ИСТИНА

Исследования являются продолжением работ по изучению фундаментальных основ механизма действия и структуры ферментов, прежде всего, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и транскетолазы.

Research are a continuation of the study of the fundamental bases of the mechanism of action and structure of enzymes, first of all, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and transketolase.

Планировалось исследовать каталитические и структурные особенности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и транскетолазы из разных источников с целью установления механизмов их действия, а также их роли в регуляции метаболизма и других сторон жизнедеятельности клеток.

Научный задел данной работы заключается в разработке методов выделения глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и транскетолазы из разных источников, а также подходов к изучению их функций и структур.

На данном этапе работы было проведено изучение стабильности ферментов и их изоформ, особенностей белок-белковых взаимодействий и взаимодействий некоторых белков с низкомолекулярными соединениями, а также начато исследование участия некоторых ферментов в развитии патологических процессов. Было продолжено экспериментальное изучение природы взаимодействий, вовлеченных в формирование полибелковых агрегатов и амилоидоподобных структур, наблюдающихся при развитии нейродегенеративных патологий. С помощью биоинформатических и экспериментальных методов найдены и протестированы соединения, обладающие способностью предотвращать образование амилоидных структур из прионовых белков, а также уменьшать их амилоидогенность. В частности, были исследованы антиамилоидные свойства куркумина (и его производных – диметоксикоричная кислота) и тиамина и его аналогов. Было изучено антиагрегационное действие синтетических и природных полисульфоанионов, а также продемострирована возможность их использования для разрушения различных белковых агрегатов – амилоидных структур, телец включения и аморфных термоагрегатов. Было проведено исследование структурных особенностей рекомбинантной спермоспецифичной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (dN-GAPDS), обеспечивающих повышенную стабильность этой изоформы фермента по сравнению с соматической глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (GAPD). Были получены рекомбинантные белки dN-GAPDS, содержащих мутации аминокислотных остатков, которые могут быть необходимы для стабилизации dN-GAPDS (это дополнительные остатки пролина и остатки, вовлеченные в образование дополнительных солевых мостиков). Было получено три мутантных белка dN-GAPDS с заменами пролина на аланин (P111A, P157A, и P326A). Стабильность полученных белков исследовали тремя методами: флуориметрическим, методом дифференциальной сканирующей калориметрии и с помощью измерения скорости инактивации белков в присутствии детегента. Среди трех исследованных мутаций пролина только одна (P326A) привела к существенному снижению стабильности мутантного белка по сравнению с диким типом. В ходе исследования различных мутантных форм белка dN-GAPDS оказалось, что разрушение межсубъединичного мостика между D368 и R269 (мутация D368N) приводит к образованию неактивной формы фермента, склонной к агрегации, и обладающей амилоидными структурами. Таким образом, была выявлена мутация в белке dN-GAPDS, которая приводит к образованию белка с повышенной склонностью к агрегации и к образованию амилоидоподобных агрегатов. Возможно, именно такого рода мутации могут быть вовлечены в образования неактивных форм фермента, участвующих в образовании агрегатов, характерных для ряда нейродегенеративных патологий. В сравнительном плане проведено изучение свойств транскетолазы нормальных тканей человека (hТК) и транскетолазы из патогенной бактерии Burkholderia pseudomallei (TKВР), вызывающей заболевание мелиоидоз, которое часто заканчивается смертью. Изучено взаимодействие кофермента, тиаминдифосфата, с TKВР, охарактеризованы кинетические константы этого процесса. Установлено, что, в отличие от hТК, фермент из микроорганизмов характеризуется более широкой субстратной специфичностью и использует в качестве субстрата также оксипируват. Этот факт представляет определенный интерес, т.к. синтез ингибиторов на основе оксипирувата позволит избирательно блокировать бактериальный фермент, не затрагивая при этом hТК, с которой оксипируват не взаимодействует. Исследовано также субстратное ингибирование транскетолазы и показано, что причина такого ингибирования – образование основания Шиффа в результате взаимодействия рибозо-5-фосфата с аминогруппой пиримидинового кольца кофермента и последующее его восстановление цианборгидридом натрия. Изучен механизм субстратного ингибирования транскетолазы. Показано, что субстраты-акцепторы транскетолазы (ТК), такие, как рибозо-5-фосфат, фосфоглицериновый и глицериновый альдегиды, ингибируют фермент в присутствии цианборгидрида (ЦБГ). Инактивация имела место и в том случае, когда вместо ЦБГ использовали естественный компонент клетки - аскорбиновую кислоту. Показано, что инактивация обусловлена переходом, под действием восстановителей, активной формы ее кофермента в неактивную - ди- и тетрагидротиаминдифосфата.