|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных |
||
Сочетание видоспецифичных и эволюционно консервативных механизмов морфогенеза в развитии морского гидроида Dynamena pumila: клеточный, субклеточный и молекулярно-генетический уровень.НИР
Species-specific and evolutionary conserved mechanisms of morphogenesis in the development of marine hydroid Dynamena pumila: cellular, subcellular and molecular-genetic approaches.
- Руководитель НИР: Кремнёв С.В.
- Ответственные исполнители: Ветрова А.А., Краус Ю.А., Купаева Д.М., Саидова А.А.
- Участники НИР: Краус Ю.А., Купаева Д.М., Саидова А.А., ШошинаО О.
- Подразделение: Кафедра эмбриологии
- Срок исполнения: 1 января 2017 г. - 31 декабря 2019 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 17-04-01988а
- Номер ЦИТИС: АААА-А17-117040710070-8
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Физиологические механизмы деятельности, развития и устойчивости организма человека и животных
- ПН России: Науки о жизни
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.21.17 Эмбриональное развитие
-
Ключевые слова:
клеточная форма, клеточные перегруппировки, установление орально-аборальной оси, морфогенез, dynamena pumila.
dynamena pumila, cell rearrangements, morphogenesis, cell shape, oral-aboral axis establishment -
Описание:
Морфогенез включает в себя динамическую реорганизацию форм клеток и тканей, функцией которого является формирование трехмерного строения тела. Исследования нашей группы направлены на изучение механизмов морфогенеза в развитии животных. Мы выявили механизмы клеточной динамики эмбриональных эпителиальных пластов в ответ на приложение механического стимула (Kremnyov et al., 2012), выяснили причины определения право-левой асимметрии тела личинок иглокожих (Tisler et al., 2016), выявили механизмы установления орально-аборальной оси книдарий (Kraus et al., 2014; Kraus et al., 2016) и описали молекулярные механизмы, способствующие повышенной миграционной активности клеток лимфомы (Moskalev et al., 2012). На данном этапе исследований мы решили перейти к изучению базовых морфогенетических процессов на клеточном и субклеточном уровнях. В качестве модельного объекта для нашей работы мы выбрали морской колониальный гидроид Dynamena pumila. D. pumila отличается от остальных гидроидов разнообразием и уникальностью клеточных процессов и свойств клеток, обеспечивающих морфогенез зародыша и отдельных частей взрослой колонии. В ходе проекта мы изучим механизмы клеточных перегруппировок, коллективной миграции клеток, изменения клеточной формы, локализованной пролиферации клеток. В ходе изучения клеточной подвижности будет исследована динамика актинового и тубулинового цитоскелета и белков, регулирующих его работу (немышечный миозин II, формины Dia2 и комплекс нуклеации актина Arp2/3). Кроме того, мы исследуем связь между особенностями клеточных процессов в разных регионах эмбриона и молекулярной предразметкой плана строения: будут охарактеризованы паттерны экспрессии генов, вовлеченных в регуляцию развития, таких как компоненты WNT-каскада и Brachyury. Упомянутые выше процессы будут исследованы методами классической эмбриологии, световой гистологии, растровой и трансмиссионной электронной микроскопии, конфокальной лазерной микроскопии и молекулярно-биологическими методами.
-
Планируемые результаты:
Исходя из поставленной цели нашего проекта, его основным результатом будет детальная характеристика особенностей клеточных процессов, обеспечивающих морфогенез в развитии эмбрионов и структур колонии D. pumila. К таким процессам относятся: клеточная миграция и агрегация, изменения форм клеток, дифференциального отложения внеклеточного матрикса и локализованные клеточные деления. К окончанию проекта будут опубликованы 3 статьи в международных реферируемых журналах. Промежуточные результаты проекта будут соответствовать поставленным задачам. 1) Будут созданы таблицы нормального развития D. pumila. 2) На клеточном и субклеточном уровне будут изучены морфогенетические механизмы гаструляции, формирования О-А оси тела, распластывания и реагрегации эмбриона на субстрате при культивации in vitro, а также морфогенетические механизмы формирования заякоривающего диска столона D. pumila. 3) При помощи ингибиторного анализа будут исследованы механизмы клеточной миграции при распластывании эмбриона, культивируемого на субстрате in vitro. Комбинацией разных ингибиторов будут выявлены, вовлеченные в этот процесс механизмы сборки и динамики актинового и тубулинового цитоскелета и актомиозинового сокращения. 4) При помощи ингибиторного анализа будет исследована вовлеченность WNT-канонического пути в установлении О-А оси. Данные исследования будут сделаны как на эмбрионах, развивающихся in vivo, так и на распластывающихся эмбрионах, культивируемых in vitro. Для активации канонического WNT сигнального пути будет использован азакенпаулон. 5) Будут охарактеризованы особенности паттернов экспрессии ортологов генов Wnt3 и Brachyury, которые у изученных книдарий являются маркерами О-А оси и зародышевых листков, а также участвуют в регуляции морфогенетических процессов. Данные исследования будут проведены на эмбрионах при нормальном развитии и на распластывающихся эмбрионах, культивируемых in vitro. 6) На основании результатов проведенного исследования будут выявлены как общие для всех изученных книдарий, так и видоспецифические особенности раннего развития D. pumila.
- Добавил в систему: Кремнёв Станислав Валерьевич
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Сочетание видоспецифичных и эволюционно консервативных механизмов морфогенеза в развитии морского гидроида Dynamena pumila: клеточный, субклеточный и молекулярно-генетический уровень. |
| Результаты этапа: В процессе выполнения проекта был собран и проанализирован материал для исследования клеточных механизмов процессов эмбрионального развития Dynamena pumila и некоторых элементов её колонии. Нами были составлены предварительные таблицы нормального развития Dynamena. При исследовании эмбрионального развития нам удалось собрать все стадии зародышевого материала и начать подробный анализ следующими методами: растровой и трансмиссионной электронной микроскопии, лазерной конфокальной микроспории и молекулярно-биологическими методами. Нами были оптимизированы все запланированные методики необходимые для работы с нашим модельным объектом. Микроскопическими исследованиями было показано, что, вероятно, преобладающим механизмом гаструляции, является деламинация, с элементами иммиграции. Так же предполагается наличие дополнительного механизма гаструляции как массового погружения поверхностных клеток. Исследования О-А полярности методом гибридизации ин ситу по выявлению локализации экспрессии гена-маркера орального полюса Wnt3 показали, что становление оси в развитии Dynamena происходит достаточно поздно: к стадии поздней гаструлы, в отличие от исследованных на сегодняшний день гидроидов, у которых полярность уже устанавливается на стадии ооцита. Фармакологические эксперименты по модуляции активности канонического WNT каскада показали, что данный сигнальный путь играет ключевое значение в определении О-A оси в период эмбрионального развития, и также участвует в определении плана строения колонии при изменении его активности во время метаморфоза. При активации WNT канонического каскада после начала метаморфоза изменяется план организации колонии: вместо колонии с моноподиальным ветвлением, колония Dynamena приобретает тип стелящейся колонии. При этом полностью блокируется дифференцировка верхушки роста побега и активируются процессы дифференцировки верхушки роста столона. Были поставлены первые исследования по описанию и выявлению природы повышенной адгезионной активности клеток эмбриона на стадии гаструлы. Мы использовали разные субстраты для культивирования эмбрионов Dynamena in vitro чтобы выяснить является ли клеточная адгезия специфичной. Мы показали, что наибольшей адгезией клетки эмбриона обладают к фибронектиновому матриксу, что говорит о центральной роли интегриновых контактов. В пользу этих данных говорят также наши результаты по фармакологической модуляции компонентов цитоскелета. Исследованы клеточные механизмы эпителиального морфогенеза заякоривающего диска колонии Dynamena. Подробно описаны все стадии формирования эпителиальной складки, проведены морфометрические исследования изменений форм клеток сопровождающих этот процесс, изучена ультраструктура клеток вовлеченных в процесс изгибания эпителиального пласта, а также роль хитинового внеклеточного вещества. При помощи метки EdU, прослежена динамика пролиферации клеток сопровождающая морфогенез эпителиального пласта. По этим данным подготовлена и отправлена в редакцию журнала Byosystems статья. При сотрудничестве с коллегами с кафедры эволюционной биологии МГУ нам удалось секвенировать и успешно собрать эмбриональный транскриптом Dynamena pumila. Данные, полученные в ходе исследования, позволят нам более свободно применять молекулярно-биологические методики при работе с нашим объектом. Таким образом, все запланированные работы были выполнены в полном объеме и более того, существенно расширены. | ||
| 2 | 1 января 2018 г.-15 декабря 2018 г. | Сочетание видоспецифичных и эволюционно консервативных механизмов морфогенеза в развитии морского гидроида Dynamena pumila: клеточный, субклеточный и молекулярно-генетический уровень. |
| Результаты этапа: В ходе выполнения проекта были получены следующие результаты: 1) Были получены расширенные данные в результате дополнительных ультраструктурных исследований эмбрионального развития D. pumila. Подробно описаны динамика возникновения и разнообразие клеточных контактов в развитии D. pumila. 2) Были проведены дополнительные фармакологические эксперименты по исследованию вовлеченности WNT-канонического пути в становлении первичной О-А оси путем активации wnt-канонического каскада азакенпаулоном и BIO и его подавлению iCTR14. 3) Были получены данные о специфичности и активности используемых ингибиторов (Азакенпаулон, BIO и iCTR14) на нашем модельном объекте по изменению экспрессии генов-мишеней wnt канонического каскада. 4) Были получены подробные данные о пространственной динамики экспрессии генов-маркеров О-А полярности (Wnt3 и Frizzled3) в развитии D. pumila, методом гибридизации in situ. 5) Были клонированы участки генов трех идентифицированных у D. pumila генов Brachyury. 6) Был отработан метод двойной гибридизации in situ на эмбрионах D. pumila. 7) Были проведены фармакологические эксперименты по исследованию вовлеченности wnt-канонического пути в регуляцию становления плана строения колонии гидроидных полипов путем активации WNT-канонического каскада азакенпаулоном и BIO и его подавлению iCTR14. 8) Был исследован паттерн экспрессии генов, компонентов wnt канонического сигнального пути при формировании верхушки роста побега колонии: TCF, Brachyury1 и β-катенин. 9) Была протестирована роль актомиозинового комплекса в регуляции формирования клеточных ламелл при помощи следующих ингибиторов: латранкулин (деполимеризация микрофиламентов), блеббистатин (селективный ингибитор немышечного миозина II) и ML-7 (селективный ингибитор киназы легких цепей миозина). 10) Были клонированы участки нуклеотидных последовательностей выявленных субъединиц интегриновых рецепторов: четыре α-субъединицы интегриновых рецепторов и четыре β-субъединицы. 11) Была подготовлена к публикации статья по участию Wnt канонического каскада в определении плана строения колонии Dynamena pumila. | ||
| 3 | 1 января 2019 г.-15 декабря 2019 г. | Сочетание видоспецифичных и эволюционно консервативных механизмов морфогенеза в развитии морского гидроида Dynamena pumila: клеточный, субклеточный и молекулярно-генетический уровень. |
| Результаты этапа: В ходе выполнения проекта были получены следующие результаты: 1) Были получены расширенные данные об ультраструктуре клеточных механизмов морфогенеза эмбрионального развития D. pumila. Была подробно описана морфология клеток в центре эпителиальных торов и динамика формирования межклеточных контактов в этой области. Также на ультраструктурном уровне были охарактеризованы стадии формирования и заживления последнего эпителиального тора методами электронной растровой и трансмиссионной микроскопии. 2) Были продолжены исследования динамики экспрессии генов-маркеров О-А полярности на разных стадиях развития D. pumila методом гибридизации in situ. Была проведена одновременная визуализация паттернов экспрессии Wnt3 и Frizzled3 на последовательных стадиях развития Dynamena: от раннего дробления до планулы. 3) Были продолжены работы по выявлению роли канонического Wnt каскада в становлении орально-аборальной оси тела. Были получены данные об изменении пространственного паттерна экспрессии генов-маркеров орально-аборальной оси методом гибридизации in situ в ответ на изменение активности канонического Wnt каскада. Были исследованы гены Wnt3, TCF и Frizzled3. 4) Была сделана попытка подобрать протокол окраски специфическими антителами β-catenin на последовательных стадиях эмбрионального развития и во время морфогенеза верхушки роста побега колонии Dynamena. 5) Методом гибридизации in situ был исследован паттерн экспрессии генов, компонентов Wnt канонического сигнального пути при трансдифференцировке верхушки роста побега в верхушку роста столона колонии Dynamena после временного подавления активности Wnt каскада. 6) Для получения достоверных данных было увеличено количество экспериментальных повторностей по ингибиторному анализу механизмов клеточной миграции при распластывании эмбрионов в условиях культивирования in vitro. 7) Была выявлена локализация фосфорилированного myosin-II, α-catenin и vinculin в клетках распластывающихся эмбрионов, культивируемых in vitro. 8) Методом гибридизации in situ были визуализированы паттерны экспрессии субъединиц интегриновых рецепторов во время раннего развития Dyanmena: четыре α-субъединицы интегриновых рецепторов и четыре β-субъединицы. 9) Была подготовлена к публикации, статья по механизмам нормального эмбрионального развития Dynamena pumila. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".