ИСТИНА

Целью работы является изучение молекулярных механизмов функционирования цитохрома bd; выяснение того, каким образом фермент образует мембраный потенциал в отсутствие протонной помпы, каковы универсальные моменты собственно кислородоредуктазной реакции (последовательного присоединения четырех электронов к O2 без освобождения интермедиатов). Полученные результаты дадут ценную информацию для создания биосенсоров кислорода и угарного газа. Данные о структуре и функционировании активного центра цитохрома bd будут способствовать поиску путей регуляции патогенной микрофлоры в кишечнике.

Используя методы электрометрии, амперометрии, абсорбционной спектроскопии, естественного и магнитного кругового дихроизма, исследованы терминальные оксидазы типа bd из Escherichia coli (bd-I и bd-II) и Geobacillus thermodenitrificans. I. С помощью липофильного красителя оксонол VI измерена генерация цитохромом bd-II электрического потенциала в стационарных условиях. Добавление убихинола-1 или АТФ вызывало спектральный сдвиг оксонола VI, что указывает на образование потенциала в вывернутых везикулах. Образовавшийся потенциал полностью сбрасывался при добавлении каналоформера грамицидина. Следовательно, цитохром bd-II способен генерировать электрический потенциал в стационарных условиях. С помощью красителя акридиновый оранжевый также измерена генерация цитохромом bd-II градиента рН в стационарных условиях. Добавление убихинола-1 или АТФ приводило к тушению флуоресценции акридинового оранжевого, демонстрируя закисление внутреннего объема везикул. Образовавшийся градиент рН сбрасывали добавлением грамицидина. Каталитический оборот цитохрома bd-II сопровождается высвобождением протонов с периплазматической стороны мембраны, что эквивалентно внутренней стороне вывернутых везикул. Определена биоэнергетическая эффективность генерации протонного потенциала (соотношение H+/e-) цитохромом bd-II. Это соотношение оказалось равным 0,94 +/- 0,18 H+/e-. В качестве контроля использовали цитохром bd-I в тех же экспериментальных условиях и получили то же значение H+/e- (1,0 +/- 0,07). Таким образом, обе терминальные оксидазы, - цитохромы bd-I и bd-II, обладают одинаковой биоэнергетической эффективностью генерации протонного потенциала (H+/e- ~ 1). Изучена генерация мембранного потенциала встроенным в липосомы очищенным цитохромом bd-II в пределах одного молекулярного оборота фермента. Выяснено, на каких именно частных стадиях каталитической реакции происходит образование потенциала. Первые две стадии с временами 2,1 и 7,3 мкс, - образование оксикомплекса (R->A переход) и затем перекисного комплекса (А->Р переход), являются неэлектрогенными. Происходящий за ними P->F переход (превращение перекисного интермедиата в оксоферрильный), с временем 70 мкс, вносит основной вклад в электрогенную часть ответа (~90% от общей амплитуды). Последняя, 440-мкс фаза генерации потенциала (~10% от общей амплитуды) соответствует самому медленному переходу (F->О, превращение оксоферрильного интермедиата в окисленную форму), происходящему во фракции фермента со связанным хинолом. Контроль с цитохром bd-I показал похожие результаты. Таким образом, оба фермента, - цитохромы bd-I и bd-II, образуют мембранный потенциал в пределах одного каталитического цикла, вероятно, задействуя при этом схожие молекулярные механизмы. Полученные данные опровергают выводы работ групп М.Дж. де Маттоса (Нидерланды) и Р.К. Пула (Великобритания), согласно которым цитохром bd-II из E. coli не является первичным генератором протон-движущей силы. II. Сравнили свойства цитохромов bd из G. thermodenitrificans и E. coli, принадлежащих двум разным подсемействам оксидаз типа bd, S и L, соответственно. Фермент из G. thermodenitrificans действительно содержит высокоспиновый пентакоординированный гем b595, несмотря на то, что характерная для него Q(00)-полоса при 595 нм («альфа»-полоса) не обнаруживается в спектрах поглощения. Стехиометрия гемов b558, b595 и d на молекулу фермента составляет 1:1:1. 20-25% восстановленного гема b595 в оксидазе из G. thermodenitrificans связывает CO, тогда как в случае фермента из E. coli в тех же экспериментальных условиях такая реакция является незначительной. В оксидазе из G. thermodenitrificans наблюдается пониженное экситонное взаимодействие между восстановленными высокоспиновыми гемами b595 и d в сравнении с таковым в ферменте из E. coli. Последнее может означать, что эти два фермента отличаются расстоянием между гемом d и гемом b595 и/или величиной угла между плоскостями их порфириновых колец. Полученные данные также свидетельствуют о том, что у цитохрома bd из G. thermodenitrificans шестым аксиальным лигандом гема b558 является остаток гистидина, а не метионина, как у фермента из E. coli. III. Показано, что фермент из E. coli (bd-I) способен быстро разлагать перекись водорода с образованием приблизительно 0,5 моль О2 на один моль Н2О2. Эта каталазная активность регистрируется как в отсутствие дыхательных субстратов, так и в процессе кислород-редуктазной реакции фермента (в присутствии восстановителей дитиотреитола и убихинола-1). Активность исчезает при восстановлении цитохрома bd, не конкурирует с кислород-редуктазной активностью, не чувствительна к NO, CO, антимицину А и N-этилмалеимиду, но тормозится цианидом (Ki ~ 2,5 мкM) и азидом. За каталазную активность скорее всего отвечает высокоспиновый гем b595. Эта активность также наблюдается in vivo у дышащих клеток E. coli, у которых каталазы KatE и KatG отсутствуют, а цитохром bd суперэкспрессирован. Последнее наблюдение свидетельствует о том, что цитохром bd обладает защитной ролью в естественных условиях, предохраняя клетки E. coli от окислительного стресса.