Полимеризация циклических оксалатов: синтез и свойства амфифильных блок-полиоксалатовНИР

Polymerization of cyclic oxalates: synthesis and properties of amphiphilic block-polyoxalates

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 16 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Полимеризация циклических оксалатов: синтез и свойства амфифильных блок-полиоксалатов
Результаты этапа: 1. Синтез и очистка циклического 1,2-пропиленоксалата Циклический пропиленоксалат мы синтезировали, проводя конденсацию пропиленгликоля с оксалилхлоридом в присутствии основания. (Рис. 1 в файле с доп. информацией) Данная реакция сопровождается образованием полимерного полипропиленоксалатакоторый подвергали деполимеризации при 130оС согласно работе [1], отгоняя в вакууме циклический пропиленоксалат при пониженном давлении (около 0,05 Торр). Именно эту процедуру мы и положили в основу методики, использованной наи для получения больших количеств циклического пропиленоксалата. Анализ спектра 1Н-ЯМР синтезированного мономера показал наличие 4 сигналов, соответствующих протонам фрагмента CH3-CH-CH2 (Рис. 2). Дублет в сильном поле при 1,49 м.д. был отнесен к трем эквивалентным атомам Н группы СН3, связанным с метиновой группой. Для диастереомерных метиленовых протонов наблюдаются два дублета в слабом поле при 4.46 и 4.53 м.д. Сигнал атома Н метина при 4.98 м.д. демонстрирует сложное расщепление (дублет квартетов дублетов), обусловленное вицинальным спин-спиновым взаимодействием с атомами водорода метильной и метиленовой групп. В то же время в спектре при значительном усилении можно выделить полосы, смещенные в сильное поле по сравнению с доминирующими полосами. Мы предположили, что они обусловлены наличием примеси гидролизованного мономера (как минимум два неэквивалентных по химическим сдвигам соединения, Рис. 3). Сдвиг сигналов протонов в сильное поле, очевидно, является следствием уменьшения электронной плотности на метиновых группах, вызванного раскрытием цикла вследствие гидролиза. При очистке пропиленоксалата вакуумной перегонкой содержание примесей постепенно уменьшалось (Рис. 4a-c), что в итоге привело к содержанию примесей на уровне около 1%. Такое количество примесей не может быть количественно оценено методом 1H-ЯМР. Полученный мономер был впервые охарактеризован методом дифференциальной сканирующей калориметрии (Рис. 5), которая выявила температуру плавления образца -37,8 оC с энтальпией около 4 Дж/г. 2. Исследование полимеризации 1,2-пропиленоксалата методом металлокомплексной полимеризации, катализируемой октаноатом олова (II) 2.1. Полимеризация в отсутствие добавленного инициатора. Поскольку синтезированный нами циклический пропиленоксалат содержал примесь гидролизованного мономера (монооксалат пропиленгликоля, Рис. 6), который может играть роль инициатора, мы оценили возможность проведения полимеризации в отсутствие дополнительного инициатора. Образцы для полимеризации готовили в атмосфере аргона, подвергая 100 мг мономера трем циклам вакуумирования при остаточном давлении 0.1-0.05 Торр и насыщения аргоном. Далее к образцам добавляли раствор катализатора в очищенном ТГФ, приготовленном в инертной атмосфере. Добавленный растворитель тщательно удаляли в вакууме при 50-60оС и запаивали образцы в вакууме. Образцы полимеризовали в течение суток при 100оС в масляной бане. При изучении этой системы мы сразу же натолкнулись на ряд особенностей, отличающих ее от полимеризации других циклических эфиров оксикарбоновых кислот: (а) образование олигомеров, не превращающихся в полимер при увеличении конверсии, (б) образование осадка, нерастворимого в органических растворителях, и (в) широкое молекулярно-массовое распределение основного полимерного продукта. На данном годичном этапе работы мы попытались изучить механизмы, лежащие в основе этих особенностей, и определить их связь со структурой циклических оксалатов в сравнении с другими циклическими мономерами для синтеза полиэфиров. Исследование реакционной смеси после окончания полимеризации методом эксклюзионной хроматографии показало образование двух фракций, сильно различающихся по молекулярным массам. (Рис. 7а, кривая 1) Одна из них представляет собой линейный полимер, степень полимеризации которого зависит от условий реакции (температура, время полимеризации, концентрация октаноата олова, содержание примесей), а другая фракция представляет собой олигомеры, состоящие из 3-6 звеньев пропиленоксалата (масса пика около 570, независимо от условий эксперимента). Предполагая равенство инкрементов показателей преломления для мономера и полимеров различной степени полимеризации, можно оценить, что суммарная фракция олигомеров и мономера составляет около 17%. В противоположность полимеризации лактида, конверсию которого можно легко определять по данным эксклюзионной хроматографии, делая поправку на различие в инкрементах показателей преломления мономера и полимера, в полимеризации оксалата этот метод дает искаженные результаты. Это вызвано образованием большого количества олигомеров, образующихся в ходе реакции. Перекрывание пиков олигомеров и остаточного мономера существенно искажает эти данные. Для оценки параметров молекулярно-массового распределения полиоксалатов мы описывали низкомолекулярный пик хроматограмм функцией Гаусса и полученную кривую вычитали из экспериментальной кривой. Результат вычитания использовался для оценки моментов молекулярно-массового распределения (Mw, Mn и дисперсии Mw/Mn) (Рис. 8a). Во всех опытах полимеры, синтезированные как в отсутствие, так и в присутствии добавленного инициатора имели широкое молекулярно-массовое распределение с Mn около 10000 и дисперсией 2-2.5. Для препаративного отделения олигомеров от основной полимерной фракции мы использовали метод фракционного осаждения диэтиловым эфиром. При смешивании раствора полимера в тетрагидрофуране 60 мг/мл с равным объёмом диэтилового эфира выпадает практически весь высокомолекулярный продукт, а олигомерная и мономерная фракции остаются в растворе. (Рис. 8b). Хроматограмма очищенного полимера практически полностью совпадала с результатом вычитания гауссовой аппроксимации низкомолекулярного пика. (Рис. 8b), что указывает на удовлетворительную точность вычитания сигнала олигомеров из хроматограмм. Анализ спектров 1Н-ЯМР полимеров (Рис. 9) показал, что основные полосы спектра сдвигаются вследствие раскрытия цикла мономера. Отличие химических сдвигов полос в спектре ЯМР, отвечающих остаточному мономеру и звеньям полимера, дает возможность оценить конверсию мономера с достаточно высокой точностью. Эти оценки показали, что полимеризация в течение суток при 100оС проходит с конверсией около 93.6±1%. Дальнейшее увеличение времени полимеризации до 2 или 3 суток не приводит к увеличению конверсии мономера, т.е. данное значение является равновесным. Оценка кинетических параметров полимеризации пропиленоксалата на данном этапе не входила в наши планы, однако необходимость ее подробного исследования стала очевидна в ходе данного этапа работы. Поэтому на следующем годичном этапе мы подробно исследуем кинетику полимеризации циклического пропиленоксалата в зависимости от концентрации катализатора. 2.2. MALDI-TOF-анализ фракций олигомеров и полимеров Для установления химической структуры концевых групп полученных полимеров использовали MALDI-TOF масс-спектрометрию. В спектрах реакционной смеси, полученных при полимеризации без добавления инициатора (Рис. 10), наблюдались две основные группы сигналов от компонентов, массы которых растут с шагом 130, соответствующим молекулярной массе пропиленоксалата. Первая серия состояла из интенсивных сигналов, соответствующих массам, кратным 130, с остатком 23 (Na+) или 39 (K+). Эти значения масс можно отнести к циклическим молекулам (Рис. 10, тип С). Их интенсивность резко снижалась с ростом степени полимеризации N. Сильное уменьшение концентрации молекул с ростом молекулярной массы указывает на то, что, скорее всего, эти соединения образуют олигомерную фракцию, обнаруживаемую эксклюзионной хроматографией. Механизм их образования показан на Рисунке 11а. В области более высоких молекулярных масс преобладает фракция 130n+76+23(39) линейных молекул с пропиленгликолевыми фрагментами (M = 76) на концах (Рис. 10, тип L). На Рисунке 11b показан предполагаемый механизм их образования за счет асимметрической межмолекулярной переэтерификации. 2.3. Анализ природы кристаллического осадка при полимеризации циклического пропиленоксалата и определение его количества. Как было сказано выше, особенностью полимеризации оксалата пропилена в присутствии Sn(Oct)2 является образование осадка. Он представлял собой белый кристаллический порошок, нерастворимый в органических растворителях, но растворимый в концентрированной HCl. Элементный анализ осадка показал, что его состав близок к составу оксалата олова, SnC2O4: доли H, C и Sn составляли 1,4±0,3, 11±3, 59±3 % (теория: 0, 11,6, 57,4 %). Природа выпадающего в ходе полимеризации белого осадка была также независимо подтверждена методами термогравиметрического анализа и рентгено-фазового анализа (Рис. 12). Количество образовавшегося в ходе полимеризации оксалата олова определяли с помощью иодометрического титрования, которое проверяли с помощью свежесинтезированного в лаборатории оксалата олова (II) (Рис. 13). Можно предположить, по меньшей мере четыре различных пути образования оксалата олова в ходе полимеризации пропиленоксалата в присутствии Sn(Oct)2 (Рис. 14). Однако полностью согласуется со всеми экспериментальными данными лишь механизм (d), предполагающий отщепление оксалатных остатков от конца цепи, сопровождающееся сдваиванием полимерных цепочек. 2.4. Полимеризация в присутствии добавленного инициатора. На следующем этапе мы изучили полимеризацию циклического оксалата в присутствии добавленного инициатора. В качестве инициатора полимеризации с циклических сложных эфиров могут выступать различные спирты, например, бензиловый спирт (BnOH). Этот инициатор может моделировать процессы, которые могут происходить в присутствии полимерного инициатора, например, монометоксиполиэтиленгликоля. Общеизвестно, что при полимеризации с раскрытием цикла в отсутствие посторонних нуклеофилов в системе и побочных процессов, влияющих на среднечисловую молекулярную массу полимера, она должна линейно возрастать с увеличением обратной концентрации инициатора. [2] Для исследования применимости этих закономерностей к полимеризации циклических оксалатов мы изучили зависимость Mn от концентрации бензилового спирта (Bn-OH), используемого в качестве инициатора. Как показано на Рисунке 15, степень полимеризации растет линейно с увеличением соотношения концентрации мономера к концентрации инициатора. Это указывает на возможность регуляции степени полимеризации полиоксалата концентрацией инициатора. По мере понижения концентрации добавленного инициатора молекулярная масса полимера асимптотически приближается к молекулярной массе, получающейстя в отсутствие добавленного инициатора. Анализ концевых групп полимеров, полученных в присутствии бензилового спирта методом масс-спектрометрии MALDI-TOF выявил 6 типов сигналов (Рис. 16а). Они соответствуют структурам, различающимся концевыми группами, которые представлены циклическими олигомерами без концевых групп и линейными макромолекулами, содержащими на каждом конце один из 3 остатков: пропиленгликолевый, бензильный или оксалатный (Рис. 16b). На Рис. 16в показано изменение интенсивности сигнала с увеличением степени полимеризации, N, в диапазоне от 5 до 10 звеньев. Анализ продуктов, полученных в ходе полимеризации, указывает на то, что полимеризация циклических оксалатов, катализируемая октаноатом олова, осложнена процессами переэтерификации, приводящими к уширению молекулярно-массового распределения и переносу концевых групп. В результате этих реакций происходит образование полностью стохастического распределения концевых групп. Можно предположить, что причиной столь значительного вклада процессов переэтерификации является высокая реакционная способность щавелевой кислоты, вызванная соседством двух карбоксильных групп в одной молекуле. Важным следствием данного результата являются существенные ограничения, налагаемые строением полиоксалатов, на возможности синтеза блок-сополимеров с полиоксалатным гидрофобным блоком. Действительно, если бы вместо бензилового спирта использовался бы полимер, содержащий концевую гидроксильную группу, например, монометокси-полиэтиленгликоль, в препарате содержалось бы около 50% двублочного полимера, около 10% трехблочного с двумя цепями ПЭГ по концам и около 40% продукта полимеризации представляло собой гомополимер. В дальнейшем мы покажем, что данные закономерности выполняются и при использовании полиэтиленоксида в качестве инициатора. Таким образом, данный пункт программы исследований, был не только выполнен, но и существенно перевыполнен. Действительно, мы не только показали возможность металлокомплексной полимеризации циклического пропиленоксалата, но и впервые обнаружили существенные особенности полимеризации данного мономера с раскрытием цикла, отличающих пропиленоксалат от других циклических сложных эфиров (лактида, капролактона, карбонатов, валеролактона и др.). Помимо этого, нами были впервые исследованы некоторые детали механизма полимеризации данного типа циклических сложных эфиров. В процессе полимеризации циклических оксалатов образуется достаточно большое количество (около 13%) циклических продуктов, выявляемых MALDI-TOF спектрометрией. Холя циклические продукты отмечались ранее и при полимеризации лактидов и карбонатов, их количество относительно линейного полимера обычно заметно меньше. Полимеризация циклического пропиленоксалата сопровождается выделением осадка оксалата олова. Его количество составляет около 60% от всего добавленного катализатора, поэтому эта реакция незначительно влияет на скорость полимеризации в присутствии избытка катализатора. Однако образование этого побочного продукта, по всей видимости, сопровождается сшиванием полимерных цепей по концам, содержащих оксалатные звенья. Исследование полимеризации в присутствии добавленного инициатора бензилового спирта показало, что полимеризация оксалатов осложняется переэтерификацией с участием свободных концевых групп. Эта переэтерификация, очевидно, катализируется октаноатом олова, поэтому при инициировании полимеризации бензиловым спиртом около половины цепей содержат бензильные остатки на концах цепи. Помимо сополимера, содержащего концевые группы бензилового спирта и пропиленгликоля, около 10% цепей содержат бензильные группы по обоим концам. Хотя переэтерификация сопровождает полимеризацию многих циклических сложных эфиров, ее интенсивность при синтезе циклических оксалатов значительно более выражена. 3. Синтез блок-сополимеров с монометоксиполиэтиленгликолем. Для получения блок-сополимеров в качестве инициатора был взят монометоксиполиэтиленоксид со среднечисловой молекулярной массой около 3.1кДа. При полимеризации мы учитывали, что мономер изначально содержит примесь гидролизованного мономера. Для оценки количества внутреннего инициатора мы использовали данные по предельной степени полимеризации пропиленоксалата в отсутствие добавленного инициатора. Для использованного препарата мономера она составляла 8000 г/моль. Тогда концентрация инициатора в мономере может быть рассчитана из соотношения С(Iint)=q*[M]0/Pn, где q – предельная конверсия мономера, Рn – предельная степень полимеризации полимера, полученного в данных условиях, а M0 – исходная концентрация мономера. Исходя из этого, концентрация внутреннего инициатора составляет примерно 0.15 М, что соответствует 1.3% гидролизованного мономера. Основываясь на этих данных, мы добавляли внешний инициатор ПЭГ5000 в концентрации, сопоставимой (образец №56, 30.8 мг мПЭГ+ 59.5 мг пропиленоксалата) и в три раза превышающей (№57, 58.4 мг пПЭГ + 31.9 мг пропиленоксалата) концентрацию внутреннего инициатора. После проведения полимеризации и отделения выпавшего оксалата олова мы исследовали получившиеся сополимеры с помощью ГПХ. (Рис. 17а) Оказалось, что в образце №56 среднечисловая молекулярная масса увеличилась до 4500 г/моль, а в случае большего избытка пропиленоксалата – до 5000 г/моль. Это соответствовало средней степени полимеризации полиоксалатного блока 12 и 15, соответственно. Дисперсности полученных препаратов были достаточно велики и составляли, соответственно, 1.7 и 1.62, что говорило о чрезвычайно широком молекулярно-массовом распределении данных образцов. Данные, полученные нами с использованием в качестве внешнего инициатора бензилового спирта, свидетельствуют о протекании переэтерификации с образованием гомополимера и трехблочных сополимеров, содержащих на обоих концах цепи две группы внешнего инициатора. Поскольку метод масс-спектрометрии, примененный нами для анализа гомополимеров с бензильными группами на концах цепи, затруднительно использовать для анализа блок-сополимеров, для анализа их однородности мы исследовали полученные препараты методом турбидиметрического титрования. Для получения блок-сополимеров мы предприняли попытку провести препаративное выделение блок-сополимера. Для этого к 50 мг сополимера №57 в 10 мл ТГФ было добавлено 0.26 объемных долей DBE и раствор был отцентрифугирован при 6000хg для отделения выпавшего гомополимера. Надосадочную жидкость и осадок высушили от DBE и проанализирволали с помощью эксклюзионной хроатографии. Оказалось, что оба образца содержали как гомополимер, так блок-сополимеры, т.е. фракционное осаждение не позволило очистить блок-сополимер от примеси гомополимера. (Рис. 17b) Очевидно, что неудача в синтезе блок-сополимеров связана с не только с высокой скоростью переэтерификации, но в основном, с наличием примерсей гидролизованного оксалата в составе циклического мономера. Столкнувшись с этой проблемой, мы поставили задачу очистить исходный мономер от примеси гидролизованного оксалата. Как показано выше, (Рис. 4) повторные перегонки не позволяют снизить содержание примесей до уровня менее 0.8%. Поэтому мы исследовали возможность удаления следов нуклеофилов из препарата мономера с помощью их модификации электрофильными реагентами. На первом этапе мы исследовали возможность решения этой проблемы с помощью бензоилхлорида, полагая, что данный хлорангидрид будет эффективно взаимодействовать с гидроксильными группами, и впоследствии нам удастся удалить его избыток и продукты его взаимодействия с гидролизованным мономером при перегонке. Оказалось, что, данную реакцию необходимо проводить в присутствии основания (пиридин или карбонат калия), добавление которых приводит к дополнительному гидролизу мономера, т.е. в результате такого воздействия качество мономера ухудшалось. Анализ литературы по реакциям гидроксильных групп с различными электрофилами натолкнул нас на мысль об использовании изоцианатов. Реакция изоцианатов со спиртами является реакцией присоединения, т.е. она не сопровождается выделением кислот. При этом данная реакция не требует добавления никаких дополнительных реагентов в препарат мономера. Мы предположили, что было бы удобно присоединить изоцианатные группы к твердому носителю и попытаться экстрагировать нуклеофильные примеси из мономера. Для этого мы использовали силикагель с присоединенными аминогруппами (Диасорб-амин, Биохиммак-СТ). Носитель модифицировали большим избытком толуол-диизоцианата, отмывали носитель от избытка диизоцианата тщательно обезвоженным хлористым метиленом (1.5 л на 20 г носителя) и опреляли емкость носителя с помощью реакции с цианобифенилом, содержащим гидрокси-нонильный заместитель. Оказалось, что, несмотря на то, что толуол-диизоцианат проявлялся в ИК-спектрах модифицированного носителя, ковалентное присоединение индикатора происходило с эффективностью, не превышающей 10% от содержащихся на носителе изоцианатных групп. Анализ литературы по кинетике реакций между изоцианатами и спиртами показал, что данная реакция эффективно протекает лишь в концентрированных растворах, а при миллимолярной концентрации реагентов реакция протекает очень медленно. Поскольку присоединение активных групп на твердый сорбент равносильно минимум 10-кратному разбавлению системы, данный подход пришлось признать нереальным для препаративного отделения мономера от небольших количеств примесей. Более высокая концентрация реагентов достижима при добавлении изоцианатов напрямую в неразбавленный мономер с последующей перегонкой. Для реализации этого подхода мы добавили к мономеру 10% (мол. избыток) бутилизоцианата и выдерживали реакционную смесь при 70оС в течение суток. Оказалось, что после перегонки этого мономера и его полимеризации в стандартных условиях (Sn(Oct)2/M0=1:100, 100оС, 24 час) среднечисловая молекулярная масса возросла в 1.5 раза (от 8кДа до 13 кДа). Данный результат указывает на принципиальную применимость данного подхода, однако очевидно, что он требует дальнейшей отработки. Таким образом, на данном годичном этапе нам не удалось получить свободные от гомополимеров препараты блок-сополимеров пропиленоксалата и ПЭГ, однако подробное исследование механизма реакции и отработка методик очистки мономера дает надежду, что за следующий годичный этап нам удастся получить блок-сополимеры и исследовать свойства их мицелл в водных растворах. 4. Синтез блок-сополимеров D,L-лактида и L-лактида и полиэтиленгликоля различных составов. В отчетный период были синтезированы две серии блок-сополимеров PLA-mPEG, различающихся оптической чистотой мономерного лактида. Для синтеза обоих серий был использован монометоксиполиэтиленгликоль со средней степенью полимеризации 87. Лактид непосредственно перед полимеризацией очищали сублимацией и хранили в эксикаторе над щелочью, а монометоксиполиэтиленгликоль осушали азеотропной отгонкой с безводным бензолом. Полимеризацию лактида под действием Sn(Oct)2 проводили в инертной атмосфере, удаляя следы кислорода и воды из препарата лактида в глубоком вакууме при температуре выше температуры плавления мономера, (130оС для L-лактида и 160 оС - для рацемата Степень полимеризации лактидного блока варьировала от 5-10 до 60-80, а полиэтиленоксидный блок состоял из около 90 звеньев. Молекулярно-массовые характеристики блок-сополимеров и их состав показаны в Таблице 1. Валовый состав блок-сополимеров определяли с помощью 1H-ЯМР спектроскопии. ЯМР спектры, соответствующие сополимеру PLLA36-mPEG87 и L-лактида, приведены на Рис. 18. На спектрах видно, что в результате полимеризации сигнал метинового протона во фрагменте молочной кислоты сдвигается в слабое поле (5.06 → 5.16 м. д.), а сигнал метиловых протонов сдвигается в сильное поле (1.66 → 1.58 м. д.), что согласуется с данными литературы [3, 4]. Кроме того, на спектре появляются сигналы, соответствующие протонам полиэтиленгликоля (3.38 м. д. и 3.64 м. д.). Из соотношения интегралов протонов разных блоков, зная молекулярную массу mPEG, можно определить среднечисловую молекулярную массу сополимеров (Таблица 1 в файле с дополнительной информацией), считая, что распределение образцов по массам унимодальное. Анализ молекулярно-массового распределения блок-сополимеров (Рис. 19) показал, что среднечисловая молекулярная масса блок-сополимеров увеличивалась с увеличением содержания лактида в полимеризационной смеси. При этом величина дисперсности полимеров варьировала между 1.4 до 1.8, указывая на то, что в процессе полимеризации, помимо блок-сополимера, может образоваться также и гомополимер, что может быть вызвано недостаточным высушивание полиэтиленоксида. В то же время, анализ хроматограмм не выявил присутствия существенных количеств гомополимера, что дает озможность не учитывать эту возможность в дальнейшей работе. Данные сополимеры были использованы далее для изучения свойств мицелл блок-сополимеров, исследования их цитотоксичности и упаковки в них гидрофобных оксалатов. 5. Сравнение размеров мицелл PDLLA-mPEG и PLLA-mPEG Водные дисперсии блок-сополимеров готовили методом нанопреципитации полимера разбавлением его концентрированного раствора в ТГФ водой при интенсивном перемешивании. Концентрация ТГФ в конечном растворе сополимеров не превышала 10%. Размеры мицелл блок-сополимеров полиэтиленгликоля, содержащих в качестве гидрофобного блока полилактид и полипропиленоксалат, исследовали методом динамического светорассеяния при концентрации полимеров от 0.7 до 7 мг/мл. Оказалось, что для всех сополимеров, содержащих в гидрофобном блоке полилактид, наблюдалось бимодальное распределение по размерам, причем быстрая мода отвечала частицам со средним гидродинамическим диаметром около 30 нм, а медленная мода отвечала на порядок более крупным частицам (Рис. 20). Содержание крупных частиц в полимерных дисперсиях не превышало нескольких процентов по объему. Размеры мицелл блок-сополимеров на основе оптически чистого L-лактида и его рацемата были близки. При этом с размер частиц слабо менялся с увеличением массовой доли полилактида в составе сополимера. Полученные результаты хорошо согласуются ранее опубликованными данными об образовании агрегатов мицелл блок-сополимеров лактида и этиленгликоля в разбавленных водных дисперсиях. Блок-сополимеры пропиленоксалата и этиленгликоля образовали значительно более крупные частицы, что указывает на наличие в их составе гомополимера. На следующем годичном этапе работы этот же подход будет использован для более подробного исследования размеров мицелл блок-сополимеров пропиленоксалата и этиленгликоля. 6. Исследование гидролитической стабильности амфифильных блок-сополимров ПЭГ и молочной кислоты Поскольку за истекший годичный этап нам не удалось наработать большие количества блок-сополимеров пропиленоксалата и этиленоксида, мы исследовали стабильность блок-сополимеров лактида и этиленоксида в водной дисперсии и сравнили полученные константы скорости с известными из литературы данными о скорости гидролиза полилактида в массе [5]. Согласно этим данным, скорость гидролиза гомополимера полилактида, определяемая по снижению молекулярной массы полимера (изначально, 10000 г/моль), взятого в виде твердой пленки, составляет 5 г/моль/день, что соответствует константе скорости гидролиза около 0.35×10-6 мин-1 при рН 7.4. Это соответствует снижению молекулярной массы в е раз за 5.5 лет. За гидролизом полилактидного блока следили с помощью рН-стата. Прибор автоматически поддерживает рН раствора в ячейке добавлением щелочи, а скорость гидролиза определяется по скорости добавления титрованного раствора NaOH (Рис. 21а). Оказалось, что константа скорости гидролиза полилактида уменьшается с понижением рН и по порядку величины близка к константе скрости гомополимера лактида в пленке. Наблюдаемые различия (гидролиз блок-сополимера в водной дисперсии примерно в 5 раз быстрее, чем гидролиз гомополимера в пленке), по всей видимости, вызваны снятием диффузионных ограничений при переходе от гетерогенной к микрогетерогенной системе. Таким образом за отчетный период в научном коллективе был налажен способ слежения за скоростью гидролиза имфифильных блок-полиэфиров и получены данные оскорости гидролиза амфифильных блок-сополимеров лактида и этиленоксида. Полученные данные о скорости гидролиза рацемического лактида и ПЭГ близки по порядку величины к данным о скорости гидролиза полилактидной пленки при данном рН. 7. Цитотоксичность блок-сополимеров лактида и этиленоксида Цитотоксичность исследовали на клетках аденокарциномы молочной железы человека, проявляющих устойчивость ко многим лекарствам и трудно поддающихся лечению. Для этой линии клеток характерен измененный метаболизм АФК, связанный с устойчивостью этих клеток к большинству химиотерапевтических лекарств []. Поскольку цель данной части проекта состоит в проведении пероксиоксалатной реакции в живых клетках, необходимо было использовать полимеры компоненты этой реакции в нетоксичной концентрации. Поэтому мы исследовали цитотоксичность блок-сополимеров лактида и этиленоксида. Все опыты по цитотоксичности ставили однотипно: исследуемый образец растворяли в ТГФ, добавляли бессывороточную культуральную среду, перемешивали и последовательные двукратные разведения образца в культуральной среде добавляли к клеткам. Максимальная нетоксичная концентрация тетрагидрофурана была исследована отдельно и составила 3.4% (об.). (Рис. 22) Анализ цитотоксичности трех блок-сополимеров на основе D,L-лактида разного состава показал, что IC50 блок-сополимеров, содержавших 5 (PDLLA5-mPEG87), 18 (PDLLA18-mPEG87) и 28 (PDLLA28-mPEG87) звена D,L- лактида составляла в среднем (4.6±0.17) мг/мл (Рис. 23). Сходные результаты были получены и для оптически активных блок-сополимеров PLLA-PEG (Рис. 24). Таким образом мы не обнаружили собственной цитотоксичности блок-сополимеров лактида и этиленгликоля. 8. Влияние блок-сополимеров лактида и этиленоксида на устойчивость раковых клеток к действию противоопухолевого антибиотика доксорубицина Известно, что некоторые амфифильные блок-сополимеры способны подавлять активность мембранных белков, в частности, транспортеров, обусловливающих выброс лекарств из раковых клеток. Более 20 лет назад мы показали, что наибольшей активностью в этом отношении обладают сополимеры, имеющие в качестве гидрофобного блока полимерные простые эфиры - полипропиленоксид [7] или полидиметилсилоксан [8]. Способность полимерных сложных эфиров ранее почти не исследовалась. Между тем, существенным преимущество сложных полиэфиров перед простыми является их способность гидролизоваться под действием эстераз сыворотки крови, а также ферментами лизосом раковых клеток. Поскольку на данногм годичном этапе нам не удалось получить чистые блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксалата, было принято решение перенести некоторые планируемые на второй годичный этап работы выполнить в текущем году. Поэтому на текущем годичном этапе мы исследовали способность блок-сополимеров лактида и этиленоксида влиять на цитотоксичность доксорубицина по отношению к раковым клеткам NCI/ADR-RES. Все блок-сополимеры добавляли к клеткам в заведомо нетоксичной концентрации 0.5 мг/мл. Оказалось, что блок-сополимеры, содержащие короткие полилактидные блоки практически не влияли на цитотоксичность доксорубицина (Рис. 25, кривые 1-3). Однако блок-сополимер, содержащий 61 звено молочной кислоты, уменьшал цитотоксическую концентрацию доксорубицина более, чем на порядок. Это означает, что данный сополимер, блокировал активность мембранного насоса в этих клетках. На следующем годичном этапе данные исследования будут продолжены, учитывая большую практическую и фундаментальную значимость этого результата. 9. Синтез бис-(N-бензоил-L-тирозин этиловый эфир)оксалата и исследование его свойств. Блок-сополимеры пропиленоксалата и этиленгликоля являются перспективными носителями для ароматических оксалатов, которые востребованных в хемоиндуцированной фотодинамической терапии. Однако оксалаты могут проявлять собственную токсичность. В настоящей работе мы предлагаем в качестве такого малотоксичного производного тирозина N-бензоил-L-тирозин этиловый эфир (BTEE), который сшивали оксалилхлоридом в смеси ТГФ/пиридин (Рис. 26a). Чтобы избежать образования моноэфира щавелевой кислоты, оксалилхлооид добавляли маленькими порциями к избытку ВТЕЕ. В процессе выделения и очистки ВТЕЕ-оксалата мы избегали хроматографии, поскольку силикагель или вода способствуют быстрому гидролизу оксалатов.[9] Продукт сшивания анализировали 1H-ЯМР спектроскопией. Сигнал при 6.53 м.д., соответствующий фенольному гидроксилу в исходном BTEE (Рис. 26b), исчезает в спектре оксалата, что указывает на количественное образование оксалата и отсутствие примеси моноэфира щавелевой кислоты в препарате. (Рис. 26c). Чтобы оценить его применимость для биологических экспериментов на клетках в культуре, мы сравнили цитотоксичность BTEE-ox и коммерчески доступного бис(2,4,5-трихлоро-6-(пентилоксикарбонил) фенил оксалата (CPPO). Для этого BTEE-ox и CPPO были солюбилизованы в мицеллах PLLA61-mPEG87 и исследованы на клетках рака яичников NCI-ADR/RES. В отсутствие оксалатов мицеллы PLLA61-mPEG87 не были токсичны для клеток до 2,2 мг/мл (Рис. 28, кривая 1). Их цитотоксичность значительно возрастала при загрузке оксалатами (Рис. 28, кривые 2 и 3). Количество выживших клеток снижалось до 50% (IC50) после инкубации с 0,055 ± 0,005 мМ CPPO (Рис. 28, кривая 3). Для получения такого же эффекта требовалась в 3 раза большая концентрация BTEE-ox (IC50 = 0,155 ± 0,032 мМ). Это означает, что BTEE-ox на основе природной аминокислоты L-тирозина был в 3 раза менее токсичен, чем CPPO для клеток в культуре. 10. Загрузка ВТЕЕ-оксалата в мицеллы блок-сополимера лактида и этиленоксида. Ранее мы показали, что помещение оксалатов в мицеллы плюроника и сополимеров диметилсилоксана и полиэтиленгликоля (ПЭГ) может значительно замедлить гидролиз и тем самым повысить эффективность хемилюминесценции. В настоящей работе мы использовали аналогичный подход, поместив BTEE-ox в мицеллы блок-сополимеров полиэтиленоксида и поли(L-молочной кислоты) (PLLA-PEG) для защиты оксалата от гидролиза. Гидрофобное ядро таких мицелл гораздо менее гидратировано, чем у плюроников, и имеет кристаллическую структуру, что может дополнительно способствовать защите BTEE-оксалата и повышении эффективности пероксиоксалатной хемилюминесцентной реакции (Рис. 28). При растворении блок-сополимера PLLA61-PEG87 в ТГФ и впрыскивании его в большой объем водного буфера (10 мM Na2HPO4, 150 мM NaCl, pH 7.4) образовывались мицеллы со средним гидродинамическим диаметром 35  15 nm. Для того, чтобы ввести компоненты ПО-реакции в эти мицеллы оксалат и перилен прибавляли к раствору полимера в ТГФ и смесь впрыскивали в водный буфер. Излучение света за счёт ПО-реакции регистрировали после впрыскивания пероксида водорода в водном буфере. Оказалось, что введение BTEE-ox в мицеллы блок-сополимера PLLA-PEG приводило к длительному излучению света за счёт ПО-реакции между ВТЕЕ-оксалатом и Н2О2 в мицеллах блок-сополимеров (Рис. 29, сравните кривые 1 и 2). Таким образом, новый субстрат ПО-реакции, синтезированный на основе природной аминокислоты L-тирозина, оказывается менее токсичным для клеток в культуре, чем коммерчески доступный СРРО, полученный из синтетического фенола. 1. Iida T. et al. 1993, 49(46), 10511-10530. 2. Slomkowski S. et al. Polylactides—an overview. Polym. Adv. Technol. 2014, 25 436–447. 3. Kricheldorf H.R. et al. Macromolecules 1988, 21, 2, 286–293. 4. Sedush N.G. et al.. Polym. Sci. Ser. B. 2014, 56, 35–40. 5. Tsuji H. et al.Biomaterials 25 (2004) 5449–5455. 6. Osbild S.et al. Anticancer Res. 2006. 26. 5 A. 3595–3600. 7. Demina T.V. et al. Biomacromolecules 2014, 15, 7, 2672-2681 8. Pavlov, D.N. et al. Polym. Sci. Ser. A 51, 295–301 (2009). 9. Itaya, T. et al. Chem. Pharm. Bull., 2002, 50, 346.
2 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Полимеризация циклических оксалатов: синтез и свойства амфифильных блок-полиоксалатов
Результаты этапа: 1. Исследование кинетики полимеризации ПГО. Изучение зависимости скорости полимеризации от соотношения концентраций октаноата олова и мономера Ранее в предыдущем отчете мы показали, что в процессе полимеризации пропиленгликольоксалата (ПГО) образуется две фракции полимера, различающиеся по молекулярной массе, одна из которых представлена циклическими олигомерами, состоящими из 3-6 звеньев, а другая является линейными макромолекулами, степень полимеризации которых увеличивается с конверсией, и в отсутствие добавленного инициатора достигает 70-100 звеньев. В ходе текущего годового этапа мы исследовали кинетику полимеризации ПГО при катализе октаноатом олова(II). Расходование мономера отвечало кинетике первому порядка вплоть до предельной конверсии. В отчете за прошлый год мы показали, что в процессе полимеризации часть катализатора Sn(II) расходуется с образованием окcалата олова SnC2O4. В отчетном году мы обнаружили, что скорость полимеризации значительно превосходит скорость накопления SnC2O4, и лишь 10% катализатора превращается в оксалат при конверсии 90%. Поэтому образование полимера и осадка SnC2O4 разнесены во времени и образование оксалата олова из октаноата олова является побочным процессом, а не является одной из стадий процесса катализа. Несмотря на то, что лишь незначительная часть октаноата олова превращается в оксалат олова за 40 минут полимеризации образовывается полимер, который уже имеет дисперсность около 2 при молекулярной массе 9900 г/моль. Это означает, что обазование SnC2O4 является не единственной причиной уширения молекулярно-массового распределения. Показано, что концентрация неизрасходованного мономера приближалась к равновесному уровню в течение 40 мин. Тем не менее, оказалось, что через 23 ч среднечисловая молекулярная масса полимера увеличивается с 9 900 до 10 900. Такое укрупнение полимера может быть следствием сшивания цепей, опосредованного Sn(Oct)2, сопровождающегося образованием SnC2O4. Действительно, значительное накопление SnC2O4 происходило после достижения полимеризационного равновесия. Таким образом, эти результаты подтверждают наше предположение об образовании SnC2O4 в результате сшивания цепей. В отличие от SnC2O4, олигомеры образовывались с самого начала полимеризации. Образец, выделенный только при 20 %-ной степени конверсии, содержал значительное количество олигомеров, о чем можно судить по спектру ЯМР. Общее количество олигомеров увеличивалось в ходе полимеризации, достигая плато при концентрации около 10 % (мас.). Наличие этого плато указывает на равные скорости образования олигомеров в результате внутримолекулярной переэтерификации, и их расходования в результате присоединения к растущим полимерным цепям. Это равновесие достигалось при степени конверсии мономера 40-50 %, что указывает на быструю внутримолекулярную переэтерификацию. Концентрация катализатора определяла скорость полимеризации пропилноксалата. Линеаризация кинетических кривых в координатах первого порядка продемонстрировала, что полимеризация ПГО подчиняется первому порядку. Это означает, что количество активных центров не меняется в ходе всегопроцесса даже при низких концентрациях катализатора. Постоянство количества активных центров является типичным для полимеризации циклических эфиров или эпоксидов с раскрытием цикла. Наблюдаемая константа скорости первого порядка линейно увеличивалась с ростом концентрации катализатора в интервале от 0.2 to 0.65% (мол.). Три этом частота оборотов катализатора (turnover frequency – TOF) октаноата олова в полимеризации пропиленоксалата 1000 ± 250 моль мономера∙моль(Sn)-1∙час-1, указывая на то, что октаноат олова проявляет умеренную эффективность катализа. Тем не менее, мы наблюдали, что полимеризация ПГО протекает при достаточно низкой концентрации Sn(Oct)2. Эти результаты представляются важными для потенциальной перспективы биомедицинского применения PPOx [1, 2.]. Однако олово токсично для человека. При уровнях, превышающих 250 мг на кг потребляемой пищи, олово вызывает снижение содержания железа в эритроцитах [3]. Учитывая это, мы определили количество олова в образцах полимеров с помощью метода атомно-абсорбционной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (ICP AES). Оказалось, что полимеры, очищенные методом трехкратного переосаждения в смесь диэтиловый эфир/ТГФ (1:1), содержат 670 ± 49 мг олова на кг полимера. Учитывая, что лекарственные носители обычно вводятся в виде водной 1-5% дисперсии, содержание олова в таком препарате будет составлять ≤ 33 м.д., что практически безопасно. Средняя дисперсность полимеров для высоких степеней конверсии (α > 90%) составила около 2 независимо от содержания катализатора. Содержание олигомеров не зависело от концентрации катализатора. Mn полимера постепенно снижалась с уменьшением содержания катализатора, что подтверждает индуцированное SnC2O4 сшивание концевых групп. Оценка Mn полимеров, полученных при умеренных степенях конверсии, путем вычитания сигнала олигомера была невозможна из-за сильного перекрытия полимерной и олигомерной мод. Поэтому нам не удалось получить зависимость Mn линейного полимера от конверсии мономера. В то же время фракционирование полимеризационной смеси, содержащей усеченный PPOx, привело к значительному сдвигу MWD полимера в сторону более высоких молекулярных масс. Наиболее вероятная масса полимера Mp может быть использована для отслеживания роста полимера в процессе полимеризации в качестве однозначно определяемого экспериментального параметра. Она постепенно увеличивалась с ростом конверсии (Рис. 3). Отклонение от теоретически ожидаемой линейной зависимости может быть связано либо с изменением MWD, либо с изменением содержания олигомеров по мере конверсии. Тем не менее, полученные данные свидетельствуют о том, что полимеризация ПГО подчиняется основным закономерностям ROP, известным для других циклических эфиров. Уширение MWD может быть либо неотъемлемым свойством полимеризации ПГО, либо результатом действия катализатора. Чтобы провести различие между этими двумя возможностями, мы изучили полимеризацию ПГО в отсутствие катализатора при 100 оС. В этом случае реакция достигла конверсии около 85 % за 25 дней, что примерно в 2 000 раз дольше, чем полимеризация в присутствии 0.65 % (мас.) Sn(Oct)2. Полученный таким образом полимер характеризовался сравнительно низкой Mn = 6800 г·моль-1 при Ɖ ~ 2 и содержал около 4% олигомеров. Как и ожидалось, полимеризация с раскрытием цикла в отсутствие катализатора приводила к продуктам с Mn значительно меньшим, чем полученные в присутствии Sn(Oct)2, который вызывает сшивание концевых групп. Полимеры, образующиеся в процессе полимеризации с раскрытием цикла в присутствии Sn(Oct)2 и в отсутствие катализатора характеризовались сходными молекулярно-массовыми распределениями, что указывает на то, что октаноат олова ускоряет полимеризацию, но сам лишь незначительно уширяет молекулярно-массовое распределение за счет реакции сшивания цепей. 2. Разработка способов глубокой очистки мономера от примеси пропиленгликоль монооксалатов: варьирование условий вакуумной перегонки и/или предобработка мономера бутилизоцианатом Ограничение полимеризации по молекулярной массе продукта может быть следствием различных причин, в том числе (1) инициирование за счет реакцией катализатора с мономером; (2) расщеплением цепей под действием катализатора или температуры с образованием новых концевых групп, инициирующих полимеризацию, и (3) наличием в мономере остаточных количеств гидролизованного мономера, которые могут инициировать полимеризацию. В последнем случае количество полимерных цепей в отсутствие добавленного инициатора должно равняться количеству нуклеофильных примесей. Наличие нуклеофильных примесей, точнее монооксалатов этиленгликоля, может сильно препятствовать получению блок-сополимеров. Действительно, учитывая, что массы мономера (М.в. 130 г/моль) и полиэтиленоксида (М.в. 5000 г/моль), выступающего в качестве инициатора полимеризации с раскрытием цикла, различаются в 38 раз, содержание всего 2.6% примесного нуклеофила в составе мономерного препарата может привести к образованию равных количеств гомополимера полиПГО и блок-сополимера. Чтобы избежать образования значительных количеств гомополимера мы поставили задачу очистить мономер от нуклеофильных примесей. Особенность ПГО состоит в том, что, будучи жидким при комнатной температуре, он характеризуется значительной вязкостью, сопоставимой с глицерином. Поэтому при его очистке с помощью перегонки в вакууме значительные количества вещества остаются в дефлегматоре, алонже и соединительных трубках. В ранее опубликованной работе Iida с соавт. [4] ПГО очищали в вакууме с помощью установки Kügelrohr, которая вообще не позволяет проводить фракционирование и предназначена для очистки небольших количеств вещества. Анализ мономера, очищенного с помощью последовательных перегонок в вакууме с помощью 1H ЯМР показал закономерное уменьшение сигналов примесей при 4.9 и 5.15 м.д., которые соответствуют монооксалатам этиленгликоля по 1 и 2 гидроксилу, соответственно (Рис. 6). На рисунке показаны спектры препаратов, полученных в результате 1, 2, 3 и четырех перегонок, причем сравнивались образцы, отгоняющиеся в конце каждой перегонки при 115-130 оС после удления относительно легкокипящих фракций. Таким образом, анализ фракций, полученных путем последовательных перегонок ПГО с помощью ЯМР спектроскопии, показывает возможность очень существенно очистить препарат от примесей монооксалатов пропиленгликоля. Очевидно, что для этого целесообразно использовать длинный дефлегматор, обеспечивающий последовательное обогащение конденсата высококипящим компонентом. Однако, учитывая высокую вязкость ПГО, для проведения вакуумных перегонок с длинным дефлегматором или колонкой, необходимо, чтобы объем куба значительно превышал объем дефлегматора. Для этого необходимо резко (в 4-10 раз увеличить масштабы синтеза ПГО). Этому мешает высокая стоимость и ограниченная доступность оксалилхлорида, поэтому в рамках проекта мы вначале решили исследовать возможность его замены на более доступные щавелевую кислоту или диметилоксалат. Для исследования возможности использования прямой конденсации щавелевой кислоты с пропиленгликолем эквимольные количества пропиленгликоля (65.8 мл, 0.89 моль) и кристаллов двуводной щавелевой кислоты (112.7 г, 0.89 моль) смешивали с большим количеством (550 мл) бензола и 3.04 г (0.017 моль) п-толуолсульфокислоты в трехгорлой колбе и кипятили с насадкой Дина-Старка, регистрируя объем отслаивающейся в насадке воды. Нагревание продолжали в течение 2-3 час. В течение этого времени выделялось около ~60-70% воды от максимально возможного количества. После этого смесь охлаждали, упаривали бензол, и остаток деполимеризоали при нагревании в вакууме, отгоняя ПГО. Оказалось, что в ходе реакции образуется значительное количество муравьиной кислоты и ее эфиров. При нагревании реакционной смеси эфиры разлагаются с выделением углекислоты, которая конденсируется в ловушке вакуумной установки и заполняет ее, повышая давление в установке. Этот побочный процесс препятствовал проведению деполимеризации олигомерных оксалатов, что не дало возможность выделить ПГО вакуумной перегонкой. Наличие формиатов в олигомерном продукте, полученном в результате конденсации пропиленгликоля и щавелевой кислоты, было подтверждено методом 1Н ЯМР. Из литературы известно, что щавелевая кислота и ее полуэфиры чрезвычайно склонны к декарбоксилированию при температуре выше 90оС с образованием формиатов [5]. Поэтому данный способ синтеза мы признали неприменимым для получения больших количеств очищенного оксалата. Основываясь на данных А.Ф. Алксниса, мы предположили, что проведение аналогичной реакции с участием диметилоксалата позволит более гладко провести конденсацию с пропиленгликолем. При этой реакции выделяется метанол, удаление которого можно проводить при более низкой температуре, если использовать его способность образовывать азеотроп с гексаном, кипящий при 60 оС и содержащий около 30% метанола. [6, 7] Для синтеза диметилоксалата использовали методику [8], предполагающую этерификацию щавелевой кислоты метанолом в присутствии серной кислоты с последующей перекристаллизацией диметилоксалата из метанола. В дальнейшем, 106.2 г диметилоксалата (0.9 моль), 68.5 г пропиленгликоля (66 мл, 0.9 моль) и 3.1 г п-толуолсульфокислоты смешивли с 550 мл гексана и нагревали с обратным холодильником, собирая отогнанный аазеотроп гексан/метанол в насадку Дина-Старка. Реакцию проводили в течение около 12 час, что соответствовало конверсии около 70%. После исследования продукта поликонденсации методом ЯМР оказалось, что в системе образовалось около 15 % формиатных групп. Поскольку образование такого количества формиатов препятствует деполимеризации олигомеров при повышенной температуре и данный синтез был остановлен и метод переатерификации для получения больших количеств ПГО был признан непригодным. Таким образом, мы обнаружили, что любые методы получения ПГО, требующие нагревания пропиленгликоля и производных щавелевой кислоты приводят к частичному декарбоксилированию щавелевой кислоты с образованием формиатов. Это не только понижает выход целевого продукта, но и делает невозхможной его выделение вследствие разложения формиатов при нагревании выше 100 оС в процессе деполимеризации олигомерного продукта поликонденсации и последующей перегонки ПГО. Этот результат хорошо согласуется с данными работы [5], в которой было продемонстрировано, что нагревание полуафиров щавелевой кислоты с гликолями, содержащими вторичные или третичные гидроксильные группы приводит к образованию большого количества формиатов в результате декарбоксилирования полуэфиров щавелевой кислоты. При этом эфиры этиленгликоля и щавелевой кислоты легко образуют циклические оксалаты при нагревании, однако перенесение этих методик на пропиленгликоль, по всей видимости, невозможно. Поэтому для получения больших количеств ПГО мы масштабировали использованную нами ранее методику синтеза с использованием оксалилхлорида и пропиленгликоля в присутствии пиридина в качестве акцептора хлороводорода. Синтез проводили в три приема, в каждом из которых объем реакционной смеси составлял около 1 л. В результате было получено 113 г, что соответствовало суммарному выходу трех синтезов 68%. Данный препарат был подвергнут вакуумной перегонке с получением 3 фракций, масса которых составила соответственно 10.4, 8.6 и 75.1 г. Для анализа содержания примесей в составе полученных препаратов мы использовали адсорбционную ВЭЖХ на колонке Si100 polyol (Serva, Германия) при изократической элюции смесью ТГФ/гексан 1:1 с использованием УФ-детектора. В этой системе примеси элюировались немного раньше основного мономерного пика, что не удивительно, учитывая, что менее полярные соединения удерживаются на данном носителе сильнее, чем более полярные при использовании малополярной подвижной фазы. [9] Можно предположить, что именно моноэфиры этиленгликоля являются примесями, элюирующимися с колонки перед основным пиком ТГФ, присутствующий в элюенте, ослабляет взаимодействия с полярной матрицей носителя, в результате чего более полярные монооксалаты этиленгликоля смываются с колонки раньше, чем менее полярный циклический мономер. Полагая, что оптическое поглощение ПГО и монооксалатов пропиленгликоля в дальнем УФ в основном определяется карбонильными группами остатков щавелевой кислоты, можно предположить, что коэффициенты экстинкции ПГО и его гидролизованных производных практически одинаковы. Тогда из соотношения оптических плотностей при 225 нм можно оценить соотношение количеств примесей и циклического ПГО в препарате. Оказалось, что в процессе перегонки вначале отгоняются примеси и их содержание в дистилляте уменьшается по мере перегонки. Содержание монооксалатов пропиленгликоля уменьшалось в ходе перегонки и в третьей фракции составляло менее 0.5%. Таким образом, в результате разработанной нами методики очистки мономера был получен препарат, содержащий около 0.5% нуклеофильных примерей, что в несколько раз меньше, чем в препаратах, получаемых нами ранее. Это дает возможность получать блок-сополимеры ПГО и этиленгликоля с заметно более длинным гидрофобным блоком. 3. Синтез блок-сополимеров полиэтиленоксида и ПГО: разработка методики получения блок-сополимеров и/или разработка способов фракционного осаждения блок-сополимеров Блок-сополимеры ПГО и этиленгликоля получали, используя монометоксиэтиленоксид в качестве инициатора полимеризации с раскрытием цикла. В работе использовали узкодисперсный препарат монометокси-полиэтиленгликоля (mPEG) со средней степенью полимеризации около 90. Его молекулярно-массовые характеристики, определенные независимо п, показаны в таблице 1. Поскольку следы влаги могут вступать в качестве инициатора полимеризации, гигроскопичный мПЭГ тщательно осушали с помощью азеотропной отгонки с безводным бензолом, после чего необходимое количество мПЭГ в двугорлой колбе смешивали с ПГОом и подвергали тщательному дегазированию в глубоком вакууме при 50 оС для удаления из раствора следов влаги и кислорода. Затем в реакционную смесь вносили раствор октаноата олова в б/в ТГФ в количестве 0.15% (мол.) и проводили полимеризацию в течение 1-2 час при 100 оС до конверсии 60-80%. Следует обратить внимание, что концентрацию катализатора в данной серии экспериментов брали вдвое более низкую, чем в экспериментах по исследованию кинетики полимеризации. Это вызвано желанием уменьшить побочные процессы переэтерификации, которые были подробно описаны в отчете за 2023 год. Поскольку как переэтерификация, так и полимеризация ускоряются катализатором, процессы переэтерификации способствуют перераспределению mPEG между молекулами диблок-сополимера с образованием триблок-сополимеров (mPEG-ППГО-mPEG) и гомополимеров ППГО. Массовое соотношение мономера и полиэтиленгликоля в реакционной смеси варьировали от 0.52 до 1.8. Молекулярно-массовые характеристики блок-сополимеров представлены в Таблице 1. Интересно, что определенная гельпроникающей хроматографией молекулярная масса блок-сополимера, полученного в присутствии избытка mPEG по массе, была даже немного меньше массы исходного полиэтиленгликоля, однако ширина молекулярно-массового распределения этого препарата существенно превосходила таковую для исходного mPEG. (Таблица 1). Наиболее вероятно, это может быть следствием того, что при синтезе данного образца нам не удалось достаточно полно удалить влагу из препарата полиэтиленгликоля, вследствие чего в процессе синтеза образовалось значительное количество цепей гомополимера, инициированных гидролизованным мономером. Их молекулярная масса при этом заметно меньше исходного ПЭГ. Таблица 1. Молекулярно-массовые характеристики блок-сополимеров мПЭГ и ПГО. Блок- ПГО , г Pn(ПГО), Mw Mn Ð сополимер mPEG г г/моль (ЯМР) mPEG 0 0 4188 3896 1.07 mPEG-P1 0.52 7 3700 3275 1.13 mPEG-P2 1 14 6700 8265 1.23 mPEG-P3 1.8 28 6900 8953 1.29 Два сополимера, полученных при массовом соотношении ПГО/mPEG 1 и 1.8 практически не содержали фракций с массами меньше свободного ПЭГ. При этом в обоих препаратах отсутствовала мода равная по массе исходному mPEG. Таким образом, mPEG полностью включался в состав блок-сополимера. Это хорошо согласуется с выводами предыдущего годичного этапа работы по проекту, согласно которым инициатор количественно включается в состав полимера. Повышение содержания ПГО в составе реакционной смеси приводило к пропорциональному увеличению его содержания в составе продукта по данным 1Н ЯМР. Однако содержание ПГО в составе сополимера было заметно ниже его содержания в составе реакционной смеси, поскольку полимеризацию останавливали при конверсии порядка 60%, чтобы избежать процессов сшивания цепей и других побочных процессов, которые происходят при предельных конверсиях. Повышение содержания ПГО от 50% до 64% (мас.) в полимеризационной смеси привело к ничтожному сдвигу молекулярно-массового распределения в сторону больших масс (Рис. 10, кривые зеленая и синяя). При этом среднечисловая и средневесовая молекулярные массы практически не поменялиь (Таблица 1). Можно полагать, что переэтерификацимя, сопровождающая полимеризацию ПГО с раскрытием цикла, не только уширяет молекулярно-массовое распределение, но и нивелирует различия в массахгидрофобного блока. При этом можно полагать, что следствием переэтерификации также является появление трехблочных полимеров с высокой массой, имеющих два полиэтиленоксидных блока на концах блока поли-ПГО. В отчете за предыдущий год мы показали, что поли-ПГО осаждается из раствора в ТГФ при значительно меньшей концентрации дибутилового эфира, чем свободный ПЭГ. При этом увеличение степени полимеризации блока поли-ПГО уменьшает пороговую концентрацию дибутилового эфира. Практически те же закономерности наблюдаются и для диэтилового эфира. Поэтому мы исследовали осаждение блок-сополимеров диэтиловым эфиром. Как показано на Рис. 11, осаждение диэтиловым эфиром приводит к освобождению блок-сополимера от низкомолекулярных примесей. Осадок, собранный после обработки раствора блок-сополимера в ТГФ 60% диэтилового эфира, в значительно степени освобождается от олигомеров и существенно обогащается высокомолекулярной фракцией. В дальнейшем мы использовали в работе фракционированные образцы блок-сополимеров. 4. Исследование влияния состава блок-сополимеров ПГО и этиленоксида на размеры мицелл Известно, что как правило, увеличение доли гидрофобного блока в составе сополимеров приводит к увеличению размера мицелл, и даже способствует изменению их формы от сферических мицелл к цилиндрическим мицеллам, везикулам и наночастицам, как это было продемонстрировано нами ранее на примере блок-сополимеров тирозина и этиленоксида [10]. Поскольку гидрофобность звена полиПГО значительно меньше гидрофобности тирозина, очевидно, что изменение размеров частиц с ростом гидрофобности должны быть менее резкие. Дисперсии в воде готовили методом нанопереципитации, позволяющем быстро готовить дисперсию в воде, и позволяющим фиксировать момент контакта полимера с водным раствором. Для получения дисперсии полимер растворяли в тетрагидрофуране в концентрации 50 мг/мл, после чего при интенсивном перемешивании разбавляли в 3 раза водным буфером, после чего разбавляли еще в 3.3, 8.25 или 16.7 раз до конечной концентрации 5, 2 или 1 мг/мл. Все эксперимента проводили при физиологической температуре (37 оС), ионной силе и рН (0.15 М NaCl, 10 mM Na2HPO4, pH 7.4). Оказалось, что сополимеры, содержащие 14 и 28 звеньев ПГО, образовывали в воде ассоциаты с размером около 100 нм. Существенного количества ассоциатов в растворах более короткого сополимера практически не было. При этом в обоих случаях наблюдалось очень широкое распределение частиц по размерам, объясняющееся значительной дисперсностью полимера. Размеры мицелл блок-сополимеров mPEG-ПГО примерно в 2-3 раза больше размеров мицелл сополимеров ПЭГ и молочной кислоты. Можно предположить, что это превышение связано с наличием примеси гомополимера в составе блок-сополимеров. Интенсивность светорассеяния и радиус частиц увеличивались по мере инкубации дисперсии блок-сополимера в воде. Мы предположили, что эти изменения связаны с гидролизом гидрофобного блока, сопровождающимся появлением гомополимера, ассоциирующего с образованием наночастиц. Чтобы исследовать кинетику распада бок-сополимера мы использовали методы потенциометрического титрования и светорассеяния. 5. Оценка эффективности блок-сополимеров этиленоксида и пропиленоксалата в качестве мицеллярных носителей доксорубицина и ароматических оксалатов. Сравнение с блок-сополимерами этиленоксида и полимолочной кислоты Для оценки эффективности мицелл блок-сополимеров mPEG-ПГО в качестве носителе для лекарственных соединений мы исследовали кинетику высвобождения доксорубицина из мицелл с помощью диализа. Для этого 50 мкМ растворы доксорубицина, не содержащие полимеров (1) и содержащие 1 мг/мл сополимеров mPEG-Р3 (2) или mPEG90-PLLA28 (3) помещали в диализные мешки и диализовали против буферного раствора, отбирая пробы через фиксирвоанные ромежутки времни. Оказалось, что блок-сополимер ПГО и mPEG90 практически не влиял на скорость высвобождения доксорубицина из диализного мешка. При этом такая же концентрация блок-сополимера полилактида и этиленоксида сходного состава заметно замедляла высвобождение доксорубицина, причем около 20% введенного антибиотика связывалось с мицеллами прочно и не выходило из мешка за время эксперимента. Полученный результат согласуется с достаточно низкой гидрофобностью ПГО. Мы предположили, что повышение гидрофобности солюбилизуемых соединений будет способствовать их солюбилизации в мицеллах блок-сополимеров mPEG-ПГО. Чтобы проверить это предположение мы исследовали мицеллы блок-сополимера mPEG-P3 в качестве среды для проведения пероксиоксалатной хемилюминесцентной реакции (ПО-реакции). В отчете за предыдущий годичный этап были подробно описаны особенности и механизм этой реакции. Важно упомянуть, что как активатор, так и оксалаты, принимающие участие в данной реакции, как правило, являются очень гидрофобными соединениями. Оказалось, что интегральная интенсивность света, испускаемого в ходе ПО-реакции в мицеллах mPEG-P3, была примерно в 6 раз меньше, чем при аналогичной реакции, проводимой в мицеллах mPEG90-PLLA28. (Рис. 14) Это еще раз согласуется с нашим выводом о невысокой гидрофобности мицелл PEG-P3. 6. Исследование скорости гидролиза гидрофобного блока сополимеров потенциометрическим методом, разработанным для регистрации скорости гидролиза полилактидов. Дисперсии блок-сополимеров для исследования стабильности в водной среде готовили методом нанопреципитации. Для этого раствор сополимера в ТГФ 50 мг/мл разбавляли в 3 раза буфером PBS, а затем разбавляли еще в 3.3. для получения раствора с концентрацией 5 мг/мл. При варьировании концентрации сополимера содержание ТГФ в конечном растворе поддерживали постоянным. Скорость гидролиза блока ПГО исследовали, регистрируя количество карбоксильных групп щавелевой кислоты, высвобождающихся из сополимера при инкубации его дисперсии в воде в присутствии физиологической концентрации соли (0.15 М KCl). Для этого использовали рН-стат (Radiometer, Copenhagen), регистрирующий объем добавляемой щелочи, необходимой для поддержания постоянного значения рН дисперсии. Поскольку стабильность оксалатов имеет отношение к их функционирвоанию в физиологических условиях, скорость гидролиза исследовали при 37 оС. Оказалось, что скорость гидролиза блок-сополимеров была чрезвычайно высока. Характерное время гидролиза полиоксалатного блока (т.е. время, соответствующее снижению концентрации сложноэфирных групп в е раз) составляло около 30 мин при рН 7.0, при рН 8.0 оно уменьшалось до 20 мин, а при рН 8.0 – увеличивалось до 60 мин. Вследствие экспериментальных особенностей метода мы не могли применять классические методы определения констант скорости первого порядка в полулогарифмических координатах, поскольку как начало эксперимента, так и уровень плато, соответствующий исчерпанию полиоксалата, не могли быть определены с высокой точностью. Поэтому для определения констант скорости первого порядка и\мы применили метод Гуггенгейма, заключающийся в разбиении кинетической кривой на n равных участков и представлении данных в виде зависимости прироста объема щелочи от времени реакции в полулогарифмических координатах. Угловой коэффициент этой зависимости дает константу скорости первого порядка. На основании этих измерений мы определил наблюдаемые константы скорости гидролиза первого порядка полиоксалатного блока. Оказалось, что логарифм константы скорости почти линейно увеличивается с ростом рН, что указывает на специфический основной механизм катализа данной реакции, типичный для реакций гидролиза сложных эфиров. При этом оказалось, что скорость гидролиза mPEG-P3 примерно в 20 раз превышает скорость гидролиза мономерного аналога – диэтилоксалата – в слабокислой среде. Данный результат вызывает удивление и не может быть объяснен ни концентрированием катализатора гидролиза в мицеллярных частицах, ни локальным повышением рН вблизи реакционных центров. Для того, чтобы независимо удостовериться в быстрой скорости гидролиза mPEG-P3 мы изучили изменения в мицеллах блок-сополимеров с помощью динамического и статического светорассеяния. Мы полагали, что потеря блок-сополимером полиэтиленоксидного блока должна приводить к выпадению гидрофобного блока полиПГО в осадок, что должно сопровождаться увеличением интенсивности рассеянного света и ростом размера коллоидных частиц. Исследование изменения интенсивности рассеянного света в дисперсии mPEG-P3 показало, что примерно через 40 минут начинается рост интенсивности, который развивается очень быстро и достигает максимума через 100 минут после начала эксперимента. Судя по данным потенциометрического титрования, этот максимум соответствует гидролизу 50% оксалатных групп. При этом размер частиц, определенный методом динамического светорассеяния, увеличивался с 40 нм до 220 нм и далее не менялся, красная кривая, левая ось ординат). Можно предположить, что это соответствует частичному гидролизу мицелл с образованием наночастиц, внутреннее ядро которых недоступно для воды и поэтому лишь незначительно подвергается гидролизу. Таким образом, изменения светорассеяния дисперсии mPEG-P3 подтвердило быстрый распад части гидрофобного блока сополимеров, причем оказалось, что в дисперсии часть сополимера превращается в наночастицы гомополимера, свободные от воды и гидролизующиеся гораздо медленнее. Эта доля, очевидно, уменьшается с ростом рН раствора. 7. Исследование стабильности ароматических оксалатов в мицеллах блок-сополимеров. В разделе 5 мы показали, что мицеллы блок-сополимеров пропиленоксалата и этиленоксида являются мало пригодны для солюбилизации соединений с низкой гидрофобностью и лабильных по отношению к воде. Поэтому в данном разделе мы сфокусировали свое внимание на мицеллах mPEG и молочной кислоты (mPEG-PLLA) и исследовали их влияние на гидролиз ароматических оксалатов, представляющих интерес для хемоиндуцированной фотодинамической терапии. Для исследования скорости гидролиза ароматических оксалатов в мицеллах mPEG-PLLA оксалат солюбилизовали в мицеллах, после чего инкубировали еих в течение фиксированного промежутка времени и содержание неизрасходованного оксалата определяли, проводя пероксиоксалатную хемилюминесцентную реакцию (ПО-реакцию) и регистрируя интегральную интенсивность света, выделившегося в ходе реакции. Кинетику ПО-реакции с участием БТЭЭ-оксалата в мицеллах mPEG87-PLLA61 характеризуется быстрым всплеском интенсивности, который также быстро гаснет и далее кривая проходит через второй максимум и медленно затухает. По мере инкубации мицеллярных нанореакторов, заполненных БТЭЭ-оксалатом, в первую очередь распадалась высокореакционноспособная фракция, и кривая выделения света приобретала классический вид с одним максимумом. Линеаризация кинетики гидролиза БТЭЭ-оксалата в полулогарифмических координатах показала наличие двух фракций, сильно различающихся по стабильности и гидролизующихся с эффективными константами скорости первого порядка (0.8 ± 0.1) × 10-3 с-1 и (0.16 ± 0.07) × 10-3 с-1. Содержание более стабильной фракции составляло около 0.44. Учитывая, что константа скорости гидролиза БТЭЭ-оксалата в гомогенном водно-органическом растворе составляет около 0.06 с-1, стабилизация БТЭЭ-оксалата по отношению к гидролизу составляет около 400 раз за счет солюбилизации в мицеллах mPEG87-PLLA61. Скорость гидролиза оксалата определяли в независимых экспериментах по скорости образования кислоты с помощью pH-stat. Мицеллы с инкапсулированным оксалатом помещали в приборную ячейку, pH регулировали до 7,5 и регистрировали количество щелочи, израсходованной на нейтрализацию выделившейся кислоты, как функцию времени. Количество израсходованной щелочи использовали для расчета доли гидролизованного оксалата. Долю оставшегося оксалата определяли путем вычитания доли гидролизованного оксалата из единицы. Кинетика распада БТЭЭ-оксалата и CPPO удовлетворительно согласуется с данными по снижению интегральной интенсивности хемилюминесценции. Кроме того, наличие двух фракций инкапсулированного BTEE-ox, различающихся по устойчивости к гидролизу, подтверждается непрерывной регистрацией гидролиза с помощью pH-стата. Мицеллы с инкапсулированным оксалатом помещали в приборную ячейку, эксперимент проводили при значении рН = 7.5, которое поддерживалось постоянным в ходе эксперимента, и регистрировали количество щелочи, пошедшей на нейтрализацию выделившейся кислоты в зависимости от времени. Количество израсходованной щелочи использовали для расчета доли гидролизованного оксалата. Долю оставшегося оксалата определяли путем вычитания доли гидролизованного оксалата из единицы. Кинетика распада БТЭЭ-оксалата и CPPO удовлетворительно согласуется с данными по снижению интегральной интенсивности хемилюминесценции, приведенными на. Кроме того, наличие двух фракций солюбилизованного БТЭЭ-оксалата, различающихся по устойчивости к гидролизу, подтверждается непрерывной регистрацией гидролиза с помощью pH-стата. Кинетика гидролиза, полученная потенциометрическим методом, описывается биэкспоненциальной функцией с почти одинаковым вкладом двух экспонент, что согласуется с данными, полученными при измерении остаточной интегральной интенсивности хемилюминесценции. 8. Влияние степени полимеризации гидрофобного блока на эффективность ПО-реакции в мицеллярных нанореакторах Изменение степени полимеризации полилактидного блока сильно повлияло на интенсивность хемилюминесценции БТЭЭ-оксалата, солюбилизованных в мицеллярных нанореакторах. (Рис. 21). Увеличение степени полимеризации блока PLLA в серии сополимеров при их постоянной молярной концентрации 0,75 ± 10-3 моль/л приводило к постепенному росту интегральной интенсивности хемилюминесценции в мицеллярной системе с БТЭЭ-оксалатом. По-видимому, это свидетельствует об увеличении эффективности солюбилизации субстрата в полимерных мицеллах с увеличением длины полилактидного блока. Интересно, что сополимеры с рацемическим гидрофобным блоком при аналогичной степени полимеризации лактида показали несколько меньшее сродство к БТЭЭ-оксалату. Учитывая, что блок-сополимеры mPEG-PLLA склонны к кристаллизации в твердом состоянии и даже в виде мицелл, можно предположить, что более упорядоченное ядро мицелл mPEG-PLLA блок-сополимеров с оптически чистым полилактидом в гидрофобном блоке обеспечивает более эффективное встраивание оксалатов в их структуру. Повышение эффективности ПО-реакции с увеличением объёма гидрофобной фазы в мицеллах блок-сополимеров указывает на то, что что солюбилизация оксалатов в мицеллах блок-сополимеров увеличивается с увеличением длины гидрофобного блока. Анализ растворов наиболее короткого сополимера mPEG87-PLLA14 (ω = 0.23, пустые мицеллы имели размер 30 нм) показал, что наличие двух типов мицелл со средними гидродинамическими диаметрами около 30 и 400 нм после закрузки мицелл БТЭЭ-оксалатом и периленом. Мы предположили, что что частицы с диаметром 400 нм отвечают агрегатам преципитата БТЭЭ-оксалата, что указывает на неполную солюбилизациюв мицеллах mPEG87-PLLA14. Напротив, размер мицелл наиболее длинного сополимера mPEG87-PLLA61 не менялся при солюбилизации такого же количества оксалата и перилена. Это указывает на то, что именно более полная солюбиоизация оксалата и перилена отвечает за постепенный рост эффективности ПО-реакции по мере увеличения длины гидрофобного блока сополимеров mPEG-PLLA. Резюмируя, можно сказать, что солюбилизация оксалатов в мицеллярных нанореакторах сильно замедляет гидролиз оксалатов и стадию циклизации ПО-реакции. Это может быть резулььтатом снижения локальных концентраций пероксида водорода и воды вблизи оксалатов, включенных в мицеллярные нанореакторы. 9. Изучение влияния полимерных мицелл, загруженных оксалатами и активатором (тетраметилгематопорфирином) на деление раковых клеток. Цитотоксичность нанореакторов, заполненных БТЭЭ-оксалатом, была исследована на клетках аденокарциномы молочной железы человека, которые демонстрируют устойчивость ко многим лекарственным препаратам и не поддаются лечению. Для этой линии клеток характерен измененный метаболизм кислорода, связанный с устойчивостью этих клеток к большинству химиотерапевтических препаратов [11]. Действие нанореакторов размером 50-200 нм на клетки основано на их поглощении клетками путем эндоцитоза. Для хемоиндуцированной фотодинамической терапии подходят активаторы, образующие долгоживущее триплетное возбужденное состояние, в котором они могут передавать энергию возбуждения растворенному в окружающей среде кислороду, то есть они должны проявлять свойства фотосенсибилизатора. В то же время они должны легко окисляться 1,2-диоксетандионами, то есть быть активаторами по механизму CIEEL. Этим требованиям отвечает тетраметилгематопорфиин (ТМГП) - фотосенсибилизатор на основе природного гематопорфирина, который способен генерировать высокотоксичный синглетный кислород при переходе в возбужденное состояние [12]. Поскольку эффект химиоиндуцированной ФДТ может наблюдаться только в случае незначительной токсичности нанореакторов, мы изучили собственную цитотоксичность сополимеров в условиях эксперимента. Мицеллярные дисперсии сополимеров были приготовлены путем 10-кратного разведения растворов сополимеров в ТГФ. Поэтому цитотоксичность сополимеров сравнивали с цитотоксичностью самого ТГФ. Видно, что выживаемость клеток NCI/ADR-Res резко снижается при концентрации ТГФ 5 %, при этом заметных отклонений от 100 % жизнеспособности при концентрациях ниже 3.5 % ТГФ не обнаружено. При исследовании цитотоксичности полимеров конечная концентрация THF в образцах с наибольшей концентрацией полимера составляла 5%. То есть в образце, разбавленном в два раза, токсичность ТГФ не должна была проявиться. Оказалось, что цитотоксичность блок-сополимеров, содержащих в гидрофобном блоке как поли-L-лактид, так и поли-D,L-лактид, не проявляется при разбавлении THF до концентрации ниже 3,5, что говорит о том, что блок-сополимеры на основе полимолочной кислоты не проявляют собственной цитотоксичности. Блок-сополимер полипропиленоксалата и ПЭГ также не проявлял токсичности вплоть до концентрации 6-7 мг/мл. Если БТЭЭ-оксалат загружали в мицеллярные нанореакторы в отсутствие фотосенсибилизатора TMГП, наблюдалось умеренное увеличение цитотоксичности, вызванное собственной цитотоксичностью БТЭЭ-оксалата. Очевидно, что эта цитотоксичность вызвана разобщением оксилительного фосфорилирования, вызываемого БТЭЭ, который может проявляться до тех пор, пока внутриклеточные эстеразы не расщепят сложноэфирную или амидную группу БТЭЭ. Преимущество БТЭЭ-оксалата перед трихлорфенил оксалатом или CPPO с большой вероятностью будет проявляться в экспериментах in vivo, когда введенный оксалат метаболизируется эстеразами ретикулоэндотелиальной системы. В отличие от оксалатов, содержащих сильнокислые фенолы, которые часто используются в системах для хемоиндуцированной ФДТ [13, 14] или диагностики [15, 16], БТЭЭ-оксалат образует не токсичный фенол, а тирозин, который не может разобщать окислительное фосфорилирование. Состав мицелл для тестирования на клетках соответствовал оптимальному составу, определенному в экспериментах по измерению интенсивности хемилюминесценции in vitro. Было обнаружено, что нанореакторы, содержащие оба компонента (БТЭЭ-оксалат и TMГП), индуцируют гибель клеток значительно сильнее, чем нанореакторы, содержащие только один из компонентов. Таким образом, нанореакторы, содержащие оба компонента ПО-реакции (БТЭЭ-оксалат и ТМГП), вызывали гибель половины клеток в культуре. Напротив, в отсутствие одного из них почти все клетки выживали. Например, смеси 0.73 мг/мл сополимера с 30 мкМ TMГП или 43 мкМ БТЭЭ-оксалата обеспечивали выживание 80 % опухолевых клеток, в то время как система, содержащая все три компонента, уничтожала почти 60 % клеток в культуре (Рис. 23б). Таким образом, в данной работе мы показали, что раковые клетки в культуре могут быть уничтожены с помощью хемоиндуцированной фотодинамической терапии. Полученные результаты доказывают, что в раковых клетках протекала ПО-реакция, когда TMHP и БТЭЭ-оксалат были солюбилизованы в мицеллах mPEG87-PLLA61. Поскольку в образец не добавляли эндогенную H2O2, БТЭЭ-оксалат взаимодействовал с эндогенной перекисью водорода, присутствующей в раковых клетках. Этот эффект достигался на клетках, устойчивых к терапии, благодаря наличию в них не только Р-гликопротеина, высвобождающего лекарство, но и повышенному содержанию глутатиона, который препятствует действию прооксидантов. Подобное воздействие на клетки с MDR-фенотипом ранее не наблюдалось и, насколько нам известно, впервые продемонстрировано в данной работе. Ранее было обнаружено, что полиоксалат, помещенный в диметилфталатные эмульсии, стабилизированные плюроником L64, ингибирует устойчивые раковые клетки в условиях окислительного стресса. [11] В настоящей работе мы увеличили терапевтическую активность нанореакторов и добились подавления раковых клеток без предварительной обработки клеток индукторами окислительного стресса за счет использования мицелл с псевдотвердым ядром. 10. Публикация 2 - статей по проекту. По результатам годичного этапа опубликовано 2 статьи. Всего по результатам проекта опубликовано 3 статьи. __________ 1. S. Kim, K. Seong, O. Kim, S. Kim, H. Seo, M. Lee, G. Khang, D. Lee, Polyoxalate Nanoparticles as a Biodegradable and Biocompatible Drug Delivery Vehicle, Biomacromolecules. 11 (2010) 555 – 560. 2. D. Hong, B. Song, H. Kim, J. Kwon, G. Khang, D. Lee, Biodegradable polyoxalate and copolyoxalate particles for drug-delivery applications, Ther. Deliv. 2 (2011) 1407 – 1417. 3. S. Blunden, T. Wallace, Tin in canned food: a review and understanding of occurrence and effect, Food Chem. Toxicol. 41 (2003) 1651 – 1662. 4. Itaya T., Iida T., Gomyo Y., Natsutani Y., Ohba M. (2002) Efficient Synthesis and Hydrolysis of Cyclic Oxalate Esters of Glycols. Chem. Pharm. Bull. 50, 346—353. 5. А. Ф. Алкснис и др. Полиэфиры щавелевой кислоты. Рига, «Знатне», 1975, с. 233. 6. J. Rumble CRC Handbook of Chemistry and Physics (101 ed.), 2020, Taylor & Francis Group.. 7. И.А. Семёнов, Д.Н. Ситников, А.А. Романовский, Б.А. Ульянов, Растворимость и равновесие в бинарных смесях метанола с н-пентаном, н-гексаном и н-гептаном. Химия и Химическая Технология, 2012, 55 (8), 39-42. 8. E. Bowden, METHYL OXALATE, Organic Syntheses, Coll. Vol. 2, p.414 (1943); Vol. 10, p.78 (1930). Checked by C. S. Marvel and A. T. Koide 9. H.P. Nissen, H.W. Kreysel, Analysis of phospholipids in human semen by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. 1983, 276, 29-35. 10. N.P. Iakimov, M.A. Zotkin, E.A. Dets, S.S. Abramchuk, A.M. Arutyunian, I.D. Grozdova, N.S. Melik-Nubarov, Evaluation of critical packing parameter in the series of polytyrosine-PEG amphiphilic copolymers. Colloid Polymer Sci. 2021, 299, 1543 - 1555. 11. Osbild S., Brault L., Battaglia E., Bagrel D. Resistance to cisplatin and adriamycin is associated with the inhibition of glutathione efflux in MCF-7-derived cells. Anticancer Res. 2006. 26. 5 A. 3595–3600. 12. Romanyuk A.V., Grozdova I.D., Ezhov A.A., Melik-Nubarov N.S. // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 1. P. 3410. doi: 10.1038/s41598-017-03527-w 13. Lee D., Khaja S., Velasquez-Castano J.C., Dasari M., Sun C., Petros J., Taylor W.R., Murthy N. // Nat. Mater. 2007. V. 6. № 10. P. 765. doi: 10.1038/nmat1983 14. Zhen X., Zhang C., Xie C., Miao Q., Lim K.L., Pu K. // ACS Nano. 2016. V. 10. № 6. P. 6400. doi: 10.1021/acsnano.6b02908 15. Lee Y.-D.D., Lim C.-K.K., Singh A., Koh J., Kim J., Kwon I.C., Kim S. // ACS Nano. 2012. V. 6. № 8. P. 6759. doi: 10.1021/nn3014905 16. Wu M., Cui M., Jiang A., Sun R., Liu M., Pang X., Wang H., Song B., He Y. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2023. V. 62. № 29. e202303997. doi: 10.1002/anie.202303997

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".