ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Исследования являются продолжением работ по изучению фундаментальных основ механизма действия и структуры ферментов, прежде всего, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и транскетолазы.
Research are a continuation of the study of the fundamental bases of the mechanism of action and structure of enzymes, first of all, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and transketolase.
Планировалось исследовать каталитические и структурные особенности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и транскетолазы из разных источников с целью установления механизмов их действия, а также их роли в регуляции метаболизма и других сторон жизнедеятельности клеток.
Научный задел данной работы заключается в разработке методов выделения глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и транскетолазы из разных источников, а также подходов к изучению их функций и структур.
На данном этапе работы было проведено изучение стабильности ферментов и их изоформ, особенностей белок-белковых взаимодействий и взаимодействий некоторых белков с низкомолекулярными соединениями, а также начато исследование участия некоторых ферментов в развитии патологических процессов. Было продолжено экспериментальное изучение природы взаимодействий, вовлеченных в формирование полибелковых агрегатов и амилоидоподобных структур, наблюдающихся при развитии нейродегенеративных патологий. С помощью биоинформатических и экспериментальных методов найдены и протестированы соединения, обладающие способностью предотвращать образование амилоидных структур из прионовых белков, а также уменьшать их амилоидогенность. В частности, были исследованы антиамилоидные свойства куркумина (и его производных – диметоксикоричная кислота) и тиамина и его аналогов. Было изучено антиагрегационное действие синтетических и природных полисульфоанионов, а также продемострирована возможность их использования для разрушения различных белковых агрегатов – амилоидных структур, телец включения и аморфных термоагрегатов. Было проведено исследование структурных особенностей рекомбинантной спермоспецифичной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (dN-GAPDS), обеспечивающих повышенную стабильность этой изоформы фермента по сравнению с соматической глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (GAPD). Были получены рекомбинантные белки dN-GAPDS, содержащих мутации аминокислотных остатков, которые могут быть необходимы для стабилизации dN-GAPDS (это дополнительные остатки пролина и остатки, вовлеченные в образование дополнительных солевых мостиков). Было получено три мутантных белка dN-GAPDS с заменами пролина на аланин (P111A, P157A, и P326A). Стабильность полученных белков исследовали тремя методами: флуориметрическим, методом дифференциальной сканирующей калориметрии и с помощью измерения скорости инактивации белков в присутствии детегента. Среди трех исследованных мутаций пролина только одна (P326A) привела к существенному снижению стабильности мутантного белка по сравнению с диким типом. В ходе исследования различных мутантных форм белка dN-GAPDS оказалось, что разрушение межсубъединичного мостика между D368 и R269 (мутация D368N) приводит к образованию неактивной формы фермента, склонной к агрегации, и обладающей амилоидными структурами. Таким образом, была выявлена мутация в белке dN-GAPDS, которая приводит к образованию белка с повышенной склонностью к агрегации и к образованию амилоидоподобных агрегатов. Возможно, именно такого рода мутации могут быть вовлечены в образования неактивных форм фермента, участвующих в образовании агрегатов, характерных для ряда нейродегенеративных патологий. В сравнительном плане проведено изучение свойств транскетолазы нормальных тканей человека (hТК) и транскетолазы из патогенной бактерии Burkholderia pseudomallei (TKВР), вызывающей заболевание мелиоидоз, которое часто заканчивается смертью. Изучено взаимодействие кофермента, тиаминдифосфата, с TKВР, охарактеризованы кинетические константы этого процесса. Установлено, что, в отличие от hТК, фермент из микроорганизмов характеризуется более широкой субстратной специфичностью и использует в качестве субстрата также оксипируват. Этот факт представляет определенный интерес, т.к. синтез ингибиторов на основе оксипирувата позволит избирательно блокировать бактериальный фермент, не затрагивая при этом hТК, с которой оксипируват не взаимодействует. Исследовано также субстратное ингибирование транскетолазы и показано, что причина такого ингибирования – образование основания Шиффа в результате взаимодействия рибозо-5-фосфата с аминогруппой пиримидинового кольца кофермента и последующее его восстановление цианборгидридом натрия. Изучен механизм субстратного ингибирования транскетолазы. Показано, что субстраты-акцепторы транскетолазы (ТК), такие, как рибозо-5-фосфат, фосфоглицериновый и глицериновый альдегиды, ингибируют фермент в присутствии цианборгидрида (ЦБГ). Инактивация имела место и в том случае, когда вместо ЦБГ использовали естественный компонент клетки - аскорбиновую кислоту. Показано, что инактивация обусловлена переходом, под действием восстановителей, активной формы ее кофермента в неактивную - ди- и тетрагидротиаминдифосфата.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
2 | 1 января 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Фундаментальные основы механизма действия и структуры ферментов |
Результаты этапа: Определены параметры связывания кофактора с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназами из различных источников с помощью экспериментальных подходов (флуорометрическое титрование и изотермическая калориметрия) и молекулярного моделирования. Подтверждены данные по определению параметров связывания кофактора (никотинамидадениндинуклеотида окисленного – НАД) с ферментов из мышц млекопитающих. В этом случае связывание НАД характеризуется положительной кооперативностью. Спермо-специфическая форма глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы связывает кофактор с положительной кооперативностью, что должно влиять на регуляцию эффективности гликолиза в сперматозоидах. Предложены подходы для изменения характера кооперативности связывания кофакторов олигомерными ферментами с помощью точечного мутагенеза в области межсубъединичных взаимодействий. • Показано, что транскетолаза может использовать в качестве расщепляемого субстрата не только кетозу, но и альдозу (рибозо-5-фосфат). Продуктами реакции являются диоксиацетон и тетроза. Предполагается, что первично, после расщепления рибозо-5-фосфата, образуется сначала двууглеродный фрагмент, две молекулы которого затем уже конденсируются с образованием тетрозы. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимания механизмов катализа, осуществляемого различными тиамин-зависимыми ферментами. • Получены полноразмерные пространственные структуры двух изоформ транскетолазы – из тканей человека и из бактерий Burkholderia pseudoma. Проведен скринниг коммерческих баз химических соединений, возможно являющихся специфическими ингибиторами одной из двух исследованных форм транскетолаз. Начат отбор потенциальных ингибиторов и методом молекулярного моделирования (докинг) определены параметры связывания некоторых потенциальных ингибиторов с двумя изоформами трансктолазы. Начаты работы по выделению двух изоформ транскетолазы с целью экспериментальной проверки ингибирующего действия отобранных соединений. • Результаты работы опубликованы в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах. | ||
3 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Фундаментальные основы механизма действия и структуры ферментов |
Результаты этапа: | ||
4 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Фундаментальные основы механизма действия и структуры ферментов |
Результаты этапа: в 2016 году была получена новая важная информация о фундаментальных основах механизма действия и структуры ферментов, главным образом, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и транскетолазы. По результатам проведенных исследований опубликовано 7 статей в ведущих зарубежных (6 статей) и отечественных журналах. Были также сделаны доклады на международных конференциях. | ||
5 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Фундаментальные основы механизма действия и структуры ферментов |
Результаты этапа: Было доказано, что при модификации активного центра глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы сахарами, а также метилглиоксалем и глицеральдегид-3-фосфатом, снижается активность фермента и уменьшается его термостабильность. Высказано предположение, что обнаруженный механизм снижения активности фермента может участвовать в ухудшении энергетического метаболизма организма при его старении. Разработаны новые кинетические подходы к изучению механизма действия транскетолазы и выдвинута новая концепция регуляции активности этого фермента. На основании полученных результатов было опубликовано 13 статей в журналах, индексируемых в базе данных "Сеть науки" (WEB of Science), а также РИНЦ и других системах научного цитирования, а также сделано 6 докладов на конференциях. Кроме того защищена 1 диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук (К.В.Бариновой, научный руководитель В.И. Муронец). | ||
6 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Фундаментальные основы механизма действия и структуры ферментов |
Результаты этапа: Была выделена рекомбинантная глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа M.tuberculesis без дополнительных мотивов и изучены ее основные каталитические свойства. Исследованы механизмы действия транскетолазы при протекании односубстратной реакции. Доказано, что альфа-синуклеин инактивирует глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и уменьшает ее термостабильность. На основании полученных результатов будет опубликованы 3 статьи в журналах, индексируемых в базе данных "Сеть науки" (WEB of Science), а также РИНЦ и других системах научного цитирования. Кроме того защищена 1 диссертация на соискание ученой степени кандидата наук. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".