ИСТИНА

Основная задача, решаемая в данном проекте – выяснение роли четвертичной структуры в транспортной функции мPPp. Этот интегральный белок мембраны представляет собой димер идентичных субъединиц. Кинетические данные показывают, что функциональна лишь одна из субъединиц димера. Мы планируем проверить гипотезу, согласно которой, вторая субъединица выполняет функцию промежуточного аккумулятора энергии, выделяющейся при связывании и гидролизе высокоэнергетического субстрата ( пирофосфата) и используемой в дальнейшем для транспорта катиона. Развитием этой идеи будет унифицированный механизм транспорта Н+ и Na+ пирофосфатазой. Этот механизм, который мы называем «бильярдным» предполагает, что транспортная специфич ность определяется способностью переносч ика связать тот или иной катион на входе в проводящий канал. Триггером транспорта служит протон, образующийся из нуклеофильной воды на стадии гидролиза. За счет кулоновского взаимодействия он выталкивает катион (Н+ или Na+), связанный на входе, в протон-проводящий канал и занимает освободившееся место, но может быть вытеснен натрием до начала следующего каталитического цикла. Такой механизм тоже не был ранее описан для мембранных переносчиков.

The major problem addressed by this project consists in elucidation of the role of oligomeric structure in the transport function of the membrane pyrophosphate-dependent monovalent cation pump mPPp. This integral membrane protein is a homodimer, and earlier kinetic studies suggested that only one subunit is functional. We will test the hypothesis that the partner subunits act as a transient store of the energy released upon substrate binding and hydrolysis and subsequently used for the cation transport. A related problem is the transport mechanism and the way in which it is coupled to high-energy substrate hydrolysis. This idea will be extended to formulate a unified mechanism for Na+ and H+ transport. The mechanism, which we call “billiard-type” mechanism, presumes that transport specificity is determined by the ability to bind a particular cation at the entrance to the ion-conducting channel. The transport is triggered by the proton generated from the nucleophilic water molecule at the hydrolysis step. The proton pushes electrostatically the bound cation (H+ or Na+) into the ion-conducting channel and occupies the vacant place but can be displaced by the medium Na+ before the next catalytic cycle starts. Such a mechanism has not yet been described for any membrane transporter.

Научный коллектив имеет большой опыт работы в области энзимологии, мембранного транспорта, генной инженерии и микробиологии, в том числе с mPPp (мембранными пирофосфатазами); им накоплен значительный опыт в исследовании энергопреобразующих ферментов бактерий с использованием современных биохимических и биофизических методов и подходов. Из достижений прежних лет можно отметить открытие Na+-mPPp как нового типа натриевого насоса (Malinen et al., 2007) и нескольких подсемейств пирофосфат-зависимых переносчиков катионов/мембранных пирофосфатаз (Baykov et al., 2013), установление пути эволюции их катионной специфичности (Luoto et al., 2013) и обнаружена функциональная асимметрия в катализе (Anashkin et al., 2021a). Описан полный каталитический цикл у двух негомологичных нерегулируемых растворимых пирофосфатаз (из семейств I и II) и определены константы скорости всех элементарных стадий (Baykov et al., 2000) и структуры ключевых интермедиатов (Heikinheimo et al., 2001). В работах, посвященных Na+-транслоцирующей NADH:хинон-оксидоредуктазе, разработан метод выделения этого фермента из V. harveyi, обнаружено наличие в нем ковалентно присоединенного остатка FMN (Zhou et al., 1999), определена стехиометрия Na+/e- (Bogachev et al., 1997), методами ЭПР- и оптической спектроскопии с использованием техники быстрого смешивания идентифицирована стадия катализа, сопряженная с трансмембранной транслокацией иона натрия (Bogachev et al., 2001, Bogachev et al., 2009a). Полный оперон nqr из V. harveyi клонирован и гетерологически экспрессирован с хорошим выходом активного белка, который выделен в чистом виде с помощью аффинной хроматографии, налажен сайт-специфический мутагенез (Фадеева et al., 2008).