлектронной микроскопии из лаборатории А.Ролл-Мекак (Zehr and Roll-Mecak, BiorXiv 2023).
Бета-хвосты в молекулярно-динамических траекториях также взаимодействовали с положительными остатками на глобулярной части бета-тубулина. Моделирование не выявило занимание бета-хвостами латеральных интерфейсов между протофиламентами тубулинов, которые отвечают за поддержание пространственной структуры микротрубочки. Также было показано, что продольные межтубулиновые интерфейсы не могут быть достигнуты, несмотря на большую, чем у альфа-тубулина, длину С-концевого хвоста.
2. Тубулин обладает достаточно большим отрицательным общим электрическим зарядом (-24 на одной субъединице), при этом электрический потенциал неравномерно распределен по его поверхности (рис. 2.1). Как видно, при повышении ионной силы раствора электростатические эквипотенциальные поверхности “коллапсируют” на поверхность белка, поскольку ионы в растворе экранируют заряды белка, тем самым эффективно уменьшая их, что приводит к уменьшению интенсивности создаваемого белком электростатического поля. Электростатические столкновительные комплексы при этом предсказуемо образуются с меньшей скоростью (рис. 2.2). Однако, при нулевой ионной силе электростатические поля димеров тубулина настолько интенсивны и имеют одинаковую полярность (рис. 2.1а), что это вообще препятствует их сближению и формированию каких бы то ни было комплексов.
При повышении температуры вязкость раствора уменьшается, экранирование электрических зарядов также уменьшается, и, кроме того, повышается среднее расстояние, проходимое частицей за единицу времени. Совокупность этих факторов приводит к более частым столкновениям молекул и, как следствие, к более высокой скорости образования столкновительных комплексов (рис. 2.3).
В процессе сборки микротрубочки свободные димеры тубулина из раствора присоединяются к растущему концу микротрубочки. Обычно процесс образования комплекса белков проходит в несколько стадий, первыми из которых являются диффузия белков и их электростатическое взаимодействие, приводящие к их пространственной ориентации и образованию электростатических столкновительных комплексов, которые на следующих стадиях трансформируются в финальные комплексы. Процесс образования комплекса двух димеров тубулина в растворе и димера с фрагментом микротрубочки был изучен с использованием метода броуновской динамики, однако, в компьютерной модели не удалось получить комплексы, напоминающие те, которые образуются при росте микротрубочки в клетке или in vitro. Результирующие комплексы приведены на рисунках в таблицах 2.1–2.8. Получающиеся столкновительные комплексы имеют довольно низкую энергию электростатического притяжения (4 kT) для образования метастабильных состояний. Вывод, который можно сделать из результатов моделирования, заключается в том, что электростатическое взаимодействие, по крайней мере на этапах диффузии и формирования предварительных столкновительных комплексов, не способствует полимеризации микротрубочек.
3. Анализ результатов крупнозернистой броуновской динамики показывает, что не взаимодействующие тубулины в модели сталкиваются в ориентациях, позволяющих сформировать комплекс, чаще, чем образуется продуктивный продольный контакт между тубулинами in vitro. Наличие притяжения между тубулинами в модели приводит к существенному ускорению ассоциации тубулинов. При этом большую роль играет ширина потенциала взаимодействия. Так, при малой ширине (что соответствует высоко экранированным электростатическим взаимодействиям в детальных расчетах броуновской динамики, описанных выше) ассоциация между тубулинами происходит существенно реже, чем при большой ширине потенциала взаимодействия (что соответствует слабо экранированным взаимодействиям при малых ионных силах, рис. 3.2а). При глубине продольного потенциала между тубулинами порядка ~10-12 kcal/mol, соответствующей ранее полученным оценкам [Gudimchuk et al., Nat Comm 2020], и при ширине потенциала порядка длины дебая при 100 мМ ионной силе раствора, наблюдается примерно 500-кратное ускорение формирования комплексов между тубулинами по сравнению с отсутвием взаимодействия на расстоянии (рис. 3.2б), и примерно 1000-кратное ускорение по сравнению с экспериментальными данными по скорости ассоциации тубулинов с концом микротрубочки при полимеризации в экспериментах in vitro [Walker et al., 1988]. Эти данные указывают на наличие существенного активационного барьера. Оценочная величина такого активационного барьера из экстраполяции графика на рис. 3.2б составляет не менее 6 kcal/mol, что должно обеспечивать достаточно высокую крутизну температурной зависимости скорости полимеризации тубулина. Природа барьера, предположительно, связана с необходимостью вытеснения воды из полимеризационного интерфейса при формировании микротрубочки, а также может, по крайней мере частично, определяться взаимодействиями тубулина со своим гибким С-концом, который также должен быть вытеснен из интерфейса при полимеризации.
4. Анализ данных криоэлектронных томограмм позволил нам дать предварительные оценки размеров олигомеров тубулина, присутствующих в растворе при наличии двух разных нуклеотидов. Эти данные будут полезны для сопоставления с предсказаниями моделирования и уточнения параметров взаимодействия между тубулинами.
5 и 6. Нами были получены препараты чистого меченного и немеченого тубулина, которые позволили исследовать температурную зависимость динамики микротрубочек. Было показано, что сборка микротрубочек в присутствии в растворе ГТФ существенно замедляется при охлаждении среды, а при температуре около 22 С тубулин перестает полимеризовываться. Разборка при температуре ниже этой наблюдается даже при эффективном “отключении” гидролиза ГТФ путем замены его на слабо гидролизуемый аналог, GMPCPP. Микротрубочки, полимеризованные в присутствии GMPCPP, разбираются на низких температурах, причем скорость разборки демонстрирует нелинейное ускорение, указывая на вклад гидрофобных эффектов в стабилизацию продольных контактов между тубулинами. |
