ИСТИНА

Среди методов терапии онкологических заболеваний особое место занимает комплекс методов онкологической гипертермии. Специфичность онкологической гипертермии заключается в том, что она направлена на разрушение злокачественных тканей, не затрагивая при этом здоровые ткани. Для реализации метода гипертермии используют такие физические факторы, как ультразвук, лазерное излучение различной мощности и частоты, а также магнитное поле. Среди перечисленных методов особого внимания заслуживает метод магнитной гипертермии. Метод локальной магнитной гипертермии заключается в направленной доставке магнитных наночастиц в ткань-мишень (например, злокачественная опухоль) и их локальном нагреве в области распределения под действием внешнего переменного магнитного поля. В переменном поле частицы разогреваются и сообщают тепло окружающим их опухолевым клеткам. В свою очередь, повышение температуры в интервале от 41–42 градусов по Цельсию способно привести либо к большей восприимчивости к другим методам лечения, либо к гибели раковых клеток. Причиной гибели опухолевых клеток являются денатурация, свертывание и агрегация белков, апоптоз, некроз и коагуляция, а также косвенный ответ, опосредованный активацией иммунной системы, стимулируемой сверхэкспрессией белков теплового шока. Принципиально важно, что здоровые клетки обладают гораздо более высокой, чем больные, температурной сопротивляемостью и остаются неповрежденными до температуры, примерно, 50-52 градусов по Цельсию. Для применения в медицине в качестве агентов для рассматриваемого метода гипертермии значительные перспективы имеют магнитные наночастицы. Благодаря высокой проникающей способности магнитного поля, а также возможности локального повышенного накопления магнитных наночастиц в органах и тканях магнитная гипертермия имеет ряд преимуществ как по сравнению с ультразвуковой и лазерной гипертермией, так и по сравнению со стандартными методами терапии: сохранение целостности, анатомической структуры и функционального состояния органа, в котором развивается опухолевый процесс, а также гомеостаза организма, возможность комбинировать локальную терапию с другими терапевтическими методиками. Магнитную гипертермию характеризуют такие особенности, как микроинвазивность и отсутствие побочных явлений, поскольку гибнут только опухолевые клетки и только в тех областях, на которые воздействует магнитное поле. В результате направленное, адресное разрушение опухолевых клеток при сохранении здоровых клеток и тканей приводит к высокому терапевтическому эффекту метода магнитной гипертермии с участием магнитных наночастиц. Проект направлен на разработку подхода для получения водорастворимых биосовместимых нанокомпозитов с участием солей альгиновой и полиакриловой кислот и нетоксичных наночастиц маггемита для в качестве агентов для магнитной гипертермии опухолевых клеток. Использование смеси полисахарид/полиакрилат позволит получать нанокомпозиты с регулируемым содержанием магнитной фазы, что позволит, в свою очередь, регулировать магнито-термические свойства полученных нанокомпозитов под действием переменного магнитного поля различной частоты и амплитуды, а также их устойчивость к биоразложению в физиологической среде под действием ферментов.

Currently, among methods of therapy of oncologic diseases a special place is occupied by a set of methods of oncologic hyperthermia. The specificity of oncologic hyperthermia is that it is aimed at destroying malignant tissues without affecting healthy tissues. To realize the method of hyperthermia utilize physical factors such as ultrasound, laser radiation of various power and frequency, as well as magnetic fields. Among these methods of magnetic hyperthermia deserves special attention. The method of local magnetic hyperthermia consists in the directed delivery of magnetic nanoparticles to the target tissue (e.g., malignant tumor) and their local heating in the distribution area under the action of an external alternating magnetic field. In the alternating field, the particles are heated and communicate heat to the surrounding tumor cells. In turn, an increase in temperature between 41-42 С is able to result in either greater susceptibility to other treatments or cancer cell death. Tumor cell death is caused by denaturation, protein coagulation and aggregation, apoptosis, necrosis and coagulation, and an indirect response mediated by activation of the immune system stimulated by overexpression of heat shock proteins. Crucially, healthy cells have a much higher temperature resistance than diseased cells and remain intact up to a temperature of approximately 50-52 C. Magnetic nanoparticles have significant prospects for application in medicine as agents for the considered method of hyperthermia. Due to the high penetrating ability of the magnetic field, as well as the possibility of local increased accumulation of magnetic nanoparticles in organs and tissues, magnetic hyperthermia has a number of advantages compared to ultrasound and laser hyperthermia, as well as compared to standard methods of therapy: preservation of the integrity, anatomical structure and functional state of the organ in which the tumor process develops, as well as homeostasis of the organism, the possibility of combining local therapy with other therapeutic methods. Magnetic hyperthermia is characterized by such features as microinvasiveness and absence of side effects, as only tumor cells are killed and only in the areas affected by the magnetic field. As a result, directed, targeted destruction of tumor cells while preserving healthy cells and tissues leads to a high therapeutic effect of the method of magnetic hyperthermia with the participation of magnetic nanoparticles. Nanoparticles characterized by the following complex of properties are used for magnetic hyperthermia: high saturation magnetization, biocompatibility, and low toxicity. Among the nanoparticles considered according to these criteria, magnetic iron oxide in the maximum degree of oxidation (γ-Fe2O3, maghemite) is an ideal candidate for magnetic hyperthermia. These nanoparticles are characterized by the necessary complex of magnetic properties, as well as being biocompatible and non-toxic, which makes them excellent candidates for magnetic hyperthermia therapy.

Для синтеза магнитных нанокомпозитов будет использована оригинальная методика, разработанная коллективом ранее при получении композиционных материалов с участием высокодисперсного маггемита, а также циклодекстринов, натриевых солей карбоксиметилцеллюлозы, а также природного полисахарида альгиновой кислоты. Суть предлагаемого метода заключается в одностадийном синтезе магнитных частиц химически инертного оксида железа из растворов соли Мора, Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O, в присутствии смеси линейных полимеров альгинат/полиакрилат в щелочной среде. К достоинствам выбранной методики относится возможность проведения синтеза при комнатной температуре без использования высокотемпературной обработки при атмосферном давлении в присутствии воздуха. Условия синтеза (концентрации, соотношения реагентов) будут подобраны для получения водорастворимых коллоидно устойчивых нанокомпозиционных материалов. Очистка водорастворимых высокомолекулярных продуктов от низкомолекулярных примесей будет проведена методом проточного диализа. Определение содержания железа в полученных нанокомпозитах будет проведено спектрофотометрически с использованием сульфосалициловой кислоты в качестве комплексона. Будет определена зависимость содержания магнитной фазы в полученных продуктах от соотношения компонентов синтеза (ионов железа(II) и мономерных звеньев полисахарида) в реакционной смеси. Контроль за природой, распределением по размерам и средним размером синтезированных магнитных наночастиц будет проведен методами рентгено-фазового анализа, ПЭМ и Мёссбауэровской спектроскопии. Характер взаимодействий между поверхностью наночастиц маггемита и функциональными группами альгинатов будет изучен методами ИК-, (ИК-Фурье) спектроскопии. Исследование магнитных характеристик образцов (намагниченность насыщения, остаточная намагниченность, коэрцитивная сила) проведут методом магнитомерии. Для выяснения гидродинамических характеристик частиц нанокомпозитов в водных растворах, исследования коллоидной стабильности магнитных дисперсий во времени будут использованы методы динамического и светорассеяния. Определение электрокинетических характеристик частиц в растворе будет проведено методом лазерного микроэлектрофореза. Исследование влияния переменного магнитного поля различной амплитуды и частоты на водные, а также водно-солевые (физиологические) растворы магнитных композитов будет определено методами калориметрии и магнитометрии. Для характеризации магнитных свойств ферромагнитных частиц и композитов на их основе планируется исследование статических петель гистерезиса образцов с помощью вибрационного магнитометра LakeShore 7407 в диапазоне магнитных полей ±16 кЭ при температурах от 100 до 450 К. Поведение частиц в переменном магнитном поле (динамические петли гистерезиса) может быть исследовано с помощью индукционного магнитометра. Оценка выживаемости клеток в присутствии растворов магнитных композитов под действием магнитного поля будет проводиться с использованием стандартного МТТ-теста. Сопоставление результатов выживаемости клеток в присутствии магнитных композитов после воздействия магнитного поля различной частоты и амплитуды и контроля (без воздействия поля) позволит провести количественную оценку гибели клеток под действием выделяющегося тепла. Методом конфокальной микроскопии будет получена дополнительная информация для количественной оценки гибели клеток в результате воздействия переменного магнитного поля на синтезированные магнитные композиты.

Предложен способ получения магнитных нанокомпозитов, содержащих анионные полисахариды и наночастицы магнитной формы железа (3+) с контролируемым содержанием магнитной фазы. Проведено комплексное изучение физико-химических, структурно-морфологических и магнитных свойств полученных нанокомпозиов. Проведено изучение связывания магнитными нанокомпозитами лекарственного препарата доксорубицина; изучены цитотоксические свойства магнитных нанокомпозитов с иммобилизиованным лекарственным препаратом.

В ходе работы были исследованы магнитные свойств композитов, содержащих альгинат, полиакрилат и маггемит, в твёрдой фазе и в растворе. С этой целью варьировали как содержание неорганической компоненты, так и массовое соотношением между альгинатом и полиакрилатом в составе композитов. Содержание неорганической компоненты в образцах варьировали от 6,3 до 19 % вес. Были использованы полиакрилаты следующих молекулярных масс: 2100, 8000, 15000 Да. Установлено, что петли гистерезиса исследуемых композитов являются насыщенными с полем насыщения порядка 3.5–5 кЭ. Показано, что магнитные характеристики полученных образцов определяются как содержанием магнитной компоненты (при фиксированных: соотношении полианионов и молекулярной массе полиакрилата), так и молекулярной массой полиакрилатов, участвующих в формировании композитов (при фиксированном содержании магнитной компоненты). Установлено влияние длины цепи полиакрилата, участвующего в формировании композита на его магнитные характеристики, связанное с изменением доли суперпарамагнитных частиц при изменении длины цепи синтетического полианиона. Показано, что чем короче длина цепи полиакрилата, тем плотнее формируются кластеры из суперпарамагнитных наночастиц в составе композита, что приводит к появлению у композитов ферромагнитных свойств. Анализ петель гистерезиса растворов изучаемых композитов свидетельствует о том, что по мере увеличения содержания магнитной компоненты в композитах намагниченность насыщения существенно изменяется: от 0.01 ед.СГС/г до 7.5 ед. СГС/г. В свою очередь, коэрцитивная сила изменяется при этом от 60 Э до 100 Э. Кроме того, продемонстрировано влияние длины цепи полиакрилата, участвующего в формировании композитов, на их магнитные свойства в растворе. Магнитотермические свойства полученных в работе композитов, содержащих альгинат, полиакрилаты, маггемит, были исследованы методом определения нагрева, возникающего вследствие воздействия переменного магнитного поля на их растворы. Переменное магнитное поле создавалось на частоте 300 кГц, амплитуда варьировалась от 70 до 100 Э. Для всех исследуемых растворов были получены также кривые намагниченности. Установлено, что увеличение содержания магнитной компоненты приводит к закономерному повышению температуры исследуемых растворов от нескольких градусов до 100С. Аналогичное поведение демонстрируют и физиологические (водно-солевые) растворы композитов. Показано также, что на нагрев растворов композитов в переменном магнитном поле также оказывает существенное влияние длина цепи полиакрилата, участвующего в формировании композита. Были определены, во-первых, параметры переменного магнитного поля, во- вторых, состав магнитных композитов, в третьих, концентрация растворов композитов, необходимые для достижения нагрева систем от 14С до температуры кипения. Была проведена оптимизация условий по воздействию переменного магнитного поля на растворы полученных магнитных нанокомпозитов для проведения гипертермии. В работе было проведено исследование влияния фермента, специфичного к полисахаридной компоненте полученных нанокомпозитов для оценки влияния их состава (соотношения полисахарид/полиакрилат) на устойчивость к биодеструкции. Был использован фермент альгинат-лиаза, катализирующий распад альгината по механизму элиминирования гликозидной связи. Оценку ферментативной устойчивости синтезированных композитов проводили методом динамического рассеяния света, фиксируя изменение размеров частиц от времени действия фермента. Установлено отсутствие изменения размеров макромолекул исследуемых полиакрилатов в течение нескольких суток, что свидетельствует об инертности альгинат-лиазы к изучаемым в работе полиакрилатам молекулярных масс 2100, 8000 и 15000 Да. Было изучено влияние магнитных наночастиц на ферментативный распад альгинатсодержащих магнитных нанокомпозитов в отсутствие полиакрилатов. Установлено, что размер (гидродинамический диаметр) частиц магнитных композитов, содержащих только альгинат, начинает последовательно уменьшаться сразу же после добавления фермента. Затем достигает минимума, после чего увеличивается, что связано с агрегацией продуктов ферментативного распада. Обнаруженное явление может быть обусловлено дополнительным каталитическим действием ионов железа на поверхности магнитных наночастиц, которые при образовании микрогеля электростатически взаимодействуют с карбоксильными группами альгината, нейтрализуя их отрицательный заряд. Полученный результат означает, что магнитные наночастицы в составе альгинатсодержащих нанокомпозитов способствуют действию альгинат-лиазы по отношению к полисахаридной компоненте. Для оценки устойчивости к биодеструкции магнитных композитов, содержащих маггемит, а в качестве полимерной матрицы альгинат и полиакрилат, варьировали массовое соотношение альгинат/полиакрилат, сожержание неорганической компоненты, молекулярную массу полиакрилата. Было показано, что в случае магнитных композитов с массовым соотношением альгинат/полиакрилат (молекулярной массы 2100 Да), составляющим 4/1, содержащих от 6 до 17 % вес. неорганической компоненты размер частиц последовательно уменьшается сразу после добавления фермента составляет 30±1 нм для всей серии указанных композитов и остаётся неизменным в течение нескольких суток. Время завершения ферментативного распада этой серии составляет от 17 до 21 минуты. Для магнитных композитов с массовым соотношением альгинат/полиакрилат (молекулярной массы 2100 Да), составляющим 1/1, содержащих от 6 до 17 % вес. неорганической компоненты, составляет от 15 до 19 минут. При этом размер описываемых частиц последовательно уменьшается аналогичным образом до 31±2 нм для всей серии. Варьирование молекулярной массы в составе композитов приводит к тому, что время завершения ферментативного распада для композитов с массовым соотношением альгинат/полиакрилат (молекулярной массы 8000 Да) от 4/1 до 1/1 изменяется в пределах от 18 до 22 минут. Похожие по значению времена завершения ферментативного распада демонстрируют магнитные композиты с массовым соотношением альгинат/полиакрилат (молекулярной массы 15000 Да) от 4/1 до 1/1. Обнаружено также, что размер продуктов деструкции составляет 32±2 нм для серии магнитных композитов, содержащих полиакрилат с молекулярной массой 8000 Да. В свою очередь, размер продуктов деструкции 39 нм характеризует серию магнитных композитов, содержащих полиакрилат с молекулярной массой 15000 Да. Установлено также, что по мере уменьшения размера частиц исследуемых композитов агрегации продуктов деструкции магнитных нанокомпозитов, содержащих альгинат и полиакрилаты (молекулярных масс 2100, 8000, 15000 Да) не происходит. При уменьшении размеров композитов до предельного значения, не превышающего 40 нм, происходит компенсация перешедших в раствор фрагментов альгината, участвовавших в стабилизации наночастиц, звеньями в составе макромолекул полиакрилата. Поэтому в образующихся продуктах деструкции оказывается достаточно функциональных ионогенных групп для предотвращения агрегации магнитных наночастиц в их составе. Было проведено изучение воздействия переменного магнитного поля (амплитуда 300 Тл, частота 100 Гц) на клетки НСТ116 в их физиологичном виде в условиях эффективного накопления нанокомпозитов (содержание в пробах 1% вес.), а также в условиях острого концентрационного действия композитов (5% вес. композитов в клеточной пробе вместо 1% вес.). Количественную оценку цитотоксичности проводили, используя МТТ-тест через 6 часов с начала контакта клеток с магнитными нанокомпозитами после гипертермии. Также МТТ-тесты были проведены через 24 и 48 часов для анализа эффективности адгезии и первого деления, соответственно. Установлено, что в отсутствие магнитных композитов необработанные нанокомпозитами клетки НСТ116 (контрольная проба), во-первых, сохранили свою способность распластываться через сутки после действия переменного магнитного поля, во-вторых, способность к делению через 48 ч инкубации после воздействия переменного магнитного поля. В свою очередь, воздействие переменного магнитного поля в присутствии раствора магнитного композита на основе альгината, содержащего 19 % вес. неорганической компоненты, на культуру распластывающихся опухолевых клеток НСТ116 в условиях эффективного накопления композита (1% вес. в клеточной среде) приводит к резкому уменьшению способности клеток НСТ116 к распластыванию. При этом клетки демонстрировали активное деление через 48 ч наблюдения, опережая контрольные клетки. Показано также, что МТТ-реакция клеток была снижена сразу после прекращения действия переменного магнитного поля. Обнаруженное явление, вероятно, связано, во-первых, с ослаблением активности митохондрий, задействованных в конверсии МТТ-реагента, во-вторых, с дальнейшим увеличением популяции клеток НСТ116 и свидетельствует о их выживании. В условиях концентрации острой токсичности (5 % вес.) магнитного композита на основе альгината, а также композитов, содержащих альгинат и полиакрилат, культура клеток НСТ116 после воздействия переменного магнитного поля демонстрирует как нарушенную способность к распластыванию, так и отсутствие деления, что означает снижение числа популяции. Аналогичная динамика преодоления гипертермического стресса выявлена в ходе экспериментов при уменьшении концентрации нанокомпозита до нетоксичных концентраций (1% вес.). Полученный результат свидетельствует о том, что клетки культуры НСТ116 под действием переменного магнитного в присутствии магнитных нанокомпозитов, содержащих альгинат, полиакрилат молекулярных масс 2100, 8000, 15000 Да и маггемит, после воздействия переменного магнитного поля либо поделились и погибли, либо не поделились.