ИСТИНА

сефарозе. Метод основан на введении с помощью сайт-направленного мутагенеза цистеиновых остатков в концевые фрагменты белков с последующей обратимой иммобилизацией на тиол-сефарозе. Связывание белков с введенными остатками цистеина может быть использовано как для аффинной очистки белков, так и для изучения белок-белковых взаимодействий. Предлагаемый подход может быть хорошим дополнением к методам, основанным на введении в белки различных «тагов» (включая «таги», содержащие сульфгидрильные группы), так как при его применении не требуется дополнительной стадии отщепления добавочных фрагментов и в минимальной степени нарушается процесс правильного сворачивания полипептидных цепей. В качестве удобных объектов для такого исследования являются «естественно-развернутые белки» (в частности, нами будет использован бета-казеин), так как в введение цистеиновых остатков в неструктурированные участки в минимальной степени влияет на свойства белка. Следует отметить, что «естественно-развернутые белки» широко вовлечены в белок-белковые взаимодействия, характерные для путей передачи сигнала в клетке, а основной целью разрабатываемого нами метода является изучение таких взаимодействий. Наши предварительные исследования показали, что в растворе может происходить образование комплексов между естественно развернутыми белками, в частности, между бета-казеином и овечьим прионом. Мы планируем с помощью связанных с тиол-сефарозой рекомбинантных форм бета-казеина, содержащих дополнительные остатки цистеина введенные в гидрофильный С- или в гидрофобный N- концевые фрагменты, исследовать особенности взаимодействия между бета-казеином и овечьим прионом, а также применимость предлагаемого подхода для изучения других белок-белковых взаимодействий. Кроме того, представляется важным исследовать возможность применения предложенных сорбентов для очистки белков из различных многокомпонентных систем. Мы полагаем, что предложенный подход является перспективным для исследования белок-белковых взаимодействий и может дополнять или даже конкурировать со столь распространенным, но имеющим определенные ограничения, методом коиммунопреципитации.

В ходе выполнения проекта созданы необходимые конструкции для экспрессии рекомбинантных бета-казеинов, содержащих цистеиновые остатки в гидрофильной N-концевой или в гидрофобной С-концевой части молекулы белка. Проведена экспрессия рекомбинантных белков в E.coli и их очистка методом аффинной хроматографии. Получены биосорбенты путем иммобилизации рекомбинантных бета-казеинов на тиол-сефарозе. Разработан новый подход для изучения белок-белковых взаимодействий, основанный на получении биосорбентов с иммобилизованными белками с дополнительными остатками цистеина. В частности на основе рекомбинантного бета-казеина молока с дополнительными остатками цистеина, введенными в гидрофильный С- или в гидрофобный N- концевые фрагменты получены сорбенты с экспонированным в раствор гидрофобными или гидрофильными участками молекулы казеина . Проведено исследование способности таких биосорбентов образовывать обратимые комплексы с другими белками, в частности с представителями "естественно развернутых" белков - нативным бета-казеином и овечьим прионом, а также с белками молока. Полученные с помощью предложенного подхода результаты были подтверждены стандартными иммунохимическими методами анализа белок-белковых взаимодействий. Показано также, что полученные биосорбенты могут быть использованы для выделения или концентрирования отдельных белков из биологических жидкостей.