ИСТИНА

Проект посвящён поиску и изучению новых нестандартных механизмов связывания тРНК с эукариотической рибосомой. До недавнего времени единственно возможными способами доставки тРНК на рибосому в физиологических условиях считались два классических пути - eIF2-зависимый (который имеет место при инициации трансляции, тРНК при этом доставляется в Р-сайт рибосомы) и eEF1A-зависимый (действующий при элонгации, тРНК доставляется в А-сайт). Однако недавние открытия, сделанные, в том числе, и нашим коллективом, поколебали эти представления. Так, для инициаторного цикла мы показали принципиальную возможность доставки тРНК на рибосому двумя другими белками – факторами eIF5B и eIF2D (последний был открыт и охарактеризован в нашей группе). Другая серия работ, выполненных зарубежными коллегами, указывает на возможность участия в доставке тРНК ещё одного фактора инициации, eIF2A – хотя в данном случае механизм явления остаётся нераскрытым. Наконец, нами было показано, что трансляция мРНК с ультракоротким лидером может происходить и вовсе в отсутствие инициаторных факторов, по механизму прямого связывания тРНК с Р-сайтом пре-ассоциированной 80S рибосомы. Все эти способы могут использоваться специфическими клеточными мРНК в условиях клеточных стрессов, когда классический фактор eIF2 инактивирован. В рамках данного амбициозного проекта мы планируем перенести изучение неканонических способов доставки тРНК при инициации трансляции из системы in vitro (в которой мы проводили наши предыдущие эксперименты) в живую клетку, идентифицировав природные клеточные мРНК, способные использовать eIF2-независимые пути инициации трансляции. В нашей работе мы собираемся использовать новейшие методы анализа «транслятома» живой клетки (совокупности мРНК, транслирующихся в клетке в данный момент), в том числе «рибосомный профайлинг», подразумевающий «глубокое секвенирование» фрагментов мРНК, защищаемых рибосомами. В качестве модельных организмов мы будем использовать дрожжи S. cerevisiae, генетически модифицированных мух D. melanogaster и культивируемые клетки человека. Мы планируем проверить нашу оригинальную гипотезу о его возможной роли фактора eIF2A в неканонической инициации трансляции, выяснить функцию фактора eIF2D в живой клетке, провести поиск клеточных мРНК, способных использовать eIF5B вместо eIF2; наконец, мы рассчитываем расширить наши исследования на стадию элонгации полипептида и изучить нестандартные функции фактора eEF1A. Отдельной задачей станет изучение низкомолекулярных ингибиторов эукариотической трансляции, направленных на доставку и аккомодацию тРНК в рибосоме. Поскольку среди мРНК, для которых уже показана возможность неканонической доставки тРНК при инициации трансляции, есть РНК возбудителей опасных вирусных заболеваний (в частности, гепатита С), то в перспективе работа может приобрести также и практические приложения.

В результате выполнения проекта было открыто ранее неизвестное свойство антибиотиков, относящихся к классу ингибиторов пептидилтрансферазного центра рибосомы, - а именно, их способность останавливать элонгацию полипептида в зависимости от вида аминокислот, встроившихся в пептид. Эти результаты приобретают особую значимость в связи с данными о структуре эукариотической рибосомы, которые стали доступны в последние два года. В связи с актуальностью тематики было принято решение частично скорректировать план работы и уделить большее внимание изучению антибиотиков. Нам удалось охарактеризовать и частично объяснить на молекулярном уровне обнаруженный нами феномен. Кроме того, мы открыли ещё один неожиданный эффект антибиотиков этого класса на эукариотическую клетку: оказалось, что в невысоких концентрациях они оказывают мРНК-специфический эффект на трансляцию, связанный с разными механизмами инициации. В данный момент обе эти части работы находятся на стадии опубликования статей. Реализация этих планов не помешала нам выполнить также и те задачи, которые были поставлены нами изначально. Нам удалось наладить метод рибосомного профайлинга (в ходе выполнения проекта он впервые был осуществлён в России), и в данный момент мы активно изучаем механизмы инициации трансляции целого ряда интересных мРНК, чья трансляция оказалась устойчивой к инактивации фактора eIF2. Мы также продолжили изучение структурно-функциональных свойств факторов eIF2D и eIF2A на модели дрожжей, дрозофилы и клеток млекопитающих. Кроме того, разработанные в ходе выполнения этой работы методические подходы позволили нам принять участие в двух совместных проектов, статьи по которым были опубликованы в 2013 году.